王衛(wèi)國(guó)，張仟偉，趙永亮，李瑞靜，林 強(qiáng)，李曉丹，陶宜辰，王 衛(wèi)

（河南工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450001）

0 前言

釀酒酵母（Saccharomyces Cerevisiae）一直作為面包和饅頭以及釀造葡萄酒和啤酒等產(chǎn)品的發(fā)酵菌株.隨著石油資源的日益枯竭以及環(huán)境的持續(xù)惡化，能源和環(huán)境問(wèn)題成為了全球關(guān)注的焦點(diǎn).為了緩解能源危機(jī)給經(jīng)濟(jì)和環(huán)境帶來(lái)的影響，各國(guó)一方面提高能源的利用率，另一方面大力開(kāi)發(fā)新型能源.由于生物能源具有綠色性和可再生性，因此成為研究的熱點(diǎn)與重點(diǎn).研究發(fā)現(xiàn)[1]，通過(guò)釀酒酵母發(fā)酵代謝生產(chǎn)乙醇，然后將乙醇進(jìn)一步脫水后再加上適量的變性劑就可獲得變性燃料乙醇.因此，利用釀酒酵母發(fā)酵技術(shù)將甘蔗、玉米、木薯和纖維類(lèi)廢棄物等轉(zhuǎn)化為燃料乙醇，已成為解決世界能源危機(jī)和開(kāi)發(fā)生物能源的重要手段.燃料乙醇俗稱(chēng)酒精，是國(guó)民經(jīng)濟(jì)中十分重要的工業(yè)產(chǎn)品，用途十分廣泛，如在食品行業(yè)用于配制各類(lèi)白酒、果酒、藥酒等；在化工行業(yè)用于合成化工產(chǎn)品（橡膠、苯胺、乙二醇等）；在燃料方面用于替代日益匱乏的石油資源，可有效減少環(huán)境污染，市場(chǎng)前景廣闊；在醫(yī)藥工業(yè)用于提取醫(yī)藥制劑和作為消毒劑；染料生產(chǎn)、國(guó)防工業(yè)等也需要大量酒精；同時(shí)釀酒酵母中還含多種生理活性物質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)成分，可用于食品和動(dòng)物飼料的添加劑，不僅能提高其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，而且還具有醫(yī)療保健功能，治療機(jī)體因消化不良或維生素缺乏而引起的一些疾病.此外，釀酒酵母與動(dòng)、植物同為真核生物，具有很多相同的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，并且具有生長(zhǎng)繁殖快、代謝周期短、易于分離和培養(yǎng)等特點(diǎn)，在生命科學(xué)研究中被用作真核生物研究的模式生物.選育出優(yōu)良的釀酒酵母菌種不僅能提高產(chǎn)品的產(chǎn)量和質(zhì)量、降低生產(chǎn)成本、增加企業(yè)的利潤(rùn)和市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力，還能緩解能源危機(jī)、減輕環(huán)境污染.因此，對(duì)釀酒酵母進(jìn)行研發(fā)與利用具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和科研意義.人們急切盼望獲得具有多種優(yōu)良特性的釀酒酵母菌株，尤其是轉(zhuǎn)化乙醇能力強(qiáng)的釀酒酵母，其研究意義十分深遠(yuǎn).

