何潔，趙晶，王金祥，蔡學(xué)敏，龐榮清，潘興華

多次貼壁法高效制備人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞

何潔，趙晶，王金祥，蔡學(xué)敏，龐榮清，潘興華

目的建立一套簡單、高效、穩(wěn)定、規(guī)范的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞體外制備與鑒定技術(shù)，為人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞庫建設(shè)及臨床應(yīng)用提供技術(shù)規(guī)范。方法改進(jìn)前期技術(shù)方法，重復(fù)驗(yàn)證，建立規(guī)范化技術(shù)方法。無菌采集足月剖宮產(chǎn)分娩胎兒臍帶，采用不剝離血管和包膜組織貼壁法培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。待原代細(xì)胞長出時(shí)，收集原本換液應(yīng)丟棄的組織塊，進(jìn)行二次貼壁培養(yǎng)，如此反復(fù)，待二次貼壁組織塊長出細(xì)胞時(shí)，收集組織塊進(jìn)行三次貼壁培養(yǎng)。對三次貼壁培養(yǎng)長出的第三代細(xì)胞進(jìn)行生物學(xué)特性分析。結(jié)果首次組織貼壁后10～12 d可見成纖維樣細(xì)胞從組織塊爬出，二次、三次貼壁后第2 d就可見成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞爬出，且生長狀況好，細(xì)胞形態(tài)更為均一。三次貼壁培養(yǎng)的第三代細(xì)胞都高表達(dá)CD29、CD44、CD90和CD105，不表達(dá)CD34和CD45。細(xì)胞生長曲線呈“S”型，均具有成脂、成骨、成軟骨分化的能力。結(jié)論采用多次貼壁法制備的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞充分利用了臍帶組織塊，且得到的原代細(xì)胞數(shù)量翻倍，其生物學(xué)特性穩(wěn)定。

臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞；分離；貼壁培養(yǎng)

臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(umbilical cord mesenchymal stem cell，UC-MSC)可廣泛用于各種損傷和退變性疾病治療，因其具有材料來源豐富、適于標(biāo)準(zhǔn)化制備、臨床應(yīng)用免疫原性低等特點(diǎn)，將成為未來干細(xì)胞臨床應(yīng)用的理想選擇。Mitchell等[1]首次從臍帶華通膠中分離出成纖維樣細(xì)胞，并且證實(shí)具有多向分化潛能后，人們采用組織塊法、酶消化法和兩者結(jié)合的酶組織法均分離得到UC-MSC，并且已證明在體外能分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、心肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等多種細(xì)胞[2-3]。通過比較后分析，3種方法各有利弊。涉及UC-MSC的臨床應(yīng)用，必須建立簡單、高效、穩(wěn)定、規(guī)范的原代UC-MSC制備與鑒定技術(shù)，獲得足夠數(shù)量并符合臨床要求的標(biāo)準(zhǔn)化UC-MSC，才能保證臨床應(yīng)用的安全性和有效性。本研究通過對前期建立的UC-MSC制備技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)和重復(fù)實(shí)驗(yàn)，建立了組織塊二次、三次貼壁培養(yǎng)法，充分利用了臍帶組織塊，大大提高了原代細(xì)胞的產(chǎn)量，縮短了培養(yǎng)時(shí)間，為臨床研究和應(yīng)用提供了充足的標(biāo)準(zhǔn)化種子細(xì)胞和技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料來源在征得產(chǎn)婦和家屬知情同意的情況下，在本院婦產(chǎn)科產(chǎn)房取健康足月剖腹生產(chǎn)的新生兒臍帶。產(chǎn)婦無傳染性疾病、遺傳病史，胎兒無先天性疾病。

1.2 主要試劑和設(shè)備DMEM/F12培養(yǎng)液為Hyclone公司產(chǎn)品，胎牛血清（FBS）和0.25%trypsin-EDTA均為BI公司產(chǎn)品；MTS檢測試劑盒為Promega公司生產(chǎn)；流式單抗CD29-FITC、CD34-PE、CD44-FITC、CD45-PC5、CD90-FITC和CD105-PE均為Beckman公司生產(chǎn)；成脂、成骨、成軟骨分化誘導(dǎo)試劑盒均是GIBCO公司產(chǎn)品；流式細(xì)胞儀為Beckman公司生產(chǎn)。

