王惠君　王文泉　和麗崗　賀軍軍

摘要：利用橡膠樹(shù)GT1與IAN873雜交組合183株實(shí)生苗的F1代群體作為構(gòu)圖群體，利用SSR、SRAP、AFLP等3種分子標(biāo)記對(duì)該群體進(jìn)行遺傳連鎖分析，構(gòu)建1張包括18個(gè)連鎖群、372個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)的橡膠樹(shù)分子遺傳連鎖圖（LOD≥3），其中包括19個(gè)SSR標(biāo)記、73個(gè)SRAP標(biāo)記、280個(gè)AFLP標(biāo)記，連鎖圖譜的總圖距覆蓋1 735.9 cM，所有標(biāo)記間的平均圖距為5.22 cM。在此連鎖圖譜上的標(biāo)記區(qū)間為[8，46]，所有連鎖群長(zhǎng)度區(qū)間為[55.3 cM，134.7 cM]。LG9連鎖群包含標(biāo)記最少為8個(gè)；LG1連鎖群包含標(biāo)記最多為46個(gè)；LG1的平均圖距最小為2.80 cM；LG17的平均圖距最大為7.92 cM。總圖譜中存在圖距大于20 cM的空隙為5個(gè)。

關(guān)鍵詞：橡膠樹(shù)；分子標(biāo)記；遺傳連鎖圖譜

中圖分類號(hào)：S794.101 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2015）07-0041-05

收稿日期：2015-01-04

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金 （編號(hào)：31261140363、31000537、31171230）；中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)（編號(hào)：ITBBZX0843）；國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃（編號(hào)：2010CB126601）。

作者簡(jiǎn)介：王惠君（1981—），男，山西原平人，碩士，助理研究員，從事生物多樣性研究。E-mail：382494058@qq.com。

通信作者：王文泉，博士，研究員，博士生導(dǎo)師，從事熱帶生物資源、熱帶經(jīng)濟(jì)作物結(jié)構(gòu)基因組學(xué)與分子育種及熱帶珍稀瀕危野生植物的保護(hù)生物學(xué)研究。E-mail：wquanw@hainan.net。

橡膠樹(shù)（Heva brasiliensis）屬大戟科橡膠樹(shù)屬植物[1]，原產(chǎn)于南美洲亞馬遜河流域。具有高彈性及耐高溫等特性的天然橡膠是合成橡膠不可替代的材料，也是重要的戰(zhàn)略物資、工業(yè)原料。雖然分子標(biāo)記技術(shù)在橡膠樹(shù)研究方面已取得了一定進(jìn)展，但關(guān)于橡膠樹(shù)分子生物學(xué)研究還很欠缺。Lespinasse等以橡膠樹(shù)雜交組合（PB260×RO38 106） F1代群體為材料，構(gòu)建了第1張總圖距為2 144 cM及標(biāo)記間平均圖距為3 cM的橡膠樹(shù)遺傳圖譜，包含18個(gè)連鎖群，由301個(gè)RFLP標(biāo)記、388個(gè)AFLP標(biāo)記、18個(gè)SSR標(biāo)記、10個(gè)同工酶標(biāo)記組成[2]。和麗崗利用雜交組合（IAN873×GT1）的195個(gè) F1代群體構(gòu)建了總圖距為1 455.57 cM及標(biāo)記間平均距離為 558 cM 的AFLP連鎖遺傳圖，包含18個(gè)連鎖群，由261個(gè)AFLP標(biāo)記組成[3]。馮素萍等以雜交組合（IAN873×熱研88-13）的94個(gè)F1代群體構(gòu)建了總圖距為1 937.06 cM及標(biāo)記間平均距離21.29 cM的連鎖群，包含18個(gè)連鎖群，由91個(gè)SSR標(biāo)記組成[4]。王惠君利用雜交組合（IAN873×GT1）的F1代群體構(gòu)建了總圖距為774 cM及標(biāo)記間平均距離為11.38cM的連鎖遺傳圖，該圖包括18個(gè)連鎖群，由7個(gè)SSR標(biāo)記、61個(gè)SRAP標(biāo)記組成[5]。Triwitayakorn等用EST-SSR分子標(biāo)記構(gòu)建了總圖距為842.9 cM且包含23個(gè)連鎖群的橡膠樹(shù)連鎖遺傳圖[6]。以上遺傳圖譜為進(jìn)一步分析橡膠樹(shù)重要性狀的QTL定位及分子標(biāo)記輔助選擇育種奠定了基礎(chǔ)。本試驗(yàn)應(yīng)用SSR、SRAP、AFLP等3種分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)橡膠樹(shù)雜交組合（IAN873×GT1）的195株實(shí)生苗的F1代群體構(gòu)建高密度的橡膠遺傳連鎖圖譜，旨在為開(kāi)發(fā)利用橡膠樹(shù)資源提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 作圖群體的構(gòu)建

