王雪，甄璟然，孫正怡，郁琦，鄧成艷，周遠征，王含必，何方方

（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，北京協(xié)和醫(yī)院婦產(chǎn)科生殖中心，北京 100730）

近年來隨著胚胎培養(yǎng)液體系和培養(yǎng)環(huán)境的改善，越來越多的中心進行囊胚培養(yǎng)，而且為了避免多胎，開始嘗試單囊胚移植。囊胚培養(yǎng)過程中，囊胚的形態(tài)學(xué)評分非常重要。目前世界范圍內(nèi)主要采用的評分方法是Gardner的評分方法，該方法對囊胚的擴張狀態(tài)、內(nèi)細胞團和滋養(yǎng)層細胞進行評分［1］。β-人絨毛膜促性腺激素（β-HCG）是由囊胚的滋養(yǎng)層細胞分泌的一種糖蛋白類激素，當(dāng)胚胎在囊胚期著床后，合體滋養(yǎng)層細胞開始產(chǎn)生HCG。在臨床上β-HCG 是評估早期妊娠的重要指標(biāo)之一［2］。β-HCG最早可在受精后第6日的母體外周血中測出，在輔助生殖操作中，通常在患者進行胚胎移植后第7天后進行血清β-HCG 的檢測，以初步判斷妊娠情況［3］。本研究回顧性分析了2005年1月至2014年12月進行復(fù)蘇囊胚移植的患者臨床資料，分析囊胚Gardner評分中滋養(yǎng)層細胞的分級與移植后第7日血β-HCG 值和妊娠結(jié)局的關(guān)系，旨在探討Gardner評分對預(yù)測單囊胚移植的妊娠結(jié)局的價值，為將來的單囊胚移植提供理論依據(jù)。

資料和方法

一、研究對象

回顧性分析2005年1月至2014年12月在本生殖中心進行復(fù)蘇囊胚移植患者的臨床資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）新鮮周期的不育原因為：①輸卵管因素；②子宮內(nèi)膜異位癥及子宮腺肌癥；③男方因素；④排卵障礙（包括多囊卵巢綜合征等）；⑤不明原因不孕。（2）每次只移植1 枚囊胚。（3）復(fù)蘇囊胚移植后第7日查HCG 顯示生化妊娠者。排除移植2枚及以上胚胎的患者，排除HCG 日顯示未妊娠的患者。根據(jù)Gardner評分法，按照滋養(yǎng)層細胞的級別（A、B、C）分為三組，第一組定義為A 組，即滋養(yǎng)層細胞級別為A 級的患者；第二組定義為B 組，即滋養(yǎng)層細胞級別為B 級的患者；第三組為C 組，即滋養(yǎng)層細胞級別為C級的患者。

二、研究方法

1.體外受精（IVF）治療方案：所采用的超排卵方案按照本中心的常規(guī)進行，獲卵后根據(jù)患者情況采用自然授精或卵胞漿內(nèi)單精子注射（ICSI）授精，取卵24h后觀察受精情況，72h觀察卵裂球胚胎情況，根據(jù)胚胎評分情況決定移植，移植后剩余的胚胎經(jīng)患者知情同意后全部進行囊胚培養(yǎng)，在受精后第5日或第6日分別觀察囊胚形成情況及形態(tài)，并進行冷凍保存。

2.囊胚評分及冷凍標(biāo)準(zhǔn)：采用Gardner評分系統(tǒng)對囊胚進行評分［1］。首先根據(jù)囊腔擴張程度進行分期，囊腔不足胚胎的50%為1 期，囊腔超過胚胎的50%為2期，囊腔占滿整個胚胎為3 期，囊胚擴張透明帶變薄為4期，囊胚開始孵化為5期，囊胚完全孵出為6期，對4～6期的囊胚進一步評價。內(nèi)細胞團（inner cell mass，ICM）評分：A，細胞數(shù)目多，排列緊密；B，細胞數(shù)目較少，排列松散；C，細胞數(shù)目很少；滋養(yǎng)外胚層細胞（trophectoderm，TE）評分：A，細胞數(shù)目多，囊腔四周均有細胞，排列緊密；B，細胞數(shù)較少，排列較松；C，細胞數(shù)目很少。由于此前的觀察發(fā)現(xiàn)早期囊胚及孵出的囊胚冷凍后復(fù)蘇率不理想，因此本中心均在囊胚發(fā)育到4期時進行冷凍保存。挑選內(nèi)細胞團質(zhì)量達到A 或B 級的囊胚進行冷凍，C級的囊胚放棄，而滋養(yǎng)層細胞的質(zhì)量不限。

