張曉光， 黃 挺， 張 偉， 黃 亮， 全 燦， 李紅梅， 楊 屹

（1.北京化工大學(xué)理學(xué)院，北京100029； 2.中國計(jì)量科學(xué)研究院，北京100029；3.廣州計(jì)量檢測技術(shù)研究院，廣東廣州510030）

維生素K1凍干標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制

張曉光1， 黃 挺2， 張 偉2， 黃 亮3， 全 燦2， 李紅梅2， 楊 屹1

（1.北京化工大學(xué)理學(xué)院，北京100029； 2.中國計(jì)量科學(xué)研究院，北京100029；3.廣州計(jì)量檢測技術(shù)研究院，廣東廣州510030）

采用二甲基亞砜（DMSO）作為凍干標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的溶劑，以重量法準(zhǔn)確配制維生素K1／DMSO溶液，再進(jìn)行分裝、冷凍干燥，經(jīng)定性分析、定值分析、均勻性檢驗(yàn)、穩(wěn)定性考察和不確定度評定，研制了維生素K1凍干標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。以維生素K1純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液為校準(zhǔn)品，對得到的凍干物質(zhì)進(jìn)行了高效液相色譜法定值分析，凍干標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的準(zhǔn)確定值結(jié)果為0.96mg／mL，相對擴(kuò)展不確定度為7%。建立的維生素K1凍干標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制方法，對于臨床檢驗(yàn)中維生素K1的準(zhǔn)確測定和相關(guān)疾病的正確診斷治療以及維生素K1長期保存具有重要意義。

計(jì)量學(xué)；維生素K1；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)；冷凍干燥；二甲基亞砜；高效液相色譜法

1 引 言

維生素K1（phylloquinone）促進(jìn)骨的重建和鈣的動(dòng)員，是維持人體生理功能的重要營養(yǎng)素［1］。準(zhǔn)確測定血清維生素K1對相關(guān)疾病的正確診斷以及治療具有重要意義。研制帶有準(zhǔn)確純度及不確定度水平的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，可為臨床檢驗(yàn)、醫(yī)學(xué)、營養(yǎng)學(xué)、衛(wèi)生檢驗(yàn)檢疫等方面的測量和研究工作提供技術(shù)支持和量值溯源保障［2～4］。維生素K1的溶劑穩(wěn)定性較差，干燥后的樣品可以長期保存。凍干技術(shù)是基于凍結(jié)制品的升華來達(dá)到脫水的目的，由于干燥過程中沒有液體，液體以固體狀態(tài)直接升華，且在低溫、低氧下進(jìn)行，大多數(shù)生物反應(yīng)停滯，使物料的原有結(jié)構(gòu)和形狀受到最小程度的破壞，從而得到具有優(yōu)良品質(zhì)的產(chǎn)品［5］。同時(shí)，二甲基亞砜（DMSO）是一種良好的有機(jī)溶劑，在18℃以下就能變成固態(tài)。利用DMSO作為溶劑溶解樣品，凍干。不需要超低溫預(yù)冷樣品，提高了冷凍干燥的效率。本課題組根據(jù)國際標(biāo)準(zhǔn)化組織ISO導(dǎo)則35［6］，研制了維生素K1凍干標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。首先采用重量法溶解維生素K1，再分裝，凍干，得到維生素K1凍干物質(zhì)，以維生素K1純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為參照，利用高效液相色譜法，對維生素K1凍干標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行了定值分析。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)用戶只需按規(guī)定在凍干標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中加入一定體積的溶劑，即可作為溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)使用。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 主要儀器與試劑

美國Agilent 1200型高效液相色譜儀，配有二極管陣列檢測器（DAD）；Agilent6410型三重四級桿液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀；冷凍干燥機(jī)（Christ ALPHA 1-2 LD plus，德國）；布魯克公司Bruker Ascend 800核磁共振儀（帶有5 mm CPQCI超低溫探頭）；Inertsil ODS-SP，250 mm×4.6 mm×5μm液相色譜柱（GL Science Inc.日本）。

