黃霞，潘興華，龐榮清，蔡學(xué)敏，阮光萍

樹鼩2型糖尿病模型的構(gòu)建及其相關(guān)因素分析

黃霞，潘興華，龐榮清，蔡學(xué)敏，阮光萍

目的為干細(xì)胞治療研究構(gòu)建2型糖尿?。═2DM）樹鼩模型，并對相關(guān)因素進(jìn)行分析。方法采用高糖、高脂飼喂聯(lián)合腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ）100mg/kg方法構(gòu)建樹鼩T2DM模型。造模后第6 w腹腔注射STZ，在注射STZ前和注射后的每2 w，測定空腹血糖（FBG）、胰島素（FINS）、C肽、胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、糖化血紅蛋白（HbA1c）、口服葡萄糖耐量試驗(yàn)（OGTT）等指標(biāo)；自造模后的第8、16 w，觀察胰腺、肝、腎臟的病理組織形態(tài)變化，檢測血清TNF-α、IL-6表達(dá)水平。結(jié)果造模后，F(xiàn)BG持續(xù)升高，F(xiàn)INS、C肽先升高后下降，出現(xiàn)胰島素抵抗；TG和TC在造模后持續(xù)升高，12 w后穩(wěn)定在較高水平；肝、腎、胰腺器官表現(xiàn)為特征性的病理變化，且血清中TNF-α和IL-6增高。結(jié)論飼喂高糖、高脂飼料+腹腔注射STZ成功構(gòu)建樹鼩T2DM模型，出現(xiàn)T2DM特征性病理變化，炎癥細(xì)胞因子可能參與了T2DM的病理過程。

樹鼩；2型糖尿?。绘滊遄艟?；模型

2型糖尿病（T2DM）是以胰島素抵抗、胰島素敏感性下降和糖、脂代謝紊亂為特征的代謝性疾病[1]。研究發(fā)現(xiàn)，鏈脲佐菌素（Streptozocin,STZ）有針對性地破壞胰島β細(xì)胞，可誘導(dǎo)糖尿病的產(chǎn)生[2]。目前對T2DM進(jìn)行了大量的研究，但結(jié)果差異較大。樹鼩是靈長類動(dòng)物的近親[3]，易于模擬人類T2DM的病理過程。本研究擬通過注射STZ來創(chuàng)建樹鼩T2DM模型，并動(dòng)態(tài)觀察模型樹鼩一般情況、生化、病理及細(xì)胞因子與臨床的符合程度，分析相關(guān)因素，以期為干細(xì)胞治療研究提供較穩(wěn)定的樹鼩T2DM模型。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物健康樹鼩48只，由中國科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，為中緬樹鼩滇西亞種，體重120~140 g。動(dòng)物房內(nèi)常年保持通風(fēng)換氣、清潔。

1.2 材料與儀器STZ（Sigma公司）；Human IL-6 ELISA Kit和Human TNF-αELISA Kit（聯(lián)科生物技術(shù)有限公司）；微量血糖儀（羅氏公司G10592137型）。

1.3 試劑配制方法A液：檸檬酸4.2 g加水至200m l；B液：檸檬酸鈉5.88 g加水至200 ml；A液和B液按56%和44%的比例混合，調(diào)節(jié)pH值在4.2~4.3，0.22μm過濾器除菌，4℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆?。基礎(chǔ)飼料和高糖、高脂飼料均由昆明醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物室研究配置。

1.4 T2DM模型制作動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)2 w，檢測HbA1c、空腹血糖水平（FBG）、空腹胰島素水平（FINS）、C肽、TC、TG及胰島素抵抗指數(shù)（HOMAIR）正常后納入實(shí)驗(yàn)。將48只動(dòng)物隨機(jī)分為2組，對照組8只、實(shí)驗(yàn)組40只。對照組以基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)；實(shí)驗(yàn)組每天上午8點(diǎn)開始定時(shí)定量飼喂高糖、高脂飼。兩組均一日三餐，中間加喂1次蘋果，定量飲水。飼喂6 w后，實(shí)驗(yàn)組禁食不禁水12 h，然后腹腔注射STZ 100mg/kg，對照組注射等量生理鹽水。注射后72 h測FBG，實(shí)驗(yàn)組低于11.1mol/L者再腹腔注射STZ（100mg/kg）1次。自造模起觀察記錄樹鼩精神狀態(tài)、活動(dòng)度、毛色、飲食、排泄等情況。

1.5 檢測指標(biāo)