1 釀酒酵母研究進(jìn)展

釀酒酵母是人類(lèi)使用較早的微生物之一，廣泛用于食品和醫(yī)藥等領(lǐng)域.釀酒酵母是單細(xì)胞生物，同時(shí)也是一種典型的真核細(xì)胞模型和重要的模式生物，其生長(zhǎng)繁殖快、代謝周期短、易于分離和培養(yǎng)等特性使釀酒酵母更方便于進(jìn)行基因工程和遺傳學(xué)研究.釀酒酵母作為傳統(tǒng)的乙醇代謝菌株，具有耗糖快、遺傳背景清晰、發(fā)酵工藝成熟和體內(nèi)重組能力高效等特點(diǎn)，因此是生物質(zhì)能源發(fā)酵的首選菌株.釀酒酵母全基因組測(cè)序早在1996 年已完成，是第一個(gè)完成基因組測(cè)序的真核生物.它包含16 條染色體，全長(zhǎng)為12 068 kb.編碼專(zhuān)一性蛋白質(zhì)的ORF（開(kāi)放閱讀框）有5 885 個(gè)，平均每個(gè)長(zhǎng)度約為1 450 bp，只有極少數(shù)長(zhǎng)度超過(guò)4 500 bp，最長(zhǎng)的ORF 約為14 730 bp，位于Ⅻ號(hào)染色體上，其功能尚不清楚[2].另外，釀酒酵母基因組的測(cè)序顯示：其基因重組頻繁地發(fā)生在高GC 含量區(qū).隨著釀酒酵母全基因組測(cè)序的完成，對(duì)其基因的功能分析進(jìn)入了一個(gè)新的階段，相應(yīng)的各種研究技術(shù)也隨之迅速發(fā)展起來(lái)，如釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)的建立、釀酒酵母基因敲除技術(shù)、釀酒酵母基因定位技術(shù)、釀酒酵母雙雜交技術(shù)、釀酒酵母功能基因芯片技術(shù)等，為研究釀酒酵母體內(nèi)代謝合成乙醇機(jī)制以及分子傳導(dǎo)通路等提供了便捷、高效的技術(shù)手段.但采用釀酒酵母菌株發(fā)酵也存在一些問(wèn)題，如酒精耐受性低、不耐高溫等.我國(guó)農(nóng)產(chǎn)品資源豐富，但是利用率很低，如何提高生物能源乙醇的產(chǎn)率是當(dāng)前亟需解決的問(wèn)題.目前世界上90%的乙醇是通過(guò)釀酒酵母發(fā)酵生產(chǎn)的[3]，因此構(gòu)建高轉(zhuǎn)化率乙醇發(fā)酵菌株是燃料乙醇生產(chǎn)的重中之重.利用基因工程或代謝工程手段修飾或阻斷釀酒酵母副產(chǎn)物的合成，提高乙醇產(chǎn)率是構(gòu)建工程菌的主要策略.目前，釀酒酵母相關(guān)研究的主要方向是：⑴優(yōu)良菌株的選育.工業(yè)上乙醇發(fā)酵的主要菌株是釀酒酵母，選育出發(fā)酵性能強(qiáng)、繁殖速度快、耐高濃度乙醇、適應(yīng)性強(qiáng)的菌株是研究的主要方向.⑵發(fā)酵工藝優(yōu)化.⑶基因工程菌的構(gòu)建，通過(guò)生物工程技術(shù)選育和構(gòu)建大量耐高溫、耐乙醇等適應(yīng)性強(qiáng)、高乙醇產(chǎn)量的菌株，如敲除釀酒酵母副產(chǎn)物代謝關(guān)鍵基因，促進(jìn)乙醇的合成.釀酒酵母菌種質(zhì)量的好壞對(duì)發(fā)酵工業(yè)的影響巨大，如何獲得耐高滲透壓且酒精發(fā)酵速率快、耐酒精和耐高溫等特性的酵母菌種是目前研究熱點(diǎn).

2 釀酒酵母的選育

釀酒酵母的選育包括篩選和育種兩個(gè)部分.釀酒酵母菌株的篩選主要是通過(guò)杜氏管發(fā)酵試驗(yàn)，在高酒精度、滲透壓、二氧化硫以及低溫等條件下，根據(jù)產(chǎn)氣量的多少和快慢來(lái)對(duì)釀酒酵母的耐酒精性、耐滲透壓性、耐二氧化硫性、耐低溫性等幾個(gè)重要指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)，從而對(duì)釀酒酵母進(jìn)行特定篩選.隨著分子生物學(xué)和基因工程技術(shù)的不斷發(fā)展，釀酒酵母的育種方法也在不斷更新，自然選育、誘變育種、雜交育種、原生質(zhì)體融合、基因工程育種都是目前常用的育種手段，但各有利弊.在菌種的選育時(shí)需要多種不同的育種方法配合使用，才能達(dá)到理想的效果[4-7].

2.1 自然選育

自然環(huán)境中存在多種低劑量的誘變物質(zhì)，如宇宙射線和各種短波輻射等，可使野生釀酒酵母菌株發(fā)生低頻率的基因突變.在不經(jīng)過(guò)人工處理的情況下直接對(duì)釀酒酵母菌群進(jìn)行篩選的育種方法叫做自然選育.Li 等[8]從葡萄汁樣品中分離出32株釀酒酵母，分別對(duì)其發(fā)酵特性進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示其中一株命名為MMf9 的野生釀酒酵母不僅發(fā)酵速率快、產(chǎn)甘油快，而且對(duì)高溫、乙醇、滲透壓、pH 耐受性好.由此看來(lái)，自然界中確實(shí)存在著優(yōu)良釀酒酵母的野生菌株，通過(guò)人工的分離和篩選，有可能獲得具有優(yōu)良性狀的野生釀酒酵母菌株.自然選育是一種簡(jiǎn)單易行的選育方法，可以達(dá)到純化菌種、防止菌種衰退、穩(wěn)定生產(chǎn)、提高產(chǎn)量的目的.但是自然選育的最大缺點(diǎn)是效率低、進(jìn)展慢，從自然界直接篩選的野生釀酒酵母，很難具有理想的特性.然而，近年來(lái)為了獲得安全、無(wú)外源遺傳損傷且有地域風(fēng)格的菌株，很多國(guó)家開(kāi)始重新重視自然選育.