GT1：天然橡膠生產(chǎn)國(guó)主要栽培品種的魏克漢種質(zhì)，具有抗寒、中產(chǎn)、抗旱特點(diǎn)。IAN873：抗南美葉疫病無(wú)性系品種的非魏克漢種質(zhì)，抗寒但不抗風(fēng)，生長(zhǎng)量、產(chǎn)量比GT1高。以云南省熱帶作物研究所提供的利用非近交親本橡膠樹(shù)雜交組合（IAN873×GT1）得到的183個(gè)F1代群體作為構(gòu)圖群體。

1.2 基因組DNA的提取

以橡膠樹(shù)嫩葉片作為材料，選用改良CTAB法[7]提取橡膠樹(shù)基因組DNA。改良提取緩沖液的組成為：Tris/HCl（pH值8.0）100 mmol/L，EDTA（pH值8.0）60 mmol/L，NaCl 1.4 mol/L，CTAB 2%。用瓊脂糖凝膠1.5%電泳分析檢測(cè)提取的DNA；用紫外分光光度計(jì)法檢測(cè)其濃度、純度。

1.3 SSR分析

參照網(wǎng)站公布的信息進(jìn)行SSR引物的合成。SSR擴(kuò)增反應(yīng)參照馮素萍等的方法[4]，采用25 μL體系并且在ABI-PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性 5 min；94 ℃ 變性1 min，60 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸1 min，34個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

1.4 SRAP分析

設(shè)計(jì)SRAP引物序列[8]，所用引物由上海生物工程技術(shù)有限公司提供，其中F-primer合成32條，R-primer 合成21條。依據(jù)薛丹丹等報(bào)道[9]，設(shè)定的原初20 μL反應(yīng)體系優(yōu)化后為DNA模板50 ng、10×PCR buffer （Mg2+） 2.0 μL、dNTPs（20 mmol/L） 0.4 μL、F-primer（50 ng/μL）0.6 μL、R-primer（50 ng/μL）0.6μL、Taq（5 U/μL）0.4 μL、ddH2O 15.0 μL。參照Li等的PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，35 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，5個(gè)循環(huán)；隨后將退火溫度升至51 ℃，34個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸9 min，4 ℃下保存。使用瓊脂糖凝膠1.0%電泳對(duì)此PCR擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。