1.5.1 FBG自造模后第6 w開始，每隔2 w，動(dòng)物禁食12 h，次日尾尖取血，羅氏微量血糖儀測量FBG。另外，采集1ml尾靜脈血，由本院檢驗(yàn)科測定TC、TG、FINS、HbA1c、C肽水平。HOMA-IR=FBG（mmol/L）×FINS（m IU/L）/22.5。

1.5.2 口服葡萄糖耐量試驗(yàn)（OGTT）自造模后第8、16 w，兩組均禁食12 h，測定FBG；稱體重后，用50%葡萄糖3.59 ml/kg灌胃，灌胃后15、30、60、90min樹鼩尾尖采血測定血糖水平。

1.5.3 IL-6、TNF-α兩組均于第8、16 w尾靜脈釆血1 ml，離心收集血清，按ELISA試劑盒說明書方法操作，測定IL-6、TNF-α水平。

1.6 病理組織學(xué)分析造模后16 w，兩組動(dòng)物各脫頸處死2只，分別取胰腺、肝臟、腎臟組織，4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟切片，HE染色，光鏡下觀察并照相。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，組內(nèi)采用單因素方差分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 T2DM模型制作情況在腹腔注射STZ 1~2次后，造模成功率90%。對照組8只動(dòng)物狀態(tài)良好，無死亡；實(shí)驗(yàn)組40只動(dòng)物有4只死亡，并可見多飲、多食、多尿、消瘦，毛無光澤，晚期尾部、腿部有潰瘍形成。

2.2 兩組FBG、FINS、C肽、HOMA-IR、TG、TC、體重、OGTT的變化實(shí)驗(yàn)組FBG在注射STZ后持續(xù)升高（12.5~22.9 mmol/L），與對照組比較差異顯著（P﹤0.05），對照組整個(gè)研究過程中FBG變化不大（2.9~3.0mmol/L）；FINS、C肽、HOMA-IR在實(shí)驗(yàn)組顯著升高，第6 w時(shí)達(dá)到高峰，之后逐漸降至接近對照組水平（P﹤0.05）；與對照組比較，實(shí)驗(yàn)組TG和TC在造模后持續(xù)升高（P﹤0.05），12 w后穩(wěn)定在較高水平；體重在造模后先上升（P﹤0.05）后下降，到16 w時(shí)低于對照組（P﹤0.05），符合T2DM模型的特點(diǎn)。見圖1。

高糖、高脂喂養(yǎng)8 w、16 w時(shí)檢測OGTT，實(shí)驗(yàn)組血糖頂峰均在5 min出現(xiàn)，對照組血糖高峰在10 min出現(xiàn)，而后迅速下降，90min后降至正常水平；與對照組比較，實(shí)驗(yàn)組8 w時(shí)血糖頂峰過后迅速下降，16 w血糖頂峰過后下降稍緩慢，90 min后兩組血糖均未下降到正常水平。見圖2。

圖1 兩組FBG、FINS、C肽、HOMA-IR、TG、TC、體重的動(dòng)態(tài)變化

圖2 兩組OGTT的動(dòng)態(tài)變化

2.3 T2DM樹鼩HbA1c的變化HbA1c在臨床實(shí)踐中被用作糖尿病患者血糖控制的金標(biāo)準(zhǔn)，其優(yōu)勢在于可反映受檢者近2~3個(gè)月的平均血糖。在造模前0 w和造模后16 w，對照組HbA1c分別為(4.71±0.22 )mmol/L和(4.39±0.49)mmol/L，均＜5mmol/L，實(shí)驗(yàn)組HbA1c分別為(4.95±0.80)mmol/L和(8.01±0.50)mmol/L，均＞7 mmol/L，說明實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在造模前無自發(fā)性糖尿病存在，而實(shí)驗(yàn)組16 w時(shí)，發(fā)生糖尿病。

2.4 T2DM樹鼩肝臟、腎臟及胰腺的病理學(xué)變化與對照組比較，實(shí)驗(yàn)組樹鼩肝臟肝索混亂、腫脹、萎縮，呈脂肪變性和空泡變性，嵴斷裂，可見點(diǎn)狀壞死，匯管區(qū)有炎細(xì)胞浸潤。腎小球體積增大、髓袢腔擴(kuò)張、系膜增生和硬化、基底膜增厚、內(nèi)皮細(xì)胞泡沫樣變，出入球動(dòng)脈透明樣變以及間質(zhì)血管損傷，毛細(xì)血管基底膜增厚，腎小囊腔狹窄。實(shí)驗(yàn)組胰島萎縮，形態(tài)極不規(guī)則，胰島細(xì)胞數(shù)目減少，周圍結(jié)締組織和基膜不完整，胰島細(xì)胞腫脹，空泡增多，細(xì)胞核固縮，染色質(zhì)分布不均、部分細(xì)胞核缺失，細(xì)胞容積減低，胞漿變淺，胞核固縮，部分胰島細(xì)胞壞死。見圖3。

