姜寧　劉曉鵬　張俊霞　胡績(jī)偉　李力　蔣曉軍　吳皓

摘要：試驗(yàn)考察了乙醇體積分?jǐn)?shù)、液固比、提取時(shí)間、提取溫度4個(gè)因素對(duì)忍冬（Lonicera japonica Thunb.）藤總黃酮提取的影響，并采用Box-Behnken試驗(yàn)優(yōu)化了忍冬藤總黃酮提取工藝。結(jié)果表明，4個(gè)因素能顯著影響忍冬藤總黃酮的提取，并優(yōu)化得出最佳提取工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)91%、液固比42∶1（mL∶g）、80 ℃提取2.7 h，此時(shí)總黃酮提取率為5.22%，與理論值5.24%相差不大，表明該工藝可行。

關(guān)鍵詞：忍冬（Lonicera japonica Thunb.）藤；總黃酮；提?。还に噧?yōu)化

中圖分類號(hào)：S567.1+9；R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）10-2459-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.10.041

忍冬藤為忍冬科植物忍冬（Lonicera japonica Thunb.）的干燥莖枝，分布廣泛，忍冬藤與金銀花為植物忍冬的不同藥用部位，均收載于《中華人民共和國(guó)藥典》（一部）[1]。忍冬藤味甘、性寒，具有清熱解毒、通絡(luò)之功效。用于溫病發(fā)熱，瘡癰腫毒，熱毒血痢，風(fēng)濕熱痹[1]?，F(xiàn)代研究表明，忍冬藤具有抗菌作用、抗病毒作用、抗炎作用、保肝作用以及調(diào)節(jié)免疫等藥理作用[2]。

忍冬藤含有多種化學(xué)成分，包括有機(jī)酸類、環(huán)烯醚萜苷類、黃酮類、揮發(fā)油類等成分。有機(jī)酸類主要有綠原酸、異綠原酸、咖啡酸、棕櫚酸、馬錢子酸、原兒茶酸等[2]；黃酮類主要有木犀草素、槲皮素、芹菜素、忍冬苷等[3]；環(huán)烯醚萜苷類主要有馬錢子苷、獐牙菜苷、當(dāng)藥苷等[4]；揮發(fā)油類主要有烷烴、酯類、酮醇苯類化合物[5]。2010年版中華人民共和國(guó)藥典將綠原酸、馬錢子苷作為忍冬藤質(zhì)量控制的指標(biāo)。

黃酮類化合物（Flavonoids）廣泛存在于自然界中，泛指兩個(gè)具有酚羥基的苯環(huán)（A環(huán)與B環(huán)）通過(guò)中間三碳環(huán)（C環(huán)）相互聯(lián)結(jié)而成的具有C6-C3-C6結(jié)構(gòu)的一系列化合物，是許多植物的生物活性成分。其具有廣泛的生理活性，具有抗炎、抗衰老、抗病毒、抗菌、抗癌、抗氧化和增強(qiáng)免疫力等藥理作用[6]。目前針對(duì)忍冬藤總黃酮的研究尚不多見(jiàn)。本研究通過(guò)考察乙醇體積分?jǐn)?shù)、液固比、提取溫度和提取時(shí)間等因素，采用響應(yīng)面分析優(yōu)化忍冬藤總黃酮的提取工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

忍冬藤由南京同仁堂洪澤中藥材科技有限公司提供；無(wú)水乙醇、蘆丁、亞硝酸鈉、硝酸鋁等均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。儀器有紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)、多功能粉碎機(jī)、離心機(jī)、恒溫水浴鍋等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 單因素試驗(yàn)

1）乙醇體積分?jǐn)?shù)。稱取一定量的忍冬藤粉末，分別用50%、60%、70%、80%、90%、95%乙醇對(duì)材料進(jìn)行浸提，液固比30∶1（mL∶g，下同），70 ℃水浴2 h，離心取上清液。測(cè)上清液中的總黃酮含量，試驗(yàn)重復(fù)3次并計(jì)算提取率。

2）液固比。稱取一定量的忍冬藤粉末，分別按液固比10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1加入80%的乙醇， 70 ℃水浴2 h，然后將浸提液離心取上清測(cè)總黃酮含量，試驗(yàn)重復(fù)3次計(jì)算提取率。

3）溫度。稱取一定量的忍冬藤粉末，按液固比30∶1加入80%的乙醇，分別于40、50、60、70、80、90 ℃水浴2 h，然后將提取液離心取上清，測(cè)其中的總黃酮含量，試驗(yàn)重復(fù)3次并計(jì)算提取率。

4）提取時(shí)間。稱取一定量的忍冬藤粉末，按液固比30∶1向忍冬藤粉末中加入80%乙醇，水浴溫度為70 ℃，水浴時(shí)間分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 h，然后離心提取上清，進(jìn)行總黃酮含量測(cè)定，試驗(yàn)重復(fù)3次并計(jì)算提取率。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品0.038 g在120 ℃下干燥至恒重，用30%的乙醇溶解并定容至250 mL，搖勻即得濃度為0.152 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液。分別吸取上述標(biāo)準(zhǔn)液0、1、2、4、6、8 mL，加入30%乙醇使總體積為12.5 mL，加入0.7 mL的5%亞硝酸鈉搖勻，放置5 min，加入10%硝酸鋁0.7 mL，搖勻，放置6 min，加入1 mol/L氫氧化鈉5 mL，再加30%乙醇至刻度25 mL，搖勻，放置15 min，測(cè)510 nm波長(zhǎng)處的吸光度，以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 Box-Behnken優(yōu)化試驗(yàn) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用Design-Expert 8.0軟件進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以乙醇體積分?jǐn)?shù)、液固比、提取溫度和提取時(shí)間為自變量，總黃酮提取率為響應(yīng)值優(yōu)化忍冬藤總黃酮的提取工藝。試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