3.囊胚冷凍：本中心全部采用玻璃化冷凍方法進行胚胎冷凍。具體方法如以往文章所述［4-5］，囊胚冷凍之前進行人工皺縮，然后將囊胚放入含有7.5%（v／v）DMSO 和7.5%（v／v）乙二醇的預(yù)平衡液中平衡2min，之后將胚胎轉(zhuǎn)移入玻璃化冷凍液（15%（v／v）DMSO＋15%（v／v）乙二醇＋0.65mol／L蔗糖＋10mg／ml Ficoll）中平衡30s，將胚胎轉(zhuǎn)移至冷凍環(huán)（cryoloop環(huán)）上，直接浸入液氮保存。

4.胚胎復(fù)蘇：在凍融囊胚移植當(dāng)天進行。在囊胚復(fù)蘇之前，準(zhǔn)備囊胚復(fù)蘇液，在胚胎培養(yǎng)皿內(nèi)依次配制含有0.33mol／L的蔗糖溶液，0.2mol／L 的蔗糖溶液和基礎(chǔ)培養(yǎng)液（G-MOPS Plus，Vitrolife，瑞典），將含有囊胚的冷凍環(huán)從液氮中取出，在空氣中停留5s后，直接將胚胎浸入上述復(fù)蘇液中，時間依次為2min、3min和5min。將復(fù)蘇后的囊胚全部進行激光輔助孵化，選擇在遠離細胞團的透明帶上部位切割透明帶的1／4左右。將囊胚移入提前準(zhǔn)備好的囊胚培養(yǎng)液（G2，Vitrolife，瑞典）中，放入37℃、6%CO2和5%O2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2h，移植前評估胚胎的存活情況，囊胚腔重新擴張判斷為囊胚存活。

5.子宮內(nèi)膜準(zhǔn)備及胚胎移植：本研究中患者的子宮內(nèi)膜準(zhǔn)備方法分為兩種：（1）自然周期法：用于月經(jīng)周期規(guī)律，排卵正常的患者，在排卵前注射HCG 2 000U（艾澤，默克雪蘭諾，德國），之后超聲監(jiān)測到卵泡破裂后開始給予黃體支持，肌注黃體酮（浙江仙琚）20～40 mg／d，在排卵后第6 日移植胚胎。（2）人工周期法：月經(jīng)第2～4 日常規(guī)B 超檢查，口服戊酸雌二醇（補佳樂，先靈，德國），根據(jù)患者以往的內(nèi)膜情況，選擇不同的起始劑量（2～18mg／d）。B超監(jiān)測內(nèi)膜，當(dāng)內(nèi)膜厚度達到8mm 時肌注黃體酮（20mg×2d、40mg×2d、20～40mg×1d），第6日進行囊胚復(fù)蘇移植。胚胎移植均在B超引導(dǎo)下進行，每周期移植1個胚胎。移植后常規(guī)采用肌注黃體酮進行黃體支持。

6.妊娠結(jié)局的判斷：移植后第7 日測血清HCG＞5 U／L 則判斷為生化妊娠，若移植后25～30d超聲檢查，可見胎心和胎囊則判斷為臨床妊娠。移植后第7日判斷為生化妊娠而之后超聲檢查未見胎囊者定義為極早期妊娠丟失。確定臨床妊娠后發(fā)生流產(chǎn)的患者所占的比例，定義為流產(chǎn)率。將生化妊娠組和胚胎停育組定義為妊娠不良組，其余定義為繼續(xù)妊娠組，繼續(xù)妊娠組患者所占的比例稱為繼續(xù)妊娠率。

7.血清β-HCG 的測定：患者在進行凍融囊胚移植后第7日抽血，離心取血清測定血清β-HCG 的水平，測定方法為化學(xué)發(fā)光法，測定試劑盒為美國Beckman公司產(chǎn)品，操作按照說明書進行。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS22.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，進行t檢驗、卡方檢驗和Kruskal-Wallis非參的檢驗，并進行多因素Logistic回歸分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、一般情況