2.2 誘變育種

誘變育種是指用物理、化學(xué)誘變劑和生物誘變劑作用于釀酒酵母細(xì)胞，使其基因的突變率大大提高，然后篩選出符合人們特定需求的優(yōu)良釀酒酵母菌株，進(jìn)而培育出新品種的育種方法.根據(jù)誘變方式的不同可分為3 種[9-11]：物理誘變、化學(xué)誘變和航天誘變.

2.2.1 物理誘變

紫外線、微波、超聲波以及能引起電離輻射的射線或快中子等物理誘變因素都會(huì)增大釀酒酵母菌株DNA 的堿基發(fā)生錯(cuò)配率，從而提高釀酒酵母的基因突變率.Son 等[12]對(duì)一株啤酒酵母進(jìn)行紫外線誘變篩選抗老化能力的菌株，篩選獲得一株A27菌株，其發(fā)酵能力比誘變前提高了15.8%.Bourens等[13]以絮凝性弱而其他發(fā)酵指標(biāo)皆可的啤酒酵母菌為出發(fā)菌株，以激光-氯化鋰為復(fù)合誘變劑誘變啤酒酵母得到一株絮凝性適中的啤酒酵母，絮凝性為37.9%，比原菌株提高了1.61 倍.物理誘變具有操作簡(jiǎn)單、高效、無(wú)污染、變異率高和易推廣等優(yōu)點(diǎn).但有些物理誘變方法如高壓、超聲波和高能離子束以及X 射線等方法雖誘變效果很好，但電離性和穿透力都很強(qiáng)，如果不是專(zhuān)業(yè)的技術(shù)人員在相應(yīng)的設(shè)備中操作，危險(xiǎn)性較大.

2.2.2 化學(xué)誘變

用化學(xué)誘變劑處理釀酒酵母，從而使釀酒酵母的基因突變率大幅提高，然后根據(jù)育種目標(biāo)培育出新品種.Theis 等[14]以啤酒酵母X 為出發(fā)菌株，用亞硝基胍（NTG）和甲基磺酸乙酯（EMS）連續(xù)誘變，通過(guò)初篩及復(fù)篩，得到一株產(chǎn)蛋白酶A 活力低的啤酒酵母突變株GM235.與出發(fā)菌株X 相比，GM235 發(fā)酵的啤酒正丙醇含量高于出發(fā)菌株，蛋白酶A 活力降低了19.83%，異戊醇和總高級(jí)醇分別降低了5.03%和4.87%.化學(xué)誘變育種是一種經(jīng)濟(jì)方便的育種方法，并且不同化學(xué)誘變劑對(duì)染色體、基因等的誘變還具有專(zhuān)一性.但是化學(xué)誘變劑大多是致癌物質(zhì)，使用者必須做好防護(hù)措施.

2.2.3 航天誘變

航天誘變育種是指利用高空氣球或往返式航天器等能達(dá)到的空間環(huán)境對(duì)釀酒酵母的誘變作用而進(jìn)行育種的方法.Vigentini 等[15]對(duì)經(jīng)航天誘變的啤酒酵母菌進(jìn)行復(fù)壯，并對(duì)復(fù)壯后的酵母菌株從細(xì)胞大小、菌落形態(tài)、發(fā)酵力以及增殖情況等幾方面進(jìn)行了篩選.試驗(yàn)結(jié)果表明，誘變后菌株的發(fā)酵力、生長(zhǎng)速度均優(yōu)于出發(fā)菌株.航天誘變育種是集航天、生物、育種等技術(shù)為一身的尖端育種方法，具有育種周期短、突變率高、安全無(wú)污染等優(yōu)點(diǎn).

2.3 原生質(zhì)體融合育種

原生質(zhì)體融合是指將兩個(gè)不同的釀酒酵母細(xì)胞通過(guò)酶解脫壁，在高滲條件下形成球形原生質(zhì)體，然后由聚乙二醇（PEG）促融.原生質(zhì)融合育種是利用兩株釀酒酵母細(xì)胞質(zhì)間相互融合時(shí)兩套基因組會(huì)發(fā)生接觸與交換，導(dǎo)致基因組間進(jìn)行遺傳重組，從而獲得融合了兩親本優(yōu)良性狀的新釀酒酵母菌株的一種育種方法.Stanley 等[16]將生產(chǎn)用的兩種啤酒酵母分別進(jìn)行單倍體化，再利用PEG進(jìn)行融合.經(jīng)試驗(yàn)證明融合子是一株口味獨(dú)特、發(fā)酵度高、絮凝性強(qiáng)、遺傳性能穩(wěn)定的啤酒酵母新菌株.Clemente 等[17]用F-20-7 與酒類(lèi)酒球菌SD-2a進(jìn)行融合，獲得的融合子降解蘋(píng)果酸的能力高達(dá)85%，比已有報(bào)道的最高降酸率高出7%，與酒球菌的降酸能力不相上下.由此可知，原生質(zhì)體融合育種可使基因重組的頻率大幅提高.此外，原生質(zhì)體融合育種還克服了遠(yuǎn)緣雜交不親和等難題.