1.3 UC-MSC的分離培養(yǎng)在無菌條件下，將采集的臍帶用含100 U/ml青霉素、100 mg/ml鏈霉素的PBS液反復(fù)沖洗，去掉殘留的血液。然后將臍帶分解為1 mm3的組織塊，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，加入少許含有10%FBS的DMEM/F12使其均勻分布，于5%CO2、37℃的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。5 d后初次換液，而后3~4 d換液，觀察組織貼壁生長狀況。待細(xì)胞從組織塊爬出且生長至80%~90%融合狀態(tài)時(shí)，用0.25%trypsin-EDTA消化傳代，并將洗脫下來的組織塊繼續(xù)接種新的培養(yǎng)瓶培養(yǎng)；待第二次組織塊貼壁爬出的細(xì)胞生長至80%~90%融合狀態(tài)時(shí)，用0.25%trypsin-EDTA消化傳代，并將第二次組織貼壁培養(yǎng)后洗脫下來的組織塊繼續(xù)接種新的培養(yǎng)瓶培養(yǎng)，進(jìn)行第三次組織貼壁培養(yǎng)。對三次組織塊貼壁培養(yǎng)出的細(xì)胞進(jìn)行生物學(xué)特性鑒定。

1.4 增殖能力檢測取三次貼壁培養(yǎng)后各自的第三代細(xì)胞(P3)，按照2×103/孔接種96孔板，100μl/孔，置于5%CO2、37℃的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。每隔24 h，每孔加入20μl MTS孵育2 h后，用酶標(biāo)儀（490 nm）測定各孔吸光度值，連續(xù)觀察10 d后，以時(shí)間為橫軸，吸光度值為縱軸繪制生長曲線。

1.5 免疫表型檢測消化收集三次貼壁培養(yǎng)的P3代細(xì)胞，生理鹽水洗滌3次，分成每管含1×106個(gè)細(xì)胞，分別加入CD29-FITC、CD34-PE、CD44-FITC、CD45-PC5、CD90-FITC、CD105-PE和同型對照10μl，4℃避光孵育30min，磷酸鹽緩沖液洗滌棄除未結(jié)合抗體后，上流式細(xì)胞儀檢測表面抗原標(biāo)志的表達(dá)水平。

1.6 分化潛能檢測成脂誘導(dǎo)分化：消化收集三次貼壁培養(yǎng)的P3代細(xì)胞，按照1×104個(gè)/cm2接種到12孔板中靜置培養(yǎng)，至細(xì)胞100%甚至是過度融合時(shí)，丟棄10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液，加入成脂分化誘導(dǎo)液培養(yǎng)，每隔3 d換液。培養(yǎng)14 d后，4%多聚甲醛固定后加入油紅O染色。

成骨分化：將P3代細(xì)胞按照5×103/cm2接種到12孔板中靜置培養(yǎng)，至細(xì)胞60%融合狀態(tài)時(shí)，丟棄培養(yǎng)液，加入成骨誘導(dǎo)液連續(xù)培養(yǎng)，每隔3 d換液。培養(yǎng)21 d后，4%多聚甲醛固定后加入茜素紅染色。

成軟骨分化：收集P3代細(xì)胞，調(diào)整密度為1× 107/ml，取5μl接種至12孔板中，置于5%CO2、37℃的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)2 h后，緩慢加入預(yù)熱好的成軟骨分化培養(yǎng)液靜置培養(yǎng)，每隔3 d換液。培養(yǎng)14 d后，4%多聚甲醛固定、石蠟包埋軟骨細(xì)胞小球、病理切片，脫蠟后加入阿新藍(lán)染色，生物顯微鏡下觀察拍照。

2 結(jié)果

2.1 UC-MSC的分離培養(yǎng)不剝離血管和包膜組織貼壁法培養(yǎng)，最早7 d后就可以在倒置相差顯微鏡下觀察到有細(xì)胞從邊緣爬出，呈細(xì)小梭形（圖1A），12 d可見大量細(xì)胞呈克隆狀生長（圖1B）。將洗脫下的組織塊進(jìn)行第二次、第三次貼壁時(shí)，第2 d就可以看見細(xì)胞爬出（圖1C），5 d就可見克隆樣生長（圖1D），其產(chǎn)量為以前的3倍，且傳代后生長速度快、活性好，大量的成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞呈旋渦狀生長（圖1E）。

