姜 華，陸兆新（1．南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇南京 210095;2．徐州醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，江蘇徐州 221004）

膽固醇又稱膽甾醇，是人體必需的營養(yǎng)成分，具有很多重要生理功能，如參與血漿脂蛋白合成，轉(zhuǎn)化為膽汁酸鹽，合成類固醇激素等［1］。然而，體內(nèi)過多的膽固醇積累嚴(yán)重威脅著人類的健康。研究表明，動脈粥樣硬化、冠心病、腦中風(fēng)等心血管疾病發(fā)生率的不斷提高與膽固醇的不正常代謝密切相關(guān)［2］。

自20世紀(jì)70年代以來，人們發(fā)現(xiàn)定植于腸道的微生物具有顯著降低血清膽固醇水平的能力。這些研究成果已引起國內(nèi)外營養(yǎng)學(xué)、醫(yī)學(xué)、微生物學(xué)等各界人士的普遍關(guān)注，其中以乳酸菌降解血清膽固醇水平的研究最多［2－5］。迄今，已有大量研究證實不同種類的乳酸菌具有降低膽固醇的效果。但是，目前關(guān)于乳酸菌降解膽固醇作用機(jī)理尚未定論。普遍認(rèn)為，這是以下3種機(jī)理協(xié)同作用的結(jié)果［6－8］。①共沉淀作用:乳酸菌產(chǎn)生的膽鹽水解酶（Bile salt hydrolase，BSH）可催化腸道中的結(jié)合型膽鹽水解成去結(jié)合膽酸，其溶解度降低且形成沉淀后排出體外，促使更多的膽固醇代謝合成新的膽汁鹽，降低血清膽固醇濃度;②同化作用:乳酸菌將膽醇吸收至細(xì)胞內(nèi)，從而降低體內(nèi)環(huán)境中膽固醇濃度;③摻入細(xì)胞膜:膽固醇可以在乳酸菌生長過程中結(jié)合到菌體細(xì)胞膜或細(xì)胞壁上。筆者以實驗室前期篩選的具有降解膽固醇性能的短乳桿菌JH-1為研究對象，初步探討短乳桿菌JH-1降解膽固醇的作用機(jī)理，為開發(fā)新型降膽固醇乳酸菌制劑提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 主要試驗材料

1．1．1 菌株。短乳桿菌Lactobacillus brevisJH-1，由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院酶工程實驗室保藏。

1．1．2 試劑。膽固醇標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，分析純，純度99%，美國sigma公司;乙腈、異丙醇、甲醇，色譜純，美國Tedia公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1．1．3 培養(yǎng)基。MRS培養(yǎng)基組成為:蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母膏 5 g，葡萄糖20 g，乙酸鈉5 g，檸檬酸三銨2．63 g，磷酸氫二銨2 g，七水硫酸鎂0．58 g，一水硫酸錳 0．20 g，Tween-80 1 ml，蒸餾水1 000 ml。固體培養(yǎng)基在液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加1．5%的瓊脂。

高膽固醇MRS-CHOL培養(yǎng)基［9］配制方法為:準(zhǔn)確稱量膽固醇0．1 g放入小燒杯中，加入0．2 g牛膽鹽、0．1 g蔗糖酯、1 ml吐溫80攪拌均勻，再移取5 ml冰乙酸加熱溶解，把溶解液用超聲波處理15 min后，快速加入到配制好的液體培養(yǎng)基中，邊加入邊攪拌，使其形成均勻、穩(wěn)定的膠體溶液。

1．1．4 主要儀器。Agilent 1100高效液相色譜，美國Agilent公司;UV-2450紫外分光光度計，日本島津;centrifuge 5804R高速冷凍離心機(jī)，德國Eppendorf公司;電子精密天平，德國Sartorius;SW-CJ-IBU超凈工作臺，蘇州凈化。

1．2 試驗方法

1．2．1 菌種活化。將－20℃保存的短乳桿菌Lactobacillus brevisJH-1轉(zhuǎn)接至MRS斜面培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24 h，然后挑取一環(huán)菌接種于液體MRS培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24 h，如此轉(zhuǎn)接培養(yǎng)2次，即為活化菌種。

