楊妮　王建

摘要：利用簡(jiǎn)單重復(fù)序列分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)廣西莪術(shù)（Curcuma kwangsiensis S.G. Lee et C.F.Liang）種質(zhì)資源進(jìn)行了遺傳多樣性分析。結(jié)果表明，篩選出的14對(duì)引物在50份廣西莪術(shù)種質(zhì)資源中共擴(kuò)增出78個(gè)條帶，其中60條呈現(xiàn)多態(tài)性，多態(tài)性比率為76.92%，反映出廣西莪術(shù)種質(zhì)資源在分子水平上存在較大的差異；廣西莪術(shù)不同種質(zhì)資源間的差異主要由遺傳因素決定，但也與環(huán)境因素有關(guān)。聚類(lèi)結(jié)果將50份廣西莪術(shù)種質(zhì)資源分成2大類(lèi)，揭示了它們之間的遺傳差異，這為今后廣西莪術(shù)優(yōu)良品種的選育提供了依據(jù)。

關(guān)鍵詞：簡(jiǎn)單重復(fù)序列分子標(biāo)記；廣西莪術(shù)（Curcuma kwangsiensis S.G. Lee et C.F.Liang）；遺傳多樣性

中圖分類(lèi)號(hào)：Q943.2；Q949.71+8.33；Q16 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）10-2408-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.10.027

廣西莪術(shù)（Curcuma kwangsiensis S.G. Lee et C.F.Liang）為姜科（Zingiberaceae）姜黃屬（Curcuma L.）植物，以干燥根莖入藥，其味辛、苦，性溫，具有行氣破血、消積止痛的功效，可用于癥瘕痞塊、淤血閉經(jīng)、食積脹痛等病征以及早期宮頸癌的治療，是中醫(yī)臨床上較為常用的活血化瘀藥材[1]?，F(xiàn)代藥理研究表明，廣西莪術(shù)所含的莪術(shù)油是一種很有發(fā)展前途的抗腫瘤、抗血栓和抗病毒藥物[2-4]。廣西莪術(shù)是廣西壯族自治區(qū)主產(chǎn)的地道藥材，產(chǎn)區(qū)面積大，近年來(lái)關(guān)于莪術(shù)揮發(fā)油成分的研究越來(lái)越多，但對(duì)廣西莪術(shù)的品種選育和種植技術(shù)改良未受到應(yīng)有的重視。多年來(lái)，廣西莪術(shù)育種工作側(cè)重于常規(guī)技術(shù)，許多分子水平上的研究工作有待開(kāi)展。試驗(yàn)利用簡(jiǎn)單重復(fù)序列（Simple sequence repeats，SSR）分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)產(chǎn)自于廣西壯族自治區(qū)的50份廣西莪術(shù)種質(zhì)資源進(jìn)行了遺傳多態(tài)性分析，旨在揭示廣西莪術(shù)種質(zhì)資源的遺傳多樣性，以期為廣西莪術(shù)選育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)新品種提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

供試廣西莪術(shù)種質(zhì)材料共有50份，是從多年收集到的廣西莪術(shù)原始材料中選育出來(lái)的，分別采自廣西壯族自治區(qū)的玉林市、興業(yè)縣、欽州市、靈山縣、貴港市、桂平市、平南縣、欽北區(qū)、橫縣、邕寧區(qū)、金秀瑤族自治縣等地，從2000年起集中栽植于南寧市仙葫種植基地內(nèi)。試驗(yàn)前其生長(zhǎng)狀況優(yōu)良，有關(guān)信息見(jiàn)表1。經(jīng)王建教授鑒定，并經(jīng)過(guò)藥材性狀數(shù)據(jù)分析，參試的各樣品確認(rèn)為姜科植物廣西莪術(shù)無(wú)疑。

1.2 基因組DNA提取

選取參試各種質(zhì)材料生長(zhǎng)狀況良好的新鮮健康嫩葉，經(jīng)前期消毒處理后提取DNA，提取方法參照經(jīng)典的CTAB法[5]，稍加改良。提取所得總DNA于-20 ℃環(huán)境里保存。

1.3 引物篩選和SSR-PCR反應(yīng)體系優(yōu)化

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增引物參照文獻(xiàn)[6]公布的姜黃屬通用的17對(duì)引物選取，由上海生工生物技術(shù)工程服務(wù)有限公司合成，詳見(jiàn)表2。隨機(jī)選用10個(gè)參試的廣西莪術(shù)種質(zhì)材料，參照Komatsu等[7]的SSR擴(kuò)增條件稍加改良進(jìn)行引物篩選，從姜黃屬通用的17對(duì)引物中選取擴(kuò)增條帶清晰、重復(fù)性好、多態(tài)性高的15對(duì)引物作為本次試驗(yàn)的引物。最終確定的PCR反應(yīng)體系為：DNA模板3 μL、引物1 μL、2×Taq PCR Master Mix 6 μL（Taq DNA Polymerase）、Recombinant 0.05 units/μL、MgCl2 4 mmol/L、dNTPs（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）0.4 mmol/L、加dd H2O至15 μL。以此建立的SSR反應(yīng)體系穩(wěn)定、重復(fù)性好。PCR反應(yīng)程序參照文獻(xiàn)[8]，略有改動(dòng)；擴(kuò)增反應(yīng)是在德國(guó)Biometra TProfessional PCR儀上進(jìn)行，擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)擴(kuò)增循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。