1.5 AFLP分析

參照王惠君等的方法[10]，限制性內(nèi)切酶采用經(jīng)典的EcoRⅠ、MseⅠ組合。酶切程序和DNA片段與接頭的連接同時(shí)進(jìn)行。每個(gè)DNA樣品酶切連接反應(yīng)，反應(yīng)體系20 μL：DNA 500 ng，T4連接酶緩沖液2 μL，ATP 1.25 μL，MseⅠ、EcoRⅠ接頭分別1 μL，EcoRⅠ和MseⅠ0.3 μL，T4連接酶 0.6 μL；設(shè)定的反應(yīng)程序?yàn)?7 ℃ 380 min、16 ℃ 380 min。酶切鏈接的產(chǎn)物稀釋后才可以使用，選擇濃度稀釋到原液的 1/3 進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)。預(yù)擴(kuò)增體系20 μL：取酶切連接稀釋后DNA 產(chǎn)物 5 μL，緩沖液 2 μL，MSeⅠ引物 （M00） 和EcoRⅠ引物（E00）各0.6 μL（其中Primer E00：5′-GACTGCGTACCAATT CA-3′、Primer M00：5′-GATGAGTCCTGAG TAAC-3′）dNTPs 0.4 μL，Taq酶0.12 μL。參數(shù)設(shè)置為：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 40 s，72 ℃ 80 s，31個(gè)循環(huán)；最后72 ℃ 5 min。預(yù)擴(kuò)增引物后再增加2個(gè)堿基作為選擇性擴(kuò)增引物，進(jìn)入選擇性擴(kuò)增階段，用8對(duì)EcoRⅠ、MseⅠ引物進(jìn)行組合，即64個(gè)引物組合。參數(shù)設(shè)置為：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，65 ℃ 40 s（-1 ℃/循環(huán)），72 ℃ 80 s，12個(gè)循環(huán)（梯度PCR）；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 75 s，22個(gè)循環(huán)；最后72 ℃ 5 min。擴(kuò)增反應(yīng)均在BIOMITRA-T1熱循環(huán)儀上進(jìn)行。

1.6 數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換及作圖軟件應(yīng)用

記錄的分離譜帶是由作圖的F1群體親本譜帶所決定的，SRAP標(biāo)記、大多數(shù)的AFLP標(biāo)記屬于顯性標(biāo)記，母本、父本有的譜帶記錄為1，無(wú)譜帶記錄為0；SSR標(biāo)記和少數(shù)的AFLP標(biāo)記屬于共顯性標(biāo)記，記錄譜帶時(shí)只要與父本譜帶一致的記錄為A，與母本譜帶一致的記錄為B，如果是雜合的記錄為H；此外不管顯性標(biāo)記還是共顯性標(biāo)記，只要譜帶缺失或者模糊的均記為“-”；估計(jì)多態(tài)性譜帶的分子量大小是依據(jù)與標(biāo)準(zhǔn)分子量 DL2 000 標(biāo)準(zhǔn)帶型的相對(duì)位置。對(duì)于一些引物，假如1對(duì)引物同時(shí)可以檢測(cè)到幾個(gè)位點(diǎn)，依據(jù)擴(kuò)增出分子量大小排序，按從大到小的原則標(biāo)記。在其所用引物后加“-1、-2、-3”和“-a、-b、-c”符號(hào)進(jìn)行區(qū)別標(biāo)記。作圖之前，按照J(rèn)oinMap3.0要求的數(shù)據(jù)格式將A、B、H或者0、1轉(zhuǎn)換成原始矩陣所要求的數(shù)據(jù)格式a、c；不同水平偏分離的標(biāo)記在其后面用“*”表示；輸入所需數(shù)據(jù)后，用LOD groupings進(jìn)行計(jì)算并獲得連鎖群，輸出遺傳連鎖圖譜[11-12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 篩選引物及多態(tài)性標(biāo)記