2.5 TNF-α及IL-6在T2DM樹鼩血清中的變化

實(shí)驗(yàn)組8 w及16 w的TNF-α及IL-6的表達(dá)均較對照組升高（P﹤0.05，圖4）。

圖4 兩組不同時(shí)間血清TNF-α及IL-6的比較

3 討論

糖尿病與細(xì)胞免疫和體液免疫異常有很高的關(guān)聯(lián)度[4]。本研究所采用的高糖高脂飼料喂養(yǎng)聯(lián)合腹腔內(nèi)注射STZ的方法，成模率高達(dá)90%，病程接近自然，病死率低，模型穩(wěn)定，STZ腹腔注射保證了動(dòng)物模型的成功率[5]。本研究實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物喂養(yǎng)6 w后，已經(jīng)出現(xiàn)明顯的胰島素抵抗，此時(shí)給予STZ腹腔注射，在后續(xù)的相關(guān)因素觀察中，未出現(xiàn)傾向于T1DM及病死率增加，這與之前的研究有所出入，可能是物種的不同對高糖、高脂飼料的反應(yīng)不同所致[6]。另外，長期高糖、高脂能誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生胰島素抵抗，其機(jī)制可能是高脂、高膽固醇、高糖飲食導(dǎo)致體內(nèi)葡萄糖和脂質(zhì)代謝的紊亂，降低胰島素敏感性，聯(lián)合小劑量STZ腹腔內(nèi)注射可導(dǎo)致胰腺分泌胰島素功能的進(jìn)一步障礙，誘發(fā)高血糖，導(dǎo)致T2DM[7]。

圖3 樹鼩肝臟、腎臟及胰腺的病理學(xué)變化（HE染色×400）

T2DM的特點(diǎn)包括胰島素抵抗和糖代謝紊亂，以及脂肪和蛋白質(zhì)代謝紊亂。本研究發(fā)現(xiàn)，造模后，動(dòng)物血糖顯著升高，而胰島素、C肽呈先升高后下降的變化，出現(xiàn)有明顯的胰島素抵抗。同時(shí)，總膽固醇、甘油三酯持續(xù)升高，12 w后穩(wěn)定在一個(gè)較高的水平。另外，肝臟、腎、胰腺均出現(xiàn)較明顯的T2DM對靶器官的損傷。這些均提示T2DM造模成功。C肽可作為評定胰島功能的指標(biāo)，彌補(bǔ)單獨(dú)應(yīng)用血糖的不足，較胰島素更能準(zhǔn)確反映β細(xì)胞的分泌能力，可作為檢測胰島素內(nèi)源性分泌評價(jià)指標(biāo)[8]。脂代謝紊亂是T2DM糖代謝異常的始動(dòng)因素，機(jī)制可能是T2DM胰島素的降低及IR使脂蛋白脂肪酶活性低下，肝臟合成TG的速度大于釋放的速度，進(jìn)入血液循環(huán)中的TG不能被及時(shí)消除，導(dǎo)致TG在肝內(nèi)堆積而形成高甘油三酯血癥[9]。本研究也發(fā)現(xiàn)，血糖、總膽固醇及甘油三酯雖然高峰不在同一時(shí)間點(diǎn)上，但總體水平均隨T2DM的進(jìn)展而不斷升高，它們之間存在相互促進(jìn)、互為因果的關(guān)系。

近年來認(rèn)為，T2DM是一種先天性免疫和低度慢性炎癥性疾病[10]。TNF-α與IL-6作為最具代表性的細(xì)胞因子，在炎癥和免疫反應(yīng)中起核心調(diào)節(jié)作用。在DM的發(fā)病過程中，TNF-α與IL-6反應(yīng)性升高可導(dǎo)致包括胰島在內(nèi)的全身性炎癥反應(yīng)和加速胰島β細(xì)胞的破壞。本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，這兩個(gè)因子在實(shí)驗(yàn)組較對照組顯著升高。

本研究建立的樹鼩T2DM模型的血液生化指標(biāo)、細(xì)胞因子及肝、腎、胰腺結(jié)構(gòu)變化與臨床T2DM的病變特點(diǎn)及病理過程相符合，與人類T2DM高度相似，可作為干細(xì)胞治療T2DM的動(dòng)物模型。

[1]Halperin F,Lopez X,Manning R,et al.Insulin augmentation of glucose-stimulated insulin secretion is impaired in insulinresistant humans[J].Diabetes,2012,61(2):301-309.