1.4 凝膠電泳與染色

PCR產(chǎn)物在7%的聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE，5 μg/mL）中于200 V穩(wěn)壓里電泳45～60 min，凝膠電泳分離后進(jìn)行銀染，觀察，并用Cano Scan 9 000 F掃描儀掃描得到圖譜。

根據(jù)圖譜分析各SSR位點(diǎn)的擴(kuò)增情況，包括是否擴(kuò)增、各位點(diǎn)在不同材料中所得到的等位基因數(shù)量。

1.5 遺傳多樣性分析

電泳擴(kuò)增結(jié)果直接記錄凝膠帶型，并按基因型分別統(tǒng)計(jì)。選取清晰可辨的電泳條帶，每條帶代表引物與模板的1個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，視每個(gè)多態(tài)性條帶為1個(gè)等位基因，將觀測(cè)到的每條帶視為一個(gè)性狀，有此帶時(shí)賦值為1，無(wú)此帶時(shí)賦值為0，將所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)在Microsft Office Excel 2003軟件里進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，統(tǒng)計(jì)后將（0，1）矩陣輸入分析軟件里進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析。讀出每對(duì)引物在廣西莪術(shù)種質(zhì)材料上產(chǎn)生的條帶總數(shù)T、多態(tài)性條帶P，并計(jì)算多態(tài)性條帶比率PPB。多態(tài)性條帶比率=多態(tài)性條帶數(shù)目/條帶總數(shù)×100%。采用NTSYS-pc 2.10軟件構(gòu)建數(shù)據(jù)矩陣，進(jìn)行聚類(lèi)分析。在Simint程序下選擇Dice系數(shù)計(jì)算50份廣西莪術(shù)種質(zhì)材料間的遺傳相似系數(shù)，采用非加權(quán)組平均法（Unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA）建立相應(yīng)的系統(tǒng)樹(shù)狀結(jié)構(gòu)，通過(guò)聚類(lèi)劃分類(lèi)群來(lái)完成聚類(lèi)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 姜黃屬通用引物在廣西莪術(shù)中的擴(kuò)增情況

從17對(duì)公布的姜黃屬通用引物中，篩選出在供試廣西莪術(shù)種質(zhì)材料中能產(chǎn)生較清晰主帶的引物，共有15對(duì)，初步認(rèn)為這些引物是有效引物，適用于廣西莪術(shù)種質(zhì)材料。利用這些引物對(duì)50份廣西莪術(shù)種質(zhì)材料統(tǒng)一進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果條帶較清晰且有多態(tài)性的出現(xiàn)了14對(duì)。圖1、圖2分別為引物SSR-01、SSR-02、SSR-03和SSR-07、SSR-08、SSR-09的PCR擴(kuò)增銀染后掃描得到的電泳圖譜。

2.2 SSR擴(kuò)增圖譜分析

利用14對(duì)引物對(duì)50份廣西莪術(shù)種質(zhì)材料進(jìn)行多態(tài)性分析，結(jié)果見(jiàn)表3。從表3可見(jiàn)，14對(duì)引物在50份廣西莪術(shù)種質(zhì)材料中，每一條都能擴(kuò)增出4～7條DNA片段，平均每對(duì)SSR引物擴(kuò)增出了4.29 條，總共擴(kuò)增出了78條，其中多態(tài)性條帶60條，多態(tài)性條帶比率為76.92%。這個(gè)結(jié)果表明，廣西莪術(shù)各產(chǎn)地間種質(zhì)材料（居群）的多態(tài)性較豐富，這與國(guó)外相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的印度姜黃（Curcuma longa L.）的擴(kuò)增效果相近[9]，而國(guó)內(nèi)姜黃屬種群之間在遺傳差異相關(guān)研究方面與國(guó)外研究相比，所得到的多態(tài)性位點(diǎn)總數(shù)要略低一些[10-12]。