按照上述標(biāo)準(zhǔn)共納入201例患者，202 個凍融移植周期。復(fù)蘇囊胚205個，復(fù)蘇后1枚胚胎未擴張，丟棄，其余囊胚腔均擴張，復(fù)蘇成活率99.5%。另外有2例患者堅決要求移植1枚胚胎，將另外一枚丟棄。

二、復(fù)蘇周期資料比較

依據(jù)滋養(yǎng)層細胞級別分為A、B和C三組，其中納入的例數(shù)分別為35、104和63；三組患者的復(fù)蘇囊胚時年齡分別為（33.2±4.4）歲、（34.8±9.1）歲和（34.0±4.5）歲，三組間無顯著性差異；C 組胚胎的凍存時間（256.2±210）d，略低于A 組和B 組［（357.6±480.8）d、（367.5±474.5）d］，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。三組的內(nèi)膜準(zhǔn)備方案和移植日內(nèi)膜厚度均無明顯的統(tǒng)計學(xué)差異。根據(jù)滋養(yǎng)層細胞的評分，移植后第7 日血HCG 呈明顯的遞減趨勢，A 組、B 組和C 組分別為（288±433.1）U／L、（90.8±172.1）U／L、（60±102.9）U／L，且三組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（表1）。

表1 三組復(fù)蘇周期資料比較［（±s），n（%）］

表1 三組復(fù)蘇周期資料比較［（±s），n（%）］

注：與B、C組比較，＊P＜0.05

組 別 例數(shù) 年齡（歲） 胚胎凍存時間（d） 內(nèi)膜準(zhǔn)備方案（人工周期的比例）移植日內(nèi)膜厚度（cm）血清HCG（U／L）A 35 33.2±4.4 357.6±480.8 25／35（71.4） 0.9±0.1 288.0±433.1＊B 104 34.8±9.1 367.5±474.5 85／104（82.7） 1.1±0.1 90.8±172.1 C 63 34.0±4.5 256.2±210.0 55／63（87.3）1.0±0.1 60.0±102.9

三、妊娠結(jié)局比較

在C組中極早期妊娠丟失率為30.2%，明顯高于A 組 和B 組（分 別 為11.4%和9.6%）（P ＜0.05）。A 組的流產(chǎn)率略低于B 組和C 組，但無顯著性差異（P＞0.05）。把生化妊娠組和胚胎停育組定義為妊娠不良組，其余為繼續(xù)妊娠組，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析發(fā)現(xiàn)A 組和B 組的繼續(xù)妊娠率顯著高于C 組（P 均＜0.05），但A 和B組之間無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）（表2）。按照內(nèi)細胞團的A 和B級進行分組，發(fā)現(xiàn)兩組之間的妊娠結(jié)局無顯著性差異（表2）。將是否發(fā)生極早期妊娠丟失，確定臨床妊娠后是否發(fā)生流產(chǎn)和是否繼續(xù)妊娠作為因變量，內(nèi)細胞團、滋養(yǎng)層細胞的評分和年齡作為自變量進行Logistic回歸分析。我們發(fā)現(xiàn)滋養(yǎng)層細胞的質(zhì)量對極早期妊娠丟失率的影響最大，比值比（OR）為2.299，且有統(tǒng)計學(xué)意義（P＝0.012），而ICM 和年齡與極早期妊娠丟失率無顯著性相關(guān)。TE、ICM 和年齡與流產(chǎn)率無明顯的相關(guān)性。在分析繼續(xù)妊娠率時發(fā)現(xiàn)，滋養(yǎng)層細胞的質(zhì)量顯著影響繼續(xù)妊娠率（P＝0.017），而內(nèi)細胞團和年齡對繼續(xù)妊娠率無顯著影響（表3、4、5）。