1．2．2 膽固醇共沉淀作用分析。取經(jīng)活化的短乳桿菌Lactobacillus brevisJH-1培養(yǎng)液2 ml，分別接種于100 ml含有牛膽鹽和不含牛膽鹽的 pH 為 4．0、5．0、6．0、7．0 的 MRS-CHOL培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24 h。分別取上述培養(yǎng)物10 ml，于4℃、10 000 r/min離心10 min，取1 ml上清液備用;棄除上清液，用10 ml無水乙醇重懸菌體，于4℃、10 000 r/min離心10 min，取1 ml洗滌液備用;棄除洗滌液，加入10 ml無水乙醇重懸菌體，冰水浴超聲波破碎（400 W，工作5 s，歇10 s，共10 min），4℃、10 000 r/min離心10 min，上清即為菌體破碎液。采用高效液相色譜法，測定上述培養(yǎng)物的發(fā)酵上清液、菌體洗滌液和菌體破碎液中膽固醇含量。

1．2．3 膽固醇同化作用分析。取經(jīng)活化的短乳桿菌Lactobacillus brevis JH-1培養(yǎng)液2 ml，分別接種于100 ml MRSCHOL培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)4 h后，每隔4 h取樣50 ml，于4℃、10 000 r/min離心10 min。取10 ml上清，加入5 ml乙酸乙酯，混勻后靜置萃取過夜，取上層萃取液1 ml，揮干后加入1 ml無水乙醇，以0．22 μm滅菌濾膜過濾，取濾液作為供試品溶液進(jìn)行HPLC分析。

菌體沉淀用10 ml無水乙醇重懸洗滌，于4℃、10 000 r/min離心10 min。棄除洗滌液，再加入10 ml無水乙醇重懸菌體，冰水浴超聲波破碎（400 W，工作5 s，歇10 s，共10 min），并于4℃、10 000 r/min離心10 min，上清即為菌體破碎液。取上清液4 ml，揮干后加入1 ml無水乙醇，以0．22 μm滅濾膜過濾，取濾液作為供試品溶液進(jìn)行HPLC分析。

1．2．4 菌體細(xì)胞對超聲波的抗性。取經(jīng)活化的短乳桿菌Lactobacillus brevis JH-1培養(yǎng)液2 ml，分別接種于100 ml MRSCHOL培養(yǎng)基和和MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24 h后，取10 ml菌液4 000 r/min離心10 min，并且收集菌體沉淀，用生理鹽水重新懸浮沉淀，調(diào)整菌體濃度為108cfu/ml。取10 ml的重懸液，冰水浴超聲波破碎（500 W，工作5 s，歇10 s，共20 min）。破碎菌液用生理鹽水稀釋，涂布MRS平板計數(shù)，以未經(jīng)超聲破碎的菌懸液為對照，研究超聲破碎處理對細(xì)胞存活率的影響。

1．2．5 HPLC 測定膽固醇含量。

1．2．5．1 膽固醇標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制。準(zhǔn)確稱取膽固醇50．0 mg于25 ml無水乙醇中，并且用無水乙醇定容至50 ml容量瓶中，制成1 g/L膽固醇標(biāo)準(zhǔn)溶液。標(biāo)準(zhǔn)膽固醇工作液配制方法為:取標(biāo)準(zhǔn)膽固醇儲備液，分別以無水乙醇稀釋，使其濃度分別為 0．125、0．250、0．500、0．750 和 1．000 g/L。

1．2．5．2 色譜條件。參照譚來勛等［10］建立的膽固醇高效液相色譜法進(jìn)行，略有改動。具體色譜條件如下:色譜柱為美國Agilent公司反向色譜柱 ZORBAX．Eclipse XDB-C18柱（4．6 ×250 mm，5 μm）;流動相 A（乙腈 +1‰ 三氟乙酸）—流動相B（異丙醇）按60∶40的比例進(jìn)行等梯度洗脫，流速為0．5 ml/min;柱溫40℃;檢測波長為205 nm。膽固醇標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或樣品溶液20 μl進(jìn)樣。洗脫時間15 min。

1．2．5．3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及樣品中膽固醇濃度的計算。分別取20 μl標(biāo)準(zhǔn)膽固醇工作液注入高效液相色譜儀，在上述色譜條件下測定標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積，以濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。分別取20 μl樣液注入高效液相色譜儀，在上述色譜條件下測定樣液的峰面積，由標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程式計算樣液中膽固醇含量。