維生素K1純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)由本課題組研制（中國計(jì)量科學(xué)研究院化學(xué)計(jì)量與分析科學(xué)研究所，99.2%，相對擴(kuò)展不確定度0.6%（k=2））；氘代二氯甲烷（CD2Cl2）（Sigma-Aldrich公司）；甲醇（色譜純，德國Merck公司）；二甲基亞砜（DMSO）（色譜純，美國Fisher Scientific公司）；其余試劑為分析純；實(shí)驗(yàn)用水皆為超純水。

2.2 定性分析

采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法和核磁共振法對維生素K1凍干標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)主成分進(jìn)行定性分析。

2.3 維生素K1凍干物質(zhì)制備與定值

2.3.1 維生素K1凍干物質(zhì)的制備

利用重量法準(zhǔn)確配制1 mg／mL的維生素K1的純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的DMSO溶液共100 mL，分裝至100個(gè)2 mL的棕色玻璃瓶，每瓶1 mL，然后置于-20℃冰箱30 min，觀察瓶內(nèi)溶液完全凝固，立刻取出，置于冷凍干燥儀內(nèi)，進(jìn)行冷凍干燥4 h，觀察瓶內(nèi)樣品被完全干燥后，取出樣品，置于-20℃，避光，密封保存。

2.3.2 維生素K1凍干物質(zhì)定值

凍干樣品使用前放到室溫平衡，并用1 mL DMSO復(fù)溶。同時(shí)用重量法準(zhǔn)確配制1mg／mL的維

式中：cd為維生素K1凍干物質(zhì)配制濃度，mg／mL；cr為維生素K1純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)配制濃度，mg／mL；Ar為維生素K1純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)液相峰面積；Ad為維生素K1凍干物質(zhì)液相峰面積。

2.4 均勻性檢驗(yàn)

根據(jù)ISO Guide 35（2006）的要求，對上述標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行了均勻性檢驗(yàn)。具體抽樣檢驗(yàn)方法為從每種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中隨機(jī)抽取15個(gè)包裝，進(jìn)行瓶間均勻性檢驗(yàn)；每一瓶取3個(gè)子樣，進(jìn)行瓶內(nèi)均勻性檢驗(yàn)。檢驗(yàn)方法為定值方法，使用測量數(shù)據(jù)計(jì)算均勻性引入的不確定度ubb。

2.5 穩(wěn)定性考察

根據(jù)ISO Guide 35（2006），標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)穩(wěn)定性考察按先密后疏的原則，在一定時(shí)間間隔內(nèi)選擇定值方法，檢測在規(guī)定條件下保存的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)復(fù)溶濃度隨時(shí)間的變化情況，使用測量數(shù)據(jù)計(jì)算長期和短期穩(wěn)定性引入的不確定度ults和usts。

長期穩(wěn)定性：將維生素K1樣品置于低溫（4℃）儲存條件，凍干樣品置于-20℃儲存條件下，分別在第1、3、6個(gè)月進(jìn)行穩(wěn)定性監(jiān)測。每次取5個(gè)包裝，每個(gè)包裝取一個(gè)子樣，測3次，計(jì)算平均值，把5個(gè)包裝測量結(jié)果平均值作為檢測結(jié)果。

短期穩(wěn)定性：將維生素K1樣品以及凍干樣品置于50℃條件下，分別在第1、3、5、7天進(jìn)行穩(wěn)定性監(jiān)測。具體檢測方法與長期穩(wěn)定性檢測相同。

2.6 凍干標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)不確定度分析

2.6.1 以純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為標(biāo)準(zhǔn)用LC檢測DMSO復(fù)溶后凍干物質(zhì)濃度的不確定度

主要由維生素K1純品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的不確定度up和用LC多次檢測得到凍干物質(zhì)濃度的相對不確定度uLC引入。生素K1純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)甲醇溶液作為標(biāo)準(zhǔn)，利用高效液相色譜法分別測定凍干樣品和標(biāo)準(zhǔn)樣品的峰面積。高效液相色譜法條件：流動(dòng)相為甲醇∶水（92∶8）等度洗脫；流速：1 mL／min；進(jìn)樣量：5μL；樣品為1 mg／mL維生素K1甲醇溶液；檢測波長：274 nm。根據(jù)式（1）可算出凍干樣品的濃度大小