表2 三組妊娠結(jié)局比較［n（%）］

表3 年齡、ICM 和TE對極早期妊娠丟失率影響的Logistic分析

表4 年齡、ICM 和TE對流產(chǎn)率影響的Logistic分析

表5 年齡、ICM 和TE對繼續(xù)妊娠率影響的Logistic分析

討 論

囊胚在體外培養(yǎng)過程中經(jīng)歷了胚胎的再次選擇，因此囊胚移植能夠達到更高的妊娠率和活產(chǎn)率。但是怎樣挑選囊胚是目前面臨的主要問題。囊胚的形態(tài)學(xué)評分是應(yīng)用最多的無創(chuàng)性評價方法。目前應(yīng)用最廣泛的是1999年Gardner等［1］提出的囊胚評分法。此評分體系需要對囊胚的三個參數(shù)進行評估，包括囊胚腔的擴張程度（分為1～6級），內(nèi)細胞團質(zhì)量（根據(jù)細胞的數(shù)量和緊密程度分為A、B 和C）和滋養(yǎng)層細胞質(zhì)量（根據(jù)細胞的數(shù)量和緊密程度分為A、B和C）。有研究提示囊胚的擴張程度對囊胚的種植非常重要［6-7］。但也有研究發(fā)現(xiàn)胚胎的擴張程度與妊娠結(jié)局無明顯的相關(guān)性［6］。在我們之前的研究中，發(fā)現(xiàn)4期的囊胚冷凍復(fù)蘇后復(fù)蘇成活率最高，而且冷凍復(fù)蘇后胚胎的質(zhì)量幾乎沒有明顯變化，因此我們在囊胚發(fā)育到4期后再進行冷凍保存。因此本研究沒有分析囊胚的擴張程度與妊娠的關(guān)系。另外，在胚胎培養(yǎng)過程中多數(shù)囊胚的內(nèi)細胞團質(zhì)量都為A 或B級，極少數(shù)形成C 級的囊胚，若內(nèi)細胞團質(zhì)量為C 級時，胚胎的種植潛能極差，因此在挑選胚胎冷凍時放棄內(nèi)細胞團質(zhì)量為C 級的胚胎。在本研究中所有胚胎質(zhì)量均為4AX 或4BX，因此，在本文中我們著重分析滋養(yǎng)層細胞與妊娠早期β-HCG與妊娠的關(guān)系。

在本研究中只挑選復(fù)蘇單囊胚移植后第7日查血顯示生化妊娠陽性的患者來分析，發(fā)現(xiàn)三組血清β-HCG 的水平有明顯的統(tǒng)計學(xué)差異，隨著滋養(yǎng)層細胞級別的降低，移植后第7日血清β-HCG 的水平顯著降低?？梢奊aredner評分法與移植后第7日血清β-HCG 值相一致。早期的研究證實在胚胎的發(fā)育過 程 中β-HCG 的 分 泌 很 早［8］，1999 年Andrea等［9］證實2-細胞階段胚胎已經(jīng)出現(xiàn)β-HCG mRNA表達，其表達量隨胚胎發(fā)育快速、穩(wěn)定增加。有研究顯示在受精后第6日，囊胚的滋養(yǎng)外胚層細胞開始分泌微量HCG，HCG 的產(chǎn)生直接與滋養(yǎng)層細胞的數(shù)量和發(fā)育有關(guān)，被認(rèn)為是早期預(yù)測妊娠結(jié)局的一個最有價值的生化指標(biāo)，而且隨著胚胎滋養(yǎng)層細胞數(shù)目的增加和進一步發(fā)育，其分泌β-HCG 能力顯著增強［10］。但是不是β-HCG 的水平越高胚胎質(zhì)量越好，還有待于進一步研究。眾所周知，囊胚最早分化出兩種不同類型的細胞，一種為內(nèi)細胞團細胞，將來發(fā)育為胎兒部分，另一部分為滋養(yǎng)層細胞，將來發(fā)育為胎兒的胎盤。滋養(yǎng)層細胞在胚胎移植后胚胎的種植早期發(fā)揮了重要作用，包括HCG 介導(dǎo)的信號通路，胚胎從透明帶中孵出，胚胎的粘附和侵入子宮內(nèi)膜以及與母胎對話等［11-14］，所有的這些功能對一次成功妊娠的穩(wěn)定和防止流產(chǎn)都是非常重要的。