圖1 臍帶組織塊貼壁法培養(yǎng)UC-MSC的形態(tài)觀察(×10)

2.2 UC-MSC的增殖能力細(xì)胞剛接種前2 d處于滯留期，增殖不明顯；3~7 d進(jìn)入對數(shù)增殖期，細(xì)胞生長旺盛，活力最佳；第8 d進(jìn)入平臺(tái)期。三次貼壁后培養(yǎng)的UC-MSC生長曲線均呈典型的“S”型，無明顯差異。

2.3 UC-MSC的免疫表型對三次貼壁培養(yǎng)的P3代細(xì)胞進(jìn)行流式檢測，結(jié)果均顯示：低表達(dá)或不表達(dá)CD34、CD45，高表達(dá)CD29、CD44、CD90，而CD105的表達(dá)隨著再次貼壁培養(yǎng)而升高（表1），說明第二、三次貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞也是UC-MSC，且純度更高。

表1 貼壁培養(yǎng)的P3代細(xì)胞UC -MSC流式檢測結(jié)果(%）

2.4 UC-MSC的分化潛能成脂分化：三次貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞成脂分化誘導(dǎo)14~21 d后，經(jīng)油紅O染色，胞漿內(nèi)可見紅色脂滴（圖2）；成骨分化：誘導(dǎo)14~21 d后，鈣質(zhì)結(jié)節(jié)可被茜素紅染成紅色（圖3）；成軟骨分化：誘導(dǎo)14~28 d后，石蠟包埋切片，可見軟骨膠原基質(zhì)被阿甲新藍(lán)染成藍(lán)色（圖4）。三次貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞均有向脂肪、骨和軟骨分化的潛能。

圖2 UC-MSC成脂分化

圖3 UC-MSC成骨分化

圖4 UC-MSC成軟骨分化

3 討論

已經(jīng)證實(shí)，間充質(zhì)干細(xì)胞應(yīng)用于治療脊髓損傷、腦缺血、多發(fā)性硬化癥等涉及創(chuàng)傷、缺血、中毒、退變誘導(dǎo)的組織細(xì)胞變性、壞死、缺失等疾病均有一定治療意義[4-5]。因臍帶為胎兒分娩時(shí)的廢棄物，比起骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞取材更為方便，不容易受到供體年齡的限制[6]而受到廣泛的關(guān)注。

通常對于臍帶原代組織的培養(yǎng)方法主要有酶消化法、組織貼壁法以及兩者結(jié)合的酶組織法。酶消化法成本高，消化時(shí)間難于控制，消化液黏稠而不易分離，而且膠原酶對細(xì)胞有直接損傷作用。傳統(tǒng)的組織貼壁法較為簡單，成本低，但是細(xì)胞爬出時(shí)間過長，通常需要10 d左右，兩者結(jié)合的酶組織法為貼壁培養(yǎng)酶消化后的組織塊，方法雖也簡易，細(xì)胞易于爬出，但是操作步驟比較繁瑣，細(xì)胞接觸東西比較多，容易污染。基于3種分離培養(yǎng)方法的基礎(chǔ)上，龐榮清等[7]用一種不剝離血管和包膜直接剪碎貼壁培養(yǎng)的方法，也培養(yǎng)出活性好且穩(wěn)定的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，此法更為簡易可行。本研究在此基礎(chǔ)上進(jìn)行改良，用已爬出細(xì)胞時(shí)本應(yīng)丟棄的組織塊進(jìn)行二、三次貼壁，充分利用組織塊，不造成浪費(fèi)，且經(jīng)過第一次貼壁后組織塊中的華通膠更為暴露易于培養(yǎng)，接種的第2 d就能看見細(xì)胞爬出，第5 d就有大片的克隆樣生長，產(chǎn)量為之前的3倍，提高了利用率的同時(shí)，也提高了原代細(xì)胞的產(chǎn)出效率。與第一次貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞相比，第二、三次貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞免疫表型分析結(jié)果顯示，與間充質(zhì)干細(xì)胞比較相關(guān)的表面標(biāo)記CD90、CD105表達(dá)稍微增高，說明經(jīng)過第一次貼壁培養(yǎng)后，淘汰了雜細(xì)胞，后面再次貼壁養(yǎng)出的細(xì)胞純度更高。