2.6.2 均勻性與穩(wěn)定性相對不確定度

均勻性與穩(wěn)定性相對不確定度計(jì)算方法參見ISO Guide 35（2006）要求。

2.6.3 凍干標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的不確定度

2.6.4 相對擴(kuò)展不確定度（包含因子k=2）

3 結(jié)果與討論

3.1 維生素K1定性分析

圖1為維生素K1的質(zhì)譜圖，可以看出，質(zhì)荷比m／z為451.5和187.10與文獻(xiàn)［7，8］一致，可以初步對維生素K1定性。核磁共振結(jié)果見圖2，圖中橫軸表示化學(xué)位移，縱軸表示共振強(qiáng)度。與維生素K1標(biāo)準(zhǔn)譜圖相一致［9］，可以確認(rèn)樣品原料為維生素K1。

圖1 維生素K1的質(zhì)譜圖

圖2 維生素K1核磁共振譜圖

3.2 維生素K1凍干物質(zhì)的制備

制備維生素K1凍干物質(zhì)過程中要考慮到以下幾方面：（1）樣品的穩(wěn)定。因?yàn)闃悠凡煌?，其穩(wěn)定存在狀態(tài)不同，維生素K1由于在溶液狀態(tài)下的不穩(wěn)定性，不能長期保存，這樣給用戶帶來了困擾，而其干燥后的樣品能長期保存。（2）干燥采用的方法。干燥樣品的方法很多，而經(jīng)冷凍干燥技術(shù)干燥后的樣品結(jié)構(gòu)和形狀僅受到最小程度的破壞，從而得到具有優(yōu)良品質(zhì)的產(chǎn)品。（3）溶劑選擇。能溶解維生素K1的溶劑很多（甲醇、乙醇等），但這些溶劑溶解的樣品在凍干之前均需要在超低溫下預(yù)冷，而DMSO作為一種良好的有機(jī)溶劑在18℃就能完全成為固態(tài)，從而直接可以進(jìn)行凍干，減少了冷凍干燥的時(shí)間。

3.3 維生素K1定值分析

3.3.1 以高效液相色譜法（HPLC）對維生素K1定值

圖3為維生素K1用DMSO復(fù)溶后的高效液相色譜圖。以維生素K1純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為標(biāo)準(zhǔn)，利用外標(biāo)法測定復(fù)溶后的維生素K1凍干物質(zhì)。利用測得標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的峰面積根據(jù)式（1）可得到凍干物質(zhì)濃度大小。

圖3 維生素K1的液相色譜定值譜圖（檢測波長274 nm）

4 定值結(jié)果以及不確定度評定

4.1 維生素K1凍干物質(zhì)的定值結(jié)果

以維生素K1純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)配制的溶液為標(biāo)準(zhǔn)（1 mg／mL），根據(jù)式（1）定值凍干物質(zhì)。結(jié)果見表1。

表1 LC定值結(jié)果 mg·mL-1

4.2 維生素K1凍干物質(zhì)的均勻性檢驗(yàn)

凍干物質(zhì)均勻性檢驗(yàn)結(jié)果及其不確定度ubb的計(jì)算見表2。

4.3 維生素K1凍干物質(zhì)的穩(wěn)定性考察

長期穩(wěn)定性和短期穩(wěn)定性結(jié)果以及不確定度見表3和4。

表2 均勻性檢驗(yàn)結(jié)果 mg·mL-1

表3 長期穩(wěn)定性檢驗(yàn)結(jié)果 mg·mL-1

表4 短期穩(wěn)定性檢驗(yàn)結(jié)果 mg·mL-1

4.4 維生素K1凍干標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)不確定度評定

4.4.1 LC檢測復(fù)溶后凍干物質(zhì)濃度的不確定度

主要由維生素K1純品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的不確定度up和用LC多次檢測得到凍干物質(zhì)的濃度的相對不確定度uLC引入，根據(jù)式（2），