圖1A為乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)忍冬藤總黃酮提取率的影響。由圖1A可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，總黃酮提取率也顯著增加，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)增至90%后，黃酮的提取率升高不再顯著。圖1B為液固比對(duì)忍冬藤總黃酮提取率的影響，由圖1B可知，液固比較小（<20∶1）時(shí)，增加提取液的體積，對(duì)總黃酮提取率影響不顯著，當(dāng)液固比從20∶1增至40∶1時(shí)，總黃酮提取率上升極顯著，但當(dāng)液固比進(jìn)一步增大時(shí)，總黃酮提取率差異不顯著。圖1C為提取溫度對(duì)忍冬藤總黃酮提取率的影響，由圖1C可知，溫度較低時(shí)，提高溫度對(duì)總黃酮的提取率影響較小，但也達(dá)顯著水平，隨著溫度的不斷升高，總黃酮提取率極顯著上升，升至80 ℃后，溫度對(duì)忍冬藤總黃酮的影響就不再顯著。圖1D為提取時(shí)間對(duì)忍冬藤總黃酮提取率的影響，由圖1D可知，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，總黃酮的提取率也顯著升高，但當(dāng)提取時(shí)間超過(guò)2.5 h后，時(shí)間對(duì)忍冬藤總黃酮的影響就不再顯著。

2.2 Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 回歸方程的建立 Box-Behnken試驗(yàn)優(yōu)化忍冬藤總黃酮提取工藝的結(jié)果見(jiàn)表2。經(jīng)統(tǒng)計(jì)軟件Design-Expert 8.0分析，建立了如下四元二次回歸方程：

R=5.07+0.34A+0.35B+0.28C+0.49D+0.24AB- 0.12AC-0.36AD-0.29BC-0.39BD-0.44CD-0.63A2- 0.56B2-0.26C2-0.39D2

方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，該模型達(dá)極顯著水平，失擬項(xiàng)不顯著，說(shuō)明此模型與實(shí)際情況擬合得很好。根據(jù)建立的回歸模型，計(jì)算得出當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為91%，液固比42∶1，80 ℃提取2.7 h時(shí)，總黃酮的提取率最高，理論值為5.24%，按優(yōu)化的工藝條件提取忍冬藤總黃酮，提取率為5.22%，與理論值相差不大，說(shuō)明該工藝有較強(qiáng)的實(shí)用價(jià)值。

2.2.2 響應(yīng)面分析 為了探究各因素之間的交互作用，對(duì)Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行了響應(yīng)面分析（圖2）。由圖2可以看出，當(dāng)提取溫度和提取時(shí)間固定時(shí)，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)和液固比的升高，總黃酮提取率也顯著上升，到達(dá)最高值時(shí)，又隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)和液固比的上升，提取率顯著下降（圖2a）；當(dāng)液固比和提取溫度固定時(shí)，乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取時(shí)間處于較低水平時(shí)，總黃酮提取率也較低，乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取時(shí)間的增加會(huì)使總黃酮的提取率增加，但提取率達(dá)到最大值后，又隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取時(shí)間的升高總黃酮提取率逐步下降（圖2b）；當(dāng)固定液固比和提取時(shí)間時(shí)，乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取溫度處于低水平時(shí)，總黃酮的提取率也很低，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取溫度的增加，總黃酮提取率隨之上升，達(dá)到最大值之后，乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取溫度的進(jìn)一步增加總黃酮提取率反而呈下降趨勢(shì)（圖2c）；圖2d結(jié)果表明，液固比和提取時(shí)間的交互作用對(duì)總黃酮提取率影響顯著，液固比和提取時(shí)間處于低水平或高水平時(shí)，忍冬藤總黃酮的提取率較低；而液固比和提取溫度的交互作用對(duì)總黃酮提取率的影響與乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取溫度的交互作用相似（圖2e）；當(dāng)固定乙醇體積分?jǐn)?shù)和液固比時(shí)，隨著提取溫度與提取時(shí)間的增加，總黃酮提取率也增加，當(dāng)提取時(shí)間和提取溫度進(jìn)一步增加時(shí)，提取率反而下降（圖2f）。

3 小結(jié)與討論

本研究對(duì)影響忍冬藤總黃酮提取的4個(gè)因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)，并根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果確定Box-Behnken的因素和水平，得到最優(yōu)工藝是乙醇體積分?jǐn)?shù)為91%，液固比42∶1，80 ℃提取2.7 h，這是因?yàn)槿潭倏傸S酮在高濃度的乙醇溶液中溶解性較好；液固比增大有利于提高總黃酮細(xì)胞內(nèi)外的濃度差從而加大溶出速度，但液固比過(guò)大，會(huì)造成試劑的浪費(fèi)和加大提取過(guò)程中的損耗；高溫使總黃酮溶出速度加快，但溫度過(guò)高會(huì)使物質(zhì)不穩(wěn)定；適當(dāng)?shù)脑黾犹崛r(shí)間，會(huì)使總黃酮的溶出量增加，但當(dāng)細(xì)胞內(nèi)外總黃酮濃度趨于平衡后，溶出不再增加。當(dāng)然，乙醇是否是最佳溶劑還有待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)

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