2.4 雜交育種

雜交育種是指將具有不同優(yōu)良性狀的釀酒酵母?jìng)€(gè)體間進(jìn)行雜交，使控制優(yōu)良性狀的遺傳物質(zhì)進(jìn)行重新組合，然后在其雜種后代中分離挑選出具有雙親優(yōu)良性狀純合子的育種方法.Pawel 等[18]用選自乳清的釀酒酵母與葡萄汁酵母為親本進(jìn)行雜交，獲得的雜合子同時(shí)具有分解蘋(píng)果酸能力強(qiáng)和生成乙酸能力弱的特點(diǎn)，其降酸能力提高了20%左右.Kapsopoulou 等[19]曾將一株絮凝性強(qiáng)酵母與一株不產(chǎn)SO2的酵母雜交獲得了一株絮凝性比較強(qiáng)且不產(chǎn)SO2的酵母，并用于生產(chǎn)中.雜交育種不僅擴(kuò)展了變異范圍，而且克服了釀酒酵母菌株在經(jīng)歷長(zhǎng)期誘變劑處理后造成的菌株生長(zhǎng)活力降低、生長(zhǎng)周期變長(zhǎng)、孢子量銳減、代謝緩慢、產(chǎn)量和性狀難以繼續(xù)提高等缺陷，并且雜種后代的生活能力、適應(yīng)性和抗逆性都很強(qiáng).但雜交育種還存在著不易產(chǎn)生新的基因且操作方法復(fù)雜、對(duì)技術(shù)和設(shè)備要求高、優(yōu)良性狀的分離和育種的周期長(zhǎng)等不足.

2.5 基因工程育種

基因工程不僅能改變?cè)械幕颍踔聊軇?chuàng)造新的物種.基因工程在微生物育種方面的技術(shù)目前已經(jīng)相當(dāng)成熟[20-24].基因工程就是在分子水平上將具有某種優(yōu)良性狀的外源目的基因（遺傳物質(zhì)片段）在體外經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶與連接酶的“剪接”作用后，再與特定載體構(gòu)成重組分子，然后插入釀酒酵母菌基因的特定位置中，并使這個(gè)目的基因能在釀酒酵母細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行穩(wěn)定的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯和表達(dá)的一種育種技術(shù).Caruso 等[25]從S.cerevisae 和S.nvarum 品系中克隆編碼乙醇乙酰轉(zhuǎn)移酶的基因，轉(zhuǎn)導(dǎo)至酵母細(xì)胞中，乙醇乙酰轉(zhuǎn)移酶表現(xiàn)出高活性，提高了啤酒中乙酸戊乙酯和乙酸乙酯等產(chǎn)香氣物質(zhì)的生成，啤酒的香味更強(qiáng)烈.基因工程育種最大的優(yōu)點(diǎn)是不受種屬限制、可按照人們的需要對(duì)菌種進(jìn)行定向改造.但是，基因工程育種對(duì)技術(shù)要求高，且外源基因的表達(dá)可能影響釀酒酵母的釀造特性，還有可能引起生態(tài)危機(jī).

2.6 代謝工程育種

代謝工程是指通過(guò)基因工程的手段改變釀酒酵母細(xì)胞的代謝途徑[26].利用代謝工程方法對(duì)釀酒酵母進(jìn)行改造育種時(shí)，首先要分別從釀酒酵母細(xì)胞的基因、RNA、蛋白質(zhì)、代謝物、代謝通量等多個(gè)層次對(duì)釀酒酵母的代謝流量及代謝控制進(jìn)行定量且系統(tǒng)的分析，尋找出最佳的代謝途徑，然后再利用DNA 重組技術(shù)和相關(guān)遺傳學(xué)手段對(duì)釀酒酵母的細(xì)胞進(jìn)行遺傳修飾，例如改變釀酒酵母基因的結(jié)構(gòu)、刪除不良基因或加入新的優(yōu)良基因等，從而合理設(shè)計(jì)出細(xì)胞的代謝途徑.Hontz 等[27]利用構(gòu)建酵母菌-大腸桿菌穿梭質(zhì)粒，將柄狀畢赤酵母依賴(lài)木糖還原酶和木糖醇脫氫酶基因?qū)脶劸平湍妇w內(nèi)，獲得的轉(zhuǎn)化子能同時(shí)有效的將木糖和葡萄糖轉(zhuǎn)化為乙醇.代謝工程育種能擴(kuò)展代謝途徑、重新分配代謝流、轉(zhuǎn)移或構(gòu)建新的代謝途徑，從而改變酵母菌種的底物利用，提高生產(chǎn)可操作性，減少有害副產(chǎn)物產(chǎn)生.