囊胚的Gardner評分系統(tǒng)在世界范圍內(nèi)已經(jīng)應(yīng)用了10多年，已經(jīng)有一些研究來分析囊胚的評價參數(shù)與妊娠結(jié)局的關(guān)系。關(guān)于囊胚期別對妊娠結(jié)局的影響存在很多爭議，本研究都是利用的4期囊胚，因此尚未探討囊胚期別對妊娠結(jié)局的影響。有研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)細胞團質(zhì)量與妊娠結(jié)局呈正相關(guān)，認(rèn)為內(nèi)細胞團是將來發(fā)育為胎兒的部分，對妊娠結(jié)局更重要［15-17］。也有研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)細胞團的質(zhì)量與妊娠結(jié)局無明顯的相關(guān)性［18-19］。在本研究中，發(fā)現(xiàn)內(nèi)細胞團為A 或B時，兩組的極早期妊娠丟失率、流產(chǎn)率和繼續(xù)妊娠率均無明顯的統(tǒng)計學(xué)差異，而且在做回歸分析時也未發(fā)現(xiàn)內(nèi)細胞團質(zhì)量與極早期妊娠丟失率和繼續(xù)妊娠率有相關(guān)性，也可能是與我們囊胚評分有關(guān)，因為我們在新鮮周期進行囊胚冷凍時，考慮到內(nèi)細胞團質(zhì)量太差，質(zhì)量為C 級的囊胚可能會影響將來胎兒的發(fā)育，在本中心這類囊胚均未進行冷凍，因此可能會存在一定的誤差。近年來很多研究發(fā)現(xiàn)，滋養(yǎng)層細胞的形態(tài)學(xué)能夠預(yù)測IVF 的妊娠結(jié)局，發(fā)現(xiàn)TE的形態(tài)學(xué)與胚胎的種植率、妊娠率呈正相關(guān)［18，20］；Ahlstr?m 等［18］認(rèn) 為TE 的 形 態(tài) 學(xué) 與 活產(chǎn)率呈明顯的正相關(guān)；Honnma等［19］發(fā)現(xiàn)TE 的形態(tài)學(xué)與繼續(xù)妊娠率呈明顯的正相關(guān)。這與我們的研究結(jié)論相似，我們發(fā)現(xiàn)隨著滋養(yǎng)層細胞的評分降低，極早期妊娠丟失率明顯升高，而繼續(xù)妊娠率明顯降低。在本回歸分析中，若調(diào)整ICM 和年齡等混雜因素后發(fā)現(xiàn)，隨著TE 的形態(tài)與極早期妊娠丟失率和繼續(xù)妊娠率呈明顯的相關(guān)性，但是內(nèi)細胞團和年齡與極早期妊娠丟失率和繼續(xù)妊娠率均無相關(guān)性。分析原因可能與以下幾點相關(guān)：①TE 細胞能夠產(chǎn)生HCG，而且高級別的滋養(yǎng)層細胞分泌HCG 時間更早，分泌量更多，HCG 能夠刺激黃體合成和分泌更多孕激素，能夠調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜對植入胚胎的容受性，HCG 在母胎對話和成功維持妊娠中發(fā)揮著重要作用［12，22］。②Parks等［14］對 滋 養(yǎng) 層 細 胞 進 行 活 檢 發(fā)現(xiàn)，每一個囊胚的基因表達情況與其結(jié)局相關(guān)，包括胚胎種植以及妊娠丟失等。另外，Alfarawati等［13］發(fā)現(xiàn)滋養(yǎng)層細胞非整倍體的發(fā)生率與囊胚的形態(tài)呈明顯的相關(guān)性。他們發(fā)現(xiàn)與滋養(yǎng)層細胞A 級相比，滋養(yǎng)層細胞C 級胚胎發(fā)生非整倍體的比例增加2.5倍，他們認(rèn)為挑選高質(zhì)量的囊胚可以避免嚴(yán)重的染色體異常，從而減少流產(chǎn)率。這也比較好地解釋了為什么滋養(yǎng)層細胞質(zhì)量越差，越容易發(fā)生極早期妊娠丟失。

總之，本研究利用復(fù)蘇單囊胚移植，進一步證實了Gardner囊胚評分系統(tǒng)的應(yīng)用與臨床結(jié)局的關(guān)系，我們發(fā)現(xiàn)挑選高質(zhì)量滋養(yǎng)細胞的囊胚能夠避免極早期妊娠丟失，能夠提高繼續(xù)妊娠率。當(dāng)然，本研究還有一定的局限性，如本研究中內(nèi)細胞團的評分只有A 和B，可能存在一定的偏倚，還有待于進一步的研究。

［1］ Gardner DK，Lane M，Stevens J，et al.Blastocyst score affects implantation and pregnancy outcome：towards a single blastocyst transfer［J］.Fertil Steril，2000，73：1155-1158.

［2］ Delbaere I，Vansteelandt S，Gerris J，et al.Human chorionic gonadotropin levels in early IVF／ICSI pregnancies are higher in singletons after single embryo transfer compared with singletons after double embryo transfer［J］.Hum Reprod，2008，23：2421-2426.