2 結(jié)果與分析

2．1 色譜圖結(jié)果 采用高效液相色譜法，測定膽固醇標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣液中膽固醇的濃度。膽固醇標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的保留時間為11．503 min（圖1a）。按照“1．2．2”中的方法對樣品進(jìn)行處理后，發(fā)酵液上清液中膽固醇的保留時間約為11．5 min（圖1b）?？梢?，膽固醇的前后無干擾峰，已與樣品中其他物質(zhì)得到很好的分離。

2．2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制及樣品中膽固醇濃度的計算 以峰面積（y）對膽固醇標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（x）作線性回歸，制作膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖2）。當(dāng)膽固醇標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度在0～1．0 g/L范圍內(nèi)，膽固醇獲得較好的分離，其線性方程為y=13 997x+315．62（R2=0．999 5）。將樣品溶液的峰面積代入回歸方程，即可計算出樣品溶液中膽固醇的含量。

2．3 膽固醇共沉淀作用分析 Klaver等［11］提出，去結(jié)合型膽汁鹽在較低的pH條件下（pH＜6），可以同膽固醇共同沉淀析出，因此發(fā)生共沉淀需要同時具備酸性環(huán)境和膽鹽兩個條件。由圖3可知，短乳桿菌JH-1在含有膽鹽與不含膽鹽的MRS-CHOL中培養(yǎng)后，2種菌體洗滌液中膽固醇含量基本沒有變化。當(dāng)含有膽鹽且 pH 為4．0、5．0、7．0時，菌體洗滌液中膽固醇含量為0;當(dāng)pH為6．0時，洗滌液中膽固醇含量0．54%。根據(jù)共沉淀作用發(fā)生所需的兩個條件，發(fā)現(xiàn)在酸性條件下短乳桿菌JH-1并沒有發(fā)生共沉淀現(xiàn)象。研究結(jié)果表明，共沉淀作用不是短乳桿菌JH-1降膽固醇的途徑。

2．4 膽固醇同化作用分析 通過對短乳桿菌JH-1不同培養(yǎng)時間的發(fā)酵上清液和菌體破碎液中膽固醇進(jìn)行HPLC測定，同時得出發(fā)酵上清液與菌體破碎液中膽固醇峰面積的變化趨勢。由圖4可知，在短乳桿菌JH-1發(fā)酵過程中，上清液膽固醇含量逐漸下降，經(jīng)超聲波處理后細(xì)胞破碎液中的膽固醇含量持續(xù)上升，培養(yǎng)24 h后破碎液中膽固醇濃度占30．03%。研究結(jié)果表明，同化作用是短乳桿菌JH-1降膽固醇的主要途徑。

2．5 菌體細(xì)胞對超聲波的抗性 將菌懸液用超聲波在500 W下處理20 min后，研究短乳桿菌JH-1在不同培養(yǎng)條件下的菌體細(xì)胞對超聲波的抗性。Noh等［11－14］分別對加膽固醇和不加膽固醇的培養(yǎng)基下生長的乳酸菌進(jìn)行超聲處理，發(fā)現(xiàn)前者更耐超聲處理，原因可能是吸收到細(xì)胞壁（膜）中的膽固醇改變了細(xì)胞的組成，增加了膜的韌性，從而使菌體抗性增強(qiáng)。由圖5可知，超聲波處理對短乳桿菌JH-1影響較大，在高膽固醇培養(yǎng)基MRS-CHOL的菌體的存活率比在MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)的菌體細(xì)胞的存活率高30%。這說明膽固醇被短乳桿菌JH-1吸收到細(xì)胞壁（膜）中，增加了膜的韌性，從而增強(qiáng)了菌體抗性。

3 結(jié)論與討論

該研究對前期實驗室篩選得到的短乳桿菌JH-1體外降膽固醇的機(jī)理進(jìn)行了初步探討。通過分析同化作用、共沉淀作用和摻入細(xì)胞膜3種乳酸菌降膽固醇作用機(jī)理，初步判定短乳桿菌JH-1體外降膽固醇作用是同化作用和摻入細(xì)胞膜共同作用的結(jié)果。與常規(guī)的膽固醇測定方法比色法相比，該研究采用HPLC法測定發(fā)酵上清液與細(xì)胞破碎液中的膽固醇。試驗結(jié)果更準(zhǔn)確、可靠。此外，短乳桿菌JH-1是從金華火腿中分離得到的一種乳酸菌，是一種公認(rèn)安全的菌種，因而具有較高的安全性。這為后續(xù)研究降膽固醇乳酸菌制劑奠定了理論基礎(chǔ)。

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