4.4.2 維生素K1凍干標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的不確定度

主要由定值不確定度、樣品均勻性不確定度、長期穩(wěn)定性不確定度、短期穩(wěn)定性不確定度引入，根據(jù)式（3）、式（4）：

相對擴(kuò)展不確定度

維生素 K1凍干標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值結(jié)果為0.96mg／mL，相對擴(kuò)展不確定度為7%（k=2）。

5 結(jié) 論

本文以DMSO為溶劑，利用冷凍干燥技術(shù)制備了維生素K1凍干標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，同時(shí)用其純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為標(biāo)準(zhǔn)，采用HPLC方法對凍干標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行了定值分析，使得到的結(jié)果準(zhǔn)確可靠。此外，還對維生素K1凍干標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行了均勻性檢驗(yàn)、穩(wěn)定性考察、不確定度評定，確保了用戶在不同時(shí)間、使用不同包裝的該種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)時(shí)，所使用的量值及不確定度都是準(zhǔn)確可靠的，制備得到樣品能長期保存，用戶使用時(shí)只需加入一定的DMSO復(fù)溶即可使用。對于維生素K1保存和準(zhǔn)確測定具有重要意義。

］

［1］ 李向榮，方曉，陳青俊，等.反相液相色譜法同時(shí)測定食物中維生素K1和K2［J］.營養(yǎng)學(xué)報(bào)，1988，20（1）：72-75.

［2］ 李云巧，王東冬.稀土溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制［J］.計(jì)量學(xué)報(bào)，2003，24（4）：348-351.

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［5］ Boss E A，F(xiàn)ilho R M，Coseelli E.Freeze drying process：real time model and optimization［J］.Chemical Engineering and Processing，2004，43（12）：1475-1485.

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［7］ Véronique D，Mickael P，F(xiàn)rancois L，et al.Quantitative determination of plasma vitamin K1by high-performance liquid chromatography coupled to isotope dilution tandem mass spectrometry［J］.Journal of analytical biochemistry，2010，401（1）：7-14.

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［9］ National Institute of Advanced Industrial Science and Technology（AIST），Japan，Spectral Database for Organic Compounds［DB］.http：／／sdbs.db.aist.go.jp／sdbs／cgi-bin／direct_frame_top.cgi，2014-03-14.

Development of a Certified Reference Material for Lyophilized Vitam in K1

ZHANG Xiao-guang1， HUANG Ting2， ZHANGWei2， HUANG Liang3，QUAN Can2， LIHong-mei2， YANG Yi1
（1.College of Science，Beijing University of Chemical Technology，Beijing 100029，China；2.National Institute of Metrology，Beijing 100029，China；3.Guangzhou Institute of Measuring and Testing Technology，Guangzhou，Guangdong 510030，China）

Dimethyl sulfone（DMSO）is firstly applied as the solvent for a lyophilized certified reference material（CRM）.Vitamin K1／DMSO solution is prepared by gravimetry，and is sub-divided and lyophilized，the lyophilized vitamin K1CRM is developed through qualitative analysis，quantitative analysis，homogeneity study，stability study and uncertainty evaluation.Certified value of lyophilization vitamin K1is analyzed by high performance liquid chromatography method，using the vitamin K1purity CRM as a calibrant.The certified value is0.96 mg／mL，with the relative expanded uncertainty of7%.Themethod of CRM lyophilized vitamin K1makes great significance for the accurate determination the disease in clinical examination and the long-term preservation of vitamin K1.

Metrology；Vitamin K1；Certified referencematerial；Lyophilized；Dimethyl sulfone；High performance liquid chromatography

TB99

：A

：1000-1158（2015）03-0333-04

10.3969／j.issn.1000-1158.2015.03.23

2014-03-14；

：2015-02-16

國家科技支撐計(jì)劃課題（2013BAK10B01）

張曉光（1988-），男，云南大理人，北京化工大學(xué)碩士生，主要從事分析化學(xué)方面的研究。zxg_4545＠126.com