3 釀酒酵母的鑒定方法

3.1 傳統(tǒng)鑒定

傳統(tǒng)的釀酒酵母的分類(lèi)鑒定主要根據(jù)細(xì)胞繁殖類(lèi)型，產(chǎn)孢子狀況，菌落的顏色、大小和形態(tài)等，以及生理生化試驗(yàn)，再參照《酵母菌的特征和鑒定手冊(cè)》和《微生物分類(lèi)學(xué)》，進(jìn)行相關(guān)菌種的鑒定.傳統(tǒng)鑒定不僅工作量大、周期長(zhǎng)、操作復(fù)雜且鑒定結(jié)果的重復(fù)性差[28-30].

3.2 現(xiàn)代分子鑒定

現(xiàn)代分子鑒定法主要以核酸作為研究對(duì)象，研究的是基因型，而非表現(xiàn)型，因此能反映其遺傳本質(zhì)[31-33].現(xiàn)代分子鑒定法具有穩(wěn)定性好、易確定同源關(guān)系、便于計(jì)算機(jī)分析等優(yōu)點(diǎn)，不僅提高了鑒定的準(zhǔn)確度，而且縮短了鑒定時(shí)間.近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)的高速發(fā)展，興起了很多新的釀酒酵母鑒定方法，接下來(lái)對(duì)幾種常見(jiàn)的釀酒酵母現(xiàn)代分子鑒定方法進(jìn)行簡(jiǎn)單介紹.

3.2.1 DNA 同源性分析

不同釀酒酵母菌株之間的親緣關(guān)系越遠(yuǎn)，那么它們之間共有的相同核苷酸序列就越少.研究表明[34]，同源率在70%以上代表同一種，同源率在40%～70%之間的代表同一種內(nèi)親緣關(guān)系比較遠(yuǎn)的菌株，在40%以下則被認(rèn)為代表不同的種.采用分子雜交的方法就可以找到兩株釀酒酵母之間的DNA 同源序列，進(jìn)而可知道同源百分率的高低.DNA 同源性分析方法不僅可以區(qū)分不同的酵母菌種，而且還能區(qū)分釀酒酵母種內(nèi)不同菌株的親緣關(guān)系遠(yuǎn)近.

3.2.2 脈沖電場(chǎng)凝膠電泳核型分析

釀酒酵母的核型是指染色體的條數(shù)及大小，核型間接地反映了釀酒酵母所含有的遺傳物質(zhì)的多少及其組織形態(tài)，且會(huì)隨物種的分化而變化[35-37].脈沖凝膠電泳核型分析是利用瓊脂糖凝膠電泳可在凝膠中分離出完整的釀酒酵母染色體DNA，之后便可測(cè)定釀酒酵母細(xì)胞染色體條數(shù)及每條染色體DNA 分子的大小.Andrea 等[38]通過(guò)脈沖電場(chǎng)凝膠電泳分析并發(fā)現(xiàn)，在電泳核型上，釀酒酵母、貝酵母和巴氏酵母與少孢酵母具有很顯著的差異.此方法是一種快捷、方便、有效的輔助手段.但在進(jìn)行分類(lèi)鑒定時(shí)必須以形態(tài)、生理、生化等指標(biāo)為基礎(chǔ).

3.2.3 核糖體DNA 序列分析

釀酒酵母的核糖體RNA 中包括26S、18S、5.8S和5S 4 種不同沉降系數(shù)的核糖體RNA 片段，其對(duì)應(yīng)的基因片段在遺傳上既相對(duì)穩(wěn)定性又有一定的突變性.大亞基上的26S rDNA 分子可分為D1、D2、…、D12 等多個(gè)區(qū)域，但D1/D2 區(qū)域序列的長(zhǎng)度適中，適于釀酒酵母的鑒定.此外，釀酒酵母的ITS 基因具有進(jìn)化速度快、多態(tài)性等特點(diǎn)，適合親緣關(guān)系較近菌株間的鑒定[39-42].Escot 等[43]從釀酒葡萄產(chǎn)區(qū)采集了99 份葡萄果粒利用菌落特征、細(xì)胞形態(tài)、生理生化特征結(jié)合26S rDNA D1/D2 序列進(jìn)行鑒定，成功將菌株鑒定.Romano 等[44]通過(guò)26S rDNA D1/D2 區(qū)域分析的方法，分析鑒定了自甘肅莫高葡萄酒廠分離的29 株非釀酒酵母菌.核糖體DNA 序列分析法在釀酒酵母菌種分類(lèi)鑒定中效果很好.