[2]朱超,朱瑩瑩.Ⅱ型糖尿病動(dòng)物模型的構(gòu)建[J].中國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào),2013,21(2):84-88.

[3]Schmelting B,Corbach-Sohle S,Kohlhause S,et al.Agomelatine in the tree shrew model of depression:effects on stress-induced nocturnal hyperthermia and hormonal status[J].Eur Neuropsychopharmacol,2014,24(3):437-447.

[4]Yang W,Lu J,Weng J,et al.Prevalence of diabetes amongmen and women in China[J].N Engl JMed,2010,362(12):1090-1101.

[5]De Oliveira AC,Andreotti S,Farias Tda S,et al.Metabolic disorders and adipose tissue insulin responsiveness in neonatally STZ-induced diabetic rats are improved by long-term melatonin treatment[J].Endocrinology,2012,153(5):2178-2188.

[6]吳曉云,李昀海,常青,等.鏈脲佐菌素誘導(dǎo)樹鼩2型糖尿病[J].動(dòng)物學(xué)研究,2013,34(2):108-115.

[7]王春田,王莉,石巖.2型糖尿病動(dòng)物模型制備方法探討[J].實(shí)用中醫(yī)內(nèi)科雜志,2011,25(4):27-30.

[8]Fu F,Tian F,Zhou H,et al.Semen cassiae attenuatesmyocardial ischemia and reperfusion injury in high-fat diet streptozotocininduced type 2 diabetic rats[J].Am J Chin Med,2014,42(1): 95-108.

[9]Hussein AA,Abdel-Aziz A,Gabr M,et al.Myocardial and metabolic dysfunction in type 2 diabetic rats:impact of ghrelin [J].Can JPhysiol Pharmacol,2012,90(1):99-111.

[10]Donath MY,Shoelson SE.Type 2 diabetes as an inflammatory disease[J].Nature Reviews Immunology,2011,11(2):98-107.

Construction of type 2 diabetesmellitusmodel of tree shrews and analysis of related factors

Huang Xia,Pan Xinghua,Pang Rongqing,Cai Xuemin,Ruan Guangping Cell Biological Therapy Center of Kunming General Hospital of Chengdu Military Command/Clinical College of Kunming General Hospital,Kunming Medical University/The Nation and Region Integrated Engineering Laboratory of Stem Cell and Immunocyte Biological Technology/Key Laboratory of Cell Therapeutic Transforming Medicine of Yunnan Province/Stem Cell Engineering Laboratory of Yunnan Province/Kunming Key Laboratory of Stem Cell and Regenerative Medicine,Kunming,Yunnan,650032,China

Objective To establish tree shrew type 2 diabetesmellitus(T2DM)model for the research on stem cell therapy,and to analyze the related factors.Methods T2DM model was established by the feeding with high sugar and fat combined with intraperitoneal injection with 100mg/kg streptozotocin(STZ).The intraperitoneal injection with STZ was carried out at the 6th week after themodeling,and every two weeks before and after the injection,fasting blood glucose(FBG),FINS,C peptide,HOMA-IR,total cholesterol,triglyeride,glycosylated hemoglobin,and oral glucose tolerance were detected.Since the 8th and 16th week after the modeling,observation was made in the changes in the pathological tissues of pancreas,liver,and kidney,and TNF-αand IL-6 expression levelswere detected.Results After themodeling,FBG continuously increased,while FINSand C peptide firstly increased and then decreased.Insulin resistance occurred.Meanwhile,TG and TC continuously increased after themodeling and reached to a stable high level after 12 weeks.Liver,kidney,and pancreas all showed distinctive pathological changes,and TNF-αand IL-6 increased in serum.Conclusion T2DM model is successfully established by the feeding with high sugar and fat combined with intraperitoneal injection with STZ.T2DM distinctive pathological changes occur.Inflammatory factorsmay be involved in the T2DM pathological process.

tree shrew;type 2 diabetes;streptozotocin;model

R 587.1

A

1004-0188（2015）08-0834-04

10.3969/j.issn.1004-0188.2015.08.008

2015-03-26）

國家973計(jì)劃項(xiàng)目（2012CB5181060）;國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31172170);云南省科技計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(2013CA005）

650032昆明,成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院細(xì)胞生物治療中心，昆明醫(yī)科大學(xué)昆明總醫(yī)院臨床學(xué)院,干細(xì)胞與免疫細(xì)胞生物醫(yī)藥技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室,云南省細(xì)胞治療技術(shù)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南省干細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室，昆明市干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

潘興華，E-mail：xinghuapan@sohu.com.cn