［3］ Carmona F，Balasch J，Creus M，et al.Early hormonal markers of pregnancy outcome after in vitro fertilization and embryo transfer［J］.J Assist Reprod Genet，2003，20：521-526.

［4］ 甄璟然，王雪，孫正怡，等.復(fù)蘇單囊胚移植周期中囊胚形態(tài)學(xué)評分對臨床妊娠的影響［J］.生殖醫(yī)學(xué)雜志，2014，23：7-10.

［5］ 王雪，甄璟然，孫正怡，等.囊胚發(fā)育速度對凍融移植結(jié)局的影響［J］.生殖醫(yī)學(xué)雜志，2014，23：356-360.

［6］ Van den Abbeel E，Balaban B，Ziebe S，et al.Association between blastocyst morphology and outcome of singleblastocyst transfer［J／OL］.Reprod Biomed Online，2013，27：353-361.

［7］ Shapiro BS，Daneshmand ST，Garner FC，et al.Large blastocyst diameter，early blastulation，and low preovulatory serum progesterone are dominant predictors of clinical pregnancy in fresh autologous cycles［J］.Fertil Steril，2008，90：302-309.

［8］ Lopata A，Hay DL.The potential of early human embryos to form blastocysts，hatch from their zona and secrete HCG in culture［J］.Hum Reprod，1989，4：87-94.

［9］ Jurisicova A，Antenos M，Kapasi K，et al.Variability in the expression of trophectodermal markers beta-human chorionic gonadotrophin，human leukocyte antigen-G and pregnancy specific beta-1 glycoprotein by the human blastocyst［J］.Hum Reprod，1999，14：1852-1858.

［10］ Poikkeus P，Hiilesmaa V，Tiitinen A.Serum HCG 12days after embryo transfer in predicting pregnancy outcome［J］.Hum Reprod，2002，17：1901-1905.

［11］ Jones GM，Cram DS，Song B，et al.Novel strategy with potential to identify developmentally competent IVF blastocysts［J］.Hum Reprod，2008，23：1748-1759.

［12］ Tsampalas M，Gridelet V，Berndt S，et al.Human chorionic gonadotropin：a hormone with immunological and angiogenic properties［J］.J Reprod Immunol，2010，85：93-98.

［13］ Alfarawati S，F(xiàn)ragouli E，Colls P，et al.The relationship between blastocyst morphology，chromosomal abnormality，and embryo gender［J］.Fertil Steril，2011，95：520-524.

［14］ Parks JC，McCallie BR，Janesch AM，et al.Blastocyst gene expression correlates with implantation potential［J］.Fertil Steril，2011，95：1367-1372.

［15］ Richter KS，Harris DC，Daneshmand ST，et al.Quantitative grading of a human blastocyst：optimal inner cell mass size and shape［J］.Fertil Steril，2001，76：1157-1167.

［16］ Goto S，Kadowaki T，Tanaka S，et al.Prediction of pregnancy rate by blastocyst morphological score and age，based on 1 488single frozen-thawed blastocyst transfer cycles［J］.Fertil Steril，2011，95：948-952.

［17］ Zhang H，Zhou Y，Li Y，et al.Prediction of clinical pregnancy in vitrified-warmed single blastocyst transfer cycles by prefreeze morphology［J］.Iran J Reprod Med，2014，12：567-572.

［18］ Ahlstr?m A，Westin C，Reismer E，et al.Trophectoderm morphology：an important parameter for predicting live birth after single blastocyst transfer［J］.Hum Reprod，2011，26：3289-3296.

［19］ Honnma H，Baba T，Sasaki M，et al.Trophectoderm morphology significantly affects the rates of ongoing pregnancy and miscarriage in frozen-thawed single-blastocyst transfer cycle in vitro fertilization［J］.Fertil Steril，2012，98：361-367.

［20］ Hill MJ，Richter KS，Heitmann RJ，et al.Trophectoderm grade predicts outcomes of single-blastocyst transfers［J］.Fertil Steril，2013，99：1283-1289.

［21］ Licht P，Russu V，Wildt L.On the role of human chorionic gonadotropin （hCG ） in the embryo-endometrial microenvironment：implications for differentiation and implantation［J］.Semin Reprod Med，2001，19：37-47.