3.2.4 PCR-RFLP

DNA 限制性?xún)?nèi)切酶作用片段多態(tài)性（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）是指每種DNA 限制性?xún)?nèi)切酶都有特定的作用位點(diǎn)，釀酒酵母5.8S rRNA 基因及兩側(cè)的轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）具有顯著的種間差異性，將PCR 擴(kuò)增的基因組DNA 用特定的限制性?xún)?nèi)切酶酶解后電泳分離可獲得高度多態(tài)性的圖譜，通過(guò)與模式菌株的圖譜比較從而對(duì)菌株進(jìn)行鑒定.Patel 等[45]用5.8S-ITS區(qū)域的PCR-RFLP 方法結(jié)合ITS 序列分析，得到東北山葡萄酒發(fā)酵酵母的19 種酶切圖譜，進(jìn)行的分子鑒定的結(jié)果與已知的酵母種類(lèi)完全一致.由此說(shuō)明此方法鑒定結(jié)果準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、快捷.

除上述幾種方法外，DNA G+C 摩爾百分含量分析、等位酶分析、線粒體DNA 限制性酶切分析、DNA 微衛(wèi)星分析、DNA 的RAPD 分析、巢式PCR擴(kuò)增、rDNA 序列分析、可溶性蛋白酶分析、顯微傅里葉變換紅外光譜分析等[46-49]也是釀酒酵母現(xiàn)代分子鑒定的常用方法.

4 釀酒酵母的應(yīng)用概況

釀酒酵母雖然形態(tài)簡(jiǎn)單但其代謝產(chǎn)物多、生理結(jié)構(gòu)復(fù)雜且富含多種生理活性物質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)成分，在釀造、醫(yī)藥保健、飼料、能源化工以及生命科學(xué)研究等領(lǐng)域中廣泛應(yīng)用.

4.1 釀酒酵母在釀酒工業(yè)中的應(yīng)用

由于釀酒產(chǎn)業(yè)是我國(guó)的支柱產(chǎn)業(yè)之一，因此釀酒酵母在國(guó)民經(jīng)濟(jì)中有著舉足輕重的作用[50].釀酒酵母所釀酒的種類(lèi)繁多，如白酒、啤酒、黃酒和果酒等，并且形成了各種類(lèi)型的名酒，如貴州茅臺(tái)酒、紹興黃酒、青島啤酒和張?jiān)＝獍偌{等.一般來(lái)說(shuō)，酒的品種不同，所用的釀酒酵母以及釀造的工藝也不同.但就算是同一類(lèi)型的酒，不同的地區(qū)也有獨(dú)特的釀造工藝和不同的風(fēng)味[51].

4.2 釀酒酵母在醫(yī)療保健中的應(yīng)用

我國(guó)古代就有用釀酒酵母來(lái)治療疾病的記載[52]，中醫(yī)將其稱(chēng)為“神曲”.現(xiàn)代醫(yī)藥上將釀酒酵母制成酵母片，即市售的食母生片，可用于提高新陳代謝機(jī)能，治療消化不良癥、肝臟疾病和藥物中毒以及白血球減少癥和肝炎等疾病.另外，釀酒酵母還可作為一些微量元素的載體，如在酵母培養(yǎng)過(guò)程中，添加硒可用于治療克山病、大骨節(jié)病和防止細(xì)胞衰老，添加鉻的釀酒酵母可用于治療糖尿病等.在醫(yī)藥生產(chǎn)中，可從釀酒酵母細(xì)胞中提取凝血脂、麥甾醇（纖維素的前體）、卵磷脂、核酸、核苷酸、多糖、氨基酸、谷胱甘肽和核苷類(lèi)藥物等多種生化藥物[53].此外，利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)可以制備相應(yīng)的基因重組酵母育苗，為攻克及預(yù)防相關(guān)疾病提供試驗(yàn)支撐.

4.3 釀酒酵母在飼料生產(chǎn)中的應(yīng)用

釀酒酵母蛋白質(zhì)含量高達(dá)50%以上，在畜牧業(yè)中一直作為單細(xì)胞蛋白的主要來(lái)源而被廣泛使用.單細(xì)胞蛋白是從含蛋白的微生物中提取的蛋白質(zhì)，具有促進(jìn)動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育、縮短飼養(yǎng)期、增加肉量和蛋量、改善肉質(zhì)和提高瘦肉率、改善皮毛的光澤度和增強(qiáng)幼禽的抗病能力的作用.此外，釀酒酵母還存在于動(dòng)物腸道中，不僅可以提高反芻動(dòng)物對(duì)飼料干物質(zhì)、纖維素、半纖維素、蛋白等有機(jī)物和磷酸的消化率，增強(qiáng)機(jī)體的免疫力，還能提高飼料中礦物質(zhì)利用率，有助于動(dòng)物充分利用飼料中的養(yǎng)分.隨著家畜攝入釀酒酵母量的增加，釀酒酵母會(huì)在家畜的腸胃道上大量繁殖，可有效改善家畜腸胃的菌群結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)家畜的免疫力和抗病力.