利用SSR、SRAP、AFLP等3種分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)橡膠樹(shù)進(jìn)行遺傳圖譜構(gòu)建。選擇來(lái)自NCBI的30對(duì)SSR引物分別進(jìn)行多態(tài)性篩選，對(duì)2個(gè)親本進(jìn)行篩選，其中有13對(duì)引物多態(tài)性豐富且譜帶穩(wěn)定。從13對(duì)引物中擴(kuò)增出37條帶，其中35條為多態(tài)性帶，多態(tài)性比率高達(dá)94.59%。在顯著水平（5%）上共發(fā)現(xiàn)18個(gè)標(biāo)記表現(xiàn)為偏分離，比率達(dá)51.43%。對(duì)96對(duì)引物組合雙親進(jìn)行SRAP篩選分析，從中篩選出20個(gè)擴(kuò)增比較好且存在明顯多態(tài)性引物的組合，共獲得166條帶，經(jīng)過(guò)分析，其中有113條為多態(tài)性譜帶，多態(tài)性比率為68.07%，SRAP多態(tài)性、重復(fù)性較好。在顯著水平（5%）上發(fā)現(xiàn)共有51個(gè)標(biāo)記表現(xiàn)為偏分離，頻率達(dá)45.13%。用64對(duì)AFLP組合引物雙親本進(jìn)行篩選分析，從中篩選出具有明顯多態(tài)性的標(biāo)記13對(duì)?？偣搏@得675個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，對(duì)這些遺傳位點(diǎn)的標(biāo)記分離比進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，剔除不用于作圖的異常分離標(biāo)165個(gè)，在顯著水平（5%）上發(fā)現(xiàn)198個(gè)標(biāo)記表現(xiàn)為偏分離。其中符合作圖要求的以3 ∶1分離模式比例的標(biāo)記共有162個(gè)，符合1 ∶1分離模式比例的標(biāo)記共有150個(gè)（表1）。

2.2 分子標(biāo)記分離分析及遺傳圖譜的構(gòu)建

利用JoinMap3.0對(duì)823個(gè)多態(tài)性標(biāo)記進(jìn)行遺傳連鎖分析作圖，在LOD≥3條件下獲得包含372個(gè)標(biāo)記（其中SSR標(biāo)記19個(gè)，SRAP標(biāo)記73個(gè)，AFLP標(biāo)記280個(gè)）、18個(gè)連鎖群的橡膠樹(shù)遺傳圖譜（圖1），連鎖群數(shù)目與橡膠樹(shù)18對(duì)染色體數(shù)目相一致。其中SSR、SRAP及AFLP標(biāo)記的比例分別為5.1%、19.3%、75.3%。獲得最終的遺傳連鎖圖譜覆蓋總長(zhǎng)度為1 735.9 cM，標(biāo)記間的平均圖距為 5.22 cM。連鎖群上的標(biāo)記數(shù)區(qū)間范圍為[4，46]，連鎖群的長(zhǎng)度區(qū)間范圍為[55.3 cM，134.7cM]，群內(nèi)平均圖距區(qū)間[127 cM ，17.02 cM]（表2）。用于連鎖分析的823個(gè)標(biāo)記當(dāng)中，首先剔除掉異常分離標(biāo)165個(gè)AFLP標(biāo)記，其中286個(gè)標(biāo)記未構(gòu)建入連鎖群，占34.75%，286個(gè)標(biāo)記中包括230個(gè)AFLP標(biāo)記、40個(gè)SRAP標(biāo)記、16個(gè)SSR標(biāo)記。構(gòu)建的18個(gè)連鎖群中，LG9包含標(biāo)記數(shù)最少，為8個(gè)；LG1包含的標(biāo)記數(shù)最多，達(dá)46個(gè)。整個(gè)遺傳連鎖圖譜最小圖距為0.5 cM，在LG1上，最大圖距為25.2 cM，在LG11上；平均圖距最小為 280 cM，分布在LG1上；平均圖距最大為7.92 cM，分布在LG17上；遺傳圖譜包含5個(gè)空隙（≥20 cM），LG11上2個(gè)，LG15、LG17、LG18各1個(gè)。