本研究還對比了三次貼壁培養(yǎng)后的生長曲線，群體倍增時(shí)間以及多向分化潛能，結(jié)果顯示生長曲線形態(tài)相似，都具有向骨、軟骨和脂肪分化的能力，根據(jù)間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定標(biāo)準(zhǔn)[8]，可以判定這些貼壁生長的細(xì)胞就是臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。

總之，本研究采用反復(fù)貼壁培養(yǎng)的方法，建立了相對規(guī)范的UC-MSC制備與鑒定技術(shù)方法，不僅操作簡單，而且得到的原代細(xì)胞數(shù)量翻倍，縮短了臍帶離體后到接種的時(shí)間，大大保持了其活性，避免了過多的與外來物質(zhì)的接觸，降低了變異的幾率，值得廣泛應(yīng)用。

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Efficient preparation of human umbilical cordmesenchymal stem cells bymultiple adherencemethod

He Jie,Zhao Jing,Wang Jinxiang,Cai Xuemin,Pang Rongqing,Pan Xinghua Cell Biological Therapy Center of Kunming General Hospital of Chengdu Military Command/Clinical College of Kunming General Hospital,Kunming Medical University/The Nation and Region Integrated Engineering Laboratory of Stem Cell and Immunocyte Biological Technology/Key Laboratory of Cell Therapeutic Transforming Medicine of Yunnan Province/Stem Cell Engineering Laboratory of Yunnan Province/Kunming Key Laboratory of Stem Cell and Regenerative Medicine,Kunming,Yunnan,650032,China

Objective To establish a simple,efficient,stable,and standardized human umbilical cord mesenchymal stem cell preparation and identification technology in vitro,and to provide technological specification for the establishment and clinical application of human umbilical cord mesenchymal stem cell bank.Methods The technique and method in the early time were improved and repeatedly verified.A standardized technicalmethod was established.The umbilical cords of fetuses taking cesarean delivery at full term were aseptically collected.The umbilical cord mesenchymal stem cells were cultured by the method of not stripping the vessel and coated vascular tissue adherentmethod.When the primary cells grew,the tissue blocks which should be discarded at firstwere collected and adherently cultured for the second time.Repeatedly like that,the tissue blockswere collected for the third time adherent culture until the cells grew out in the blocks cultured at the second time.The cells of the third generation cultured during the three times of adherent culture were analyzed for the biological characteristics.Results Fibroblast-like cells could be seen climbing out 10-12 d after the first time adherence and on the third day after the second and third time of adherence.The growing condition was good,and the cell shape wasmore uniform.CD29,CD44,CD90,and CD105 were all highly expressed in the cells of the third generation cultured during the three times of adherent culture.However,CD34 and CD45 were not expressed.The cell growth curve was S type,and the cells could be induced to differentiate into adipocytes,osteogenesis,and chondrocytes.Conclusion The preparation of human umbilical cord mesenchymal stem cells by the method of multiple adherence method fully takes advantage of the umbilical cord tissue blocks and gets the number of primary cells doubled,and its biological characteristics is stable.

umbilical cordmesenchymal stem cell;isolation;adherent culture

R 318.1

A

1004-0188（2015）08-0828-04

10.3969/j.issn.1004-0188.2015.08.006

2015-03-26）

國家科技支撐計(jì)劃（2014BI01B0）;云南省戰(zhàn)略性新興產(chǎn)業(yè)專項(xiàng)（2013DA004）;云南省科技創(chuàng)新平臺(tái)建設(shè)項(xiàng)目（2013DA004）

650032昆明,成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院細(xì)胞生物治療中心，干細(xì)胞與免疫細(xì)胞生物醫(yī)藥技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室,云南省細(xì)胞治療技術(shù)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南省干細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室，昆明市干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

龐榮清,E-mail:pangrq2000@aliyun.com；潘興華，E-mail:xinghuapan@aliyun.com