4.4 釀酒酵母在能源化工中的應(yīng)用

釀酒酵母在能源化工中主要用于生產(chǎn)酒精，酒精除了可作為“綠色”燃料外還是許多化工行業(yè)中不可缺少的基礎(chǔ)原料和溶劑，如合成橡膠、聚丙乙烯、乙二醇、冰醋酸、苯胺、聚氯乙烯、乙醚、脂類(lèi)、環(huán)氧乙烷和乙基苯等化工產(chǎn)品.另外，酒精還是香料、染料、油漆、樹(shù)脂等工業(yè)生產(chǎn)部門(mén)必不可少的有機(jī)溶劑，還可作為珠寶、鐘表等的洗滌劑.酒精也是生產(chǎn)和加工油漆和化妝產(chǎn)品中不可缺少的溶劑.我國(guó)農(nóng)副產(chǎn)品資源豐富，把農(nóng)副產(chǎn)品用于工業(yè)酒精生產(chǎn)也是農(nóng)產(chǎn)品深加工和保護(hù)環(huán)境的一條有效途徑[54].

4.5 釀酒酵母在生命科學(xué)研究中的應(yīng)用

釀酒酵母與動(dòng)、植物同為真核生物，且全基因組比較小、遺傳背景相對(duì)清楚，因此被廣泛作為真核模式生物[55].通過(guò)對(duì)釀酒酵母基因進(jìn)行連鎖分析、定位克隆和測(cè)序驗(yàn)證等一系列檢測(cè)后就可獲得與人類(lèi)某些疾病相關(guān)的基因序列，使構(gòu)建精細(xì)的遺傳圖譜成為可能，可大大提高人類(lèi)基因遺傳性疾?。ㄈ缣悄虿?、小腸癌等）的診斷和治療水平.釀酒酵母作為真核生物的模式菌株，與分子生物學(xué)技術(shù)結(jié)合后會(huì)使人類(lèi)對(duì)真核生物的功能基因組信息、生物信息學(xué)、蛋白組學(xué)、DNA 芯片、基因敲除、藥物基因等方面的研究更加深入，同時(shí)還有助于菌株的改良.

5 存在的問(wèn)題和解決辦法

5.1 存在的問(wèn)題

目前釀酒酵母在選育和研究應(yīng)用中還存在以下問(wèn)題：⑴釀酒酵母各種耐受性的機(jī)理還不清楚，有關(guān)耐低溫、耐酒精、耐高滲等的研究很多，雖然在應(yīng)用研究上，通過(guò)添加培養(yǎng)基成分、改變培養(yǎng)條件以及菌種選育等方式已使釀酒酵母各種耐受性大大提高，但耐受性的機(jī)理還不清楚.⑵研究和應(yīng)用還局限于傳統(tǒng)領(lǐng)域，還需擴(kuò)展.⑶缺少釀酒酵母在工業(yè)生產(chǎn)中不同脅迫因素之間相互影響的研究，釀酒酵母在工業(yè)生產(chǎn)中除了受乙醇的毒性影響外，還受到高溫、高滲透壓等脅迫因素的影響，目前的研究大都是單一脅迫因素對(duì)乙醇發(fā)酵性能的影響，很少研究各脅迫因素之間的聯(lián)系.⑷已取得研究成果未能在生產(chǎn)中應(yīng)用，例如啤酒廢酵母對(duì)重金屬的生物吸附應(yīng)用沒(méi)能在實(shí)際生產(chǎn)生活中大規(guī)模的推廣.⑸釀酒酵母果糖利用能力低，殘余果糖會(huì)導(dǎo)致微生物污染和酒體失衡.⑹釀酒酵母生產(chǎn)酒精的底物處理成本高，國(guó)內(nèi)外均以淀粉質(zhì)為主要原料生產(chǎn)酒精，釀酒酵母缺乏分解淀粉所必需的淀粉酶，在發(fā)酵過(guò)程中淀粉需經(jīng)蒸煮、a-淀粉酶液化處理和隨后的酸解或酶解即糖化酶糖化過(guò)程變成葡萄糖后才能被酵母菌利用，底物的處理成本占很大比例.⑺在誘變育種方面，不同誘變因素組合后，缺少誘變效果的系統(tǒng)比較.⑻缺乏對(duì)誘變菌株穩(wěn)定性以及在生產(chǎn)工藝中的具體應(yīng)用條件的研究，目前的研究大多只局限于使某一代釀酒酵母獲得新的優(yōu)良性狀，而難以使其后代穩(wěn)定的遺傳該優(yōu)良性狀.