2.3 偏分離分析

構(gòu)建的橡膠樹(shù)遺傳連鎖圖上包含372個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)，其中5%水平上包含47個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)不能滿足孟德?tīng)柗蛛x比，其偏分離水平表現(xiàn)顯著的標(biāo)記占總標(biāo)記的12.63%；在1%水平上包含119個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)不能滿足孟德?tīng)柗蛛x比，其偏分離水平表現(xiàn)極顯著的標(biāo)記占總標(biāo)記的 32.00%。連鎖群上偏分離標(biāo)記占總標(biāo)記的44.62%。從偏分離位點(diǎn)的分布來(lái)看，每個(gè)連鎖群上均有分布。其中 LG1上偏分離標(biāo)記個(gè)數(shù)最多為23個(gè)，占LG1總標(biāo)記數(shù)的50.00%；LG11、LG16上的偏分離標(biāo)記個(gè)數(shù)最少，都為1個(gè)，分別占LG11、LG16的8.33%、11.11%，同時(shí)LG16上的偏分離標(biāo)記在所有連鎖群中所占比例也是最少的；LG9上的偏分離標(biāo)記在所有連鎖群中所占比例最多，為7500%；其中 LG7、LG10上的偏分離標(biāo)記分布與其他連鎖群相比較聚集。其他大部分偏分離位點(diǎn)在連鎖群上分布比較均勻。

3 結(jié)論與討論

3.1 SSR、SRAP及AFLP作圖分析

本研究主要利用SSR、SRAP及AFLP等3種分子標(biāo)記進(jìn)行遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建，結(jié)果顯示，AFLP標(biāo)記在遺傳圖譜作圖中所占比例最多，雖然此種標(biāo)記的信息量非常豐富，但是試驗(yàn)程序要求精度高并相對(duì)繁瑣，同時(shí)聚集現(xiàn)象頻繁導(dǎo)致在所繪制連鎖群上出現(xiàn)較多大的空隙。SSR 標(biāo)記雖然揭示的多態(tài)性較豐富、可信度、重復(fù)率較高，但開(kāi)發(fā)引物費(fèi)用較高，因此開(kāi)發(fā)的SSR標(biāo)記不多。SRAP分子標(biāo)記試驗(yàn)操作容易、結(jié)果穩(wěn)定、擴(kuò)增條帶清晰，較容易進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，并且過(guò)程簡(jiǎn)單，重復(fù)

性好。開(kāi)發(fā)的SRAP引物中包含CCGG、AATT的核心序列，保證擴(kuò)增反應(yīng)是針對(duì)基因組的開(kāi)放閱讀框區(qū)域。此種特殊性增強(qiáng)了擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)果與表型的相關(guān)性，同時(shí)可以更多地揭示所選材料表型差異性。因此，適用于較高密度遺傳圖譜的構(gòu)建。

3.2 作圖群體及圖譜構(gòu)建分析

橡膠樹(shù)為大戟科橡膠樹(shù)屬植物，屬于高度雜合的高大喬木，異花授粉，世代周期較長(zhǎng)，基因組龐大，遺傳背景相關(guān)材料較少，因而很難得到像其他農(nóng)作物一樣的重組近交系作為遺傳作圖，這給橡膠樹(shù)遺傳圖譜構(gòu)建帶來(lái)一定困難。大部分林木具有無(wú)性繁殖特性，這個(gè)特點(diǎn)對(duì)保存作圖群體較為有利，作圖群體建立后就可以永久性保存，同時(shí)還可以反復(fù)測(cè)定性狀。以大多數(shù)林木的重要經(jīng)濟(jì)性狀作為數(shù)量性狀，憑借這一特性進(jìn)行QTL（數(shù)量性狀位點(diǎn)）定位分析較為容易，從而可以建立或選擇1個(gè)較為理想的分離群體作為構(gòu)建遺傳圖譜的首要條件。目前林木遺傳作圖群體較為常用的方法主要有半同胞作圖群體、全同胞交配群體、單倍體作圖群體（針葉樹(shù)）、F1作圖群體、F2群體、回交1代（BC1）群體、回2代群體（BC2）。依據(jù)雙假測(cè)交理論[12-14]，即一方親本的大部分雜合位點(diǎn)在另一方親本呈顯純隱性或?yàn)殡s合位點(diǎn)時(shí)，這些位點(diǎn)在F1代群體中發(fā)生分離。親本材料遺傳差異越大，多態(tài)性也就越高，越有利于豐富圖譜信息量。因此，本研究以橡膠樹(shù)質(zhì)量性狀相差較大的IAN873×GT1的F1代183株實(shí)生苗群體作為構(gòu)建橡膠樹(shù)遺傳圖譜材料。