5.2 解決的辦法

針對(duì)上述釀酒酵母在選育和研究應(yīng)用中存在的問(wèn)題，可采取的應(yīng)對(duì)措施為：⑴由于釀酒酵母細(xì)胞的各項(xiàng)耐受性受多種基因控制，且各基因之間的聯(lián)系錯(cuò)綜復(fù)雜，因此應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)對(duì)基因工程、基因組學(xué)、蛋白組學(xué)以及細(xì)胞代謝工程的研究，從而獲得更多的相關(guān)基因信息，為各種耐受性的機(jī)理研究奠定基礎(chǔ).⑵隨著釀酒酵母許多新的功能逐漸被發(fā)現(xiàn)，如存在高效合成萜類(lèi)的甲羥戊酸途徑，可有效吸附廢水中的Mn2+，具有表達(dá)人血清白蛋白（HSA）系統(tǒng)等[56]，可以利用釀酒酵母的這些功能，將其應(yīng)用于處理傳統(tǒng)方法不能處理的低濃度重金屬?gòu)U水或用于避免人血生產(chǎn)HSA 時(shí)造成的肝炎和艾滋病等疾病的傳染以及將釀酒酵母改造為生產(chǎn)青蒿酸、丹參酮和人參皂苷等多種藥用萜類(lèi)化合物的工程菌[57].此外，利用釀酒酵母作為底盤(pán)菌構(gòu)建生產(chǎn)番茄紅素細(xì)胞工廠也具有很大潛力.⑶應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)多種脅迫因素之間交叉關(guān)聯(lián)性的研究，這不僅有助于耐受機(jī)制的研究，而且為選育對(duì)多種環(huán)境脅迫因素具有較強(qiáng)耐性的釀酒酵母提供了基礎(chǔ).⑷已取得的研究成果之所以未能在生產(chǎn)中大規(guī)模使用，無(wú)非是由于生產(chǎn)工藝滯后、生產(chǎn)成本過(guò)高等因素造成的，因此應(yīng)加強(qiáng)配套生產(chǎn)工藝的研究以及探索降低處理成本的方法.⑸釀酒酵母果糖利用率低，與酒精發(fā)酵中止和發(fā)酵不徹底有關(guān)，今后需進(jìn)一步擴(kuò)大對(duì)釀酒酵母果糖利用的相關(guān)基因的研究，同時(shí)加強(qiáng)各種發(fā)酵條件對(duì)這些相關(guān)基因調(diào)控方面的研究，為解決酒精發(fā)酵中止和發(fā)酵不徹底的問(wèn)題提供理論依據(jù).⑹利用基因工程等手段選育出能直接利用淀粉進(jìn)行發(fā)酵的釀酒酵母以及改進(jìn)發(fā)酵工藝和提高菌種發(fā)酵性能等手段也可有效降低生產(chǎn)成本.⑺全面系統(tǒng)的對(duì)兩種以及多種誘變方法組合后的誘變效果進(jìn)行比較，從而得到最有效的誘變組合方式.⑻隨著新的分子生物學(xué)技術(shù)蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)、基因組學(xué)等組學(xué)技術(shù)以及高通量分析技術(shù)的發(fā)展，控制優(yōu)良性狀遺傳穩(wěn)定性的基因序列必將被找到，屆時(shí)遺傳穩(wěn)定性問(wèn)題將迎刃而解，此外，對(duì)生產(chǎn)工藝中具體應(yīng)用條件的研究應(yīng)由原來(lái)單一試驗(yàn)方法向利用高等數(shù)學(xué)、計(jì)算機(jī)技術(shù)等綜合性高通量技術(shù)等方向發(fā)展.

6 結(jié)論與展望

綜上所述，選育出優(yōu)良的釀酒酵母菌株具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和科研意義，尤其是轉(zhuǎn)化乙醇能力強(qiáng)的釀酒酵母，必將成為未來(lái)全世界釀酒酵母相關(guān)行業(yè)的研究重點(diǎn).現(xiàn)階段應(yīng)著力于在基因組、功能基因組、轉(zhuǎn)錄組和代謝組等信息基礎(chǔ)上，利用系統(tǒng)生物學(xué)等技術(shù)，發(fā)掘新的功能基因，建立先進(jìn)的代謝工程技術(shù)以及微生物育種新方法和新技術(shù)，選育出具有工業(yè)應(yīng)用價(jià)值的優(yōu)良釀酒酵母菌株.借助先進(jìn)的高通量分析技術(shù)和過(guò)程優(yōu)化平臺(tái)，實(shí)現(xiàn)從功能基因到優(yōu)良菌株，再到重要生物產(chǎn)品的高效生物發(fā)酵.相信在不久的將來(lái)，具有多個(gè)可穩(wěn)定遺傳、優(yōu)良性狀的釀酒酵母菌種將會(huì)在釀造、食品、醫(yī)藥、飼料、能源化工和環(huán)境保護(hù)等多個(gè)領(lǐng)域獲得更加廣泛的應(yīng)用.

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