在分子生物學(xué)領(lǐng)域，大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，作為1個(gè)染色體連鎖框架圖最低要求為所用標(biāo)記間的平均距離不能大于 20 cM。用于進(jìn)行主效基因定位作為試驗(yàn)?zāi)康臉?gòu)建的連鎖框架圖譜的平均距離范圍一般區(qū)間為[10 cM，20 cM]，遇到特殊情況時(shí)平均距離要求更小。如以基因克隆作為試驗(yàn)?zāi)康牡淖畹鸵鬄樗寺』虻哪繕?biāo)區(qū)域標(biāo)記間的平均圖距區(qū)間為[0 cM，1 cM]。如用于QTL定位分析作為試驗(yàn)?zāi)康牡淖畹鸵鬄槠骄嚯x范圍區(qū)間為[0 cM，10 cM]。本試驗(yàn)所構(gòu)建的橡膠樹(shù)遺傳連鎖框架圖譜除了有5個(gè)大于20 cM的空隙外，該圖的圖距和平均圖距區(qū)間范圍分別為[0.5 cM，19.6 cM]和[2.80 cM，7.92 cM]，符合農(nóng)藝性狀QTL分析和主效基因定位的最低要求。因此，本試驗(yàn)可作為橡膠樹(shù)農(nóng)藝性狀QTL分析的基礎(chǔ)。

3.3 偏分離分析

生物學(xué)界普遍認(rèn)為，分離現(xiàn)象也是生物進(jìn)化的推動(dòng)因素之一[13]，導(dǎo)致偏分離的原因很多。目前主要原因有：遺傳搭車效應(yīng)[14-15]，即在母本體內(nèi)存在使雄配子體失活的相關(guān)基因，此類基因位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄出來(lái)的酶或RNA等影響配子體的存活力、競(jìng)爭(zhēng)力，從而調(diào)控配子體選擇。染色體丟失，即當(dāng)物種雜交時(shí)染色體片段可能發(fā)生丟失，在同一連鎖群上所用的標(biāo)記發(fā)生偏離[16]?；ǚ圻x擇的結(jié)果，即在合子形成前柱頭與花粉之間的相互作用抑制了部分基因漂流，當(dāng)合子形成后會(huì)引起敗育，很有可能是由于結(jié)構(gòu)上存在差異或同源染色體遺傳，或者是自交引起的不親和性導(dǎo)致的主要隔離機(jī)制[17-21]。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)時(shí)因各種原因如試驗(yàn)環(huán)境、操作程序、試劑、儀器等也會(huì)引起誤差，導(dǎo)致譜帶清晰度差異，不同個(gè)體間譜帶缺失、譜帶辨認(rèn)模糊以及操作人員的誤判等也可能會(huì)導(dǎo)致偏分離。本試驗(yàn)中，1%水平上偏分離的標(biāo)記率為 32.00%，5%水平上比率為 12.63%，未表現(xiàn)出有較為明顯偏向親本某一方趨勢(shì)的。偏分離標(biāo)記個(gè)數(shù)分布最多的在 LG1上為23個(gè)，偏分離標(biāo)記所占比例大于0.6在LG9、LG10、LG 18上，說(shuō)明在以上連鎖群當(dāng)中分布影響偏分離的遺傳因子區(qū)域可能較為廣泛存在。

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