試驗(yàn)結(jié)果表明，50份廣西莪術(shù)種質(zhì)材料間具有較高的遺傳多樣性，并且廣西各地的廣西莪術(shù)種質(zhì)材料之間的遺傳相似系數(shù)差別較大，說(shuō)明各地的居群存在較明顯的遺傳分化。這和已報(bào)道的采用其他分子標(biāo)記技術(shù)研究姜黃屬遺傳多樣性的結(jié)果相似，即不同居群的姜黃屬植物種的特性與地理分布具有一定的相關(guān)性。王佐元等[13]應(yīng)用ISSR（Inter-simple sequence repeat）標(biāo)記技術(shù)對(duì)5個(gè)居群的溫郁金（C. wenyujin Y.H.Chen et C.Ling）遺傳多樣性進(jìn)行了分析，篩選出6個(gè)引物用于ISSR-PCR擴(kuò)增，結(jié)果共檢測(cè)到多態(tài)性位點(diǎn)34個(gè)，多態(tài)性條帶比率是80.95%，說(shuō)明溫郁金有著較豐富的遺傳多樣性。王曉慧等[14]對(duì)蓬莪術(shù)（C. phaeocaulis Val.）、廣西莪術(shù)和溫郁金共8個(gè)居群的37個(gè)樣本進(jìn)行了ISSR-PCR分析，5條引物共擴(kuò)增出65個(gè)位點(diǎn)，其中34個(gè)位點(diǎn)是多態(tài)性位點(diǎn)，多態(tài)性條帶比率為52.3 %；據(jù)此認(rèn)為蓬莪術(shù)居群間的遺傳變異較大，而居群內(nèi)部的分化程度很低。本研究結(jié)果于上述研究存在相當(dāng)?shù)囊恢滦浴?/p>

2.3 UPGMA聚類(lèi)分析

50份廣西莪術(shù)種質(zhì)材料的SSR擴(kuò)增條帶統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)經(jīng)NTSYS-pc 2.10軟件聚類(lèi)分析，得到聚類(lèi)樹(shù)狀圖，具體見(jiàn)圖3。從圖3可以看出，在遺傳相似系數(shù)0.70處，參試的50份廣西莪術(shù)種質(zhì)材料可聚為2個(gè)大類(lèi)。第一大類(lèi)包含8份種質(zhì)，在這一類(lèi)中，除13-D2-2、86-B94-1、87-B10-2外，其余的都產(chǎn)自玉林市及管轄縣興業(yè)縣；其中在遺傳相似系數(shù)0.87處，55-玉1-3獨(dú)自成為一類(lèi)，說(shuō)明55-玉1-3與其他第一大類(lèi)的廣西莪術(shù)種質(zhì)材料的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)；而在遺傳相似系數(shù)0.98處，26-加1和50-玉18-3聚在了一起，這2個(gè)材料可能來(lái)自同一親本；在遺傳相似系數(shù)0.95處，來(lái)源于欽州市的86-B94-1、87-B10-2聚在了一起，反映出它們是同一親本產(chǎn)生的后代。第二大類(lèi)包含42份種質(zhì)材料，主要來(lái)源于平南，貴港，興業(yè)，桂平等縣（市），其中在遺傳相似系數(shù)0.71處，42份種質(zhì)又聚為2個(gè)亞類(lèi)。其中來(lái)源于金秀縣的37-C46-1，77-C24-1，79-C69-1，80-C104-1聚為1個(gè)亞類(lèi)，與其他種質(zhì)的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)；其余的38份種質(zhì)在不同遺傳相似系數(shù)處又可聚為多個(gè)次類(lèi)，如在遺傳相似系數(shù)0.93處可分為2個(gè)次類(lèi)，第一次類(lèi)包括了21份種質(zhì)，分別來(lái)源于貴港、桂平、平南等縣（市），這些種質(zhì)由于所處的地理位置比較接近，因此當(dāng)?shù)厣L(zhǎng)環(huán)境及種植制度存在一定的相似性，進(jìn)而也能表現(xiàn)出一定的遺傳相似性。第二次類(lèi)包括了62-玉22-2、64-C84-3、67-大一-3這3個(gè)種質(zhì)，來(lái)自地域較接近的玉林市、興業(yè)縣。在遺傳相似系數(shù)為1.00處，30-玉24-2、32-玉8-1、32-玉8-2、33-玉3-3、42-玉2-1聚為了1個(gè)小類(lèi)，可以看出這幾份種質(zhì)的親緣關(guān)系非常接近，猜測(cè)它們可能是同一株系的后代，它們的產(chǎn)地也相同，均來(lái)自玉林市。通過(guò)聚類(lèi)分析圖的完成，可以將無(wú)序的50份廣西莪術(shù)種質(zhì)材料進(jìn)行分類(lèi)，并能初步確定它們的親緣關(guān)系遠(yuǎn)近。

3 討論

以往研究表明姜黃屬是三倍體[6]，多態(tài)性擴(kuò)增結(jié)果也說(shuō)明了廣西莪術(shù)多倍體資源多態(tài)性相對(duì)比較豐富。但從聚類(lèi)樹(shù)狀圖來(lái)看，50份供試廣西莪術(shù)種質(zhì)材料間的遺傳相似系數(shù)介于0.7～1.0，遺傳相似性系數(shù)變化范圍較窄；有研究[2，4]認(rèn)為這與地理、生態(tài)環(huán)境相近、加之相互引種頻繁等因素有關(guān)。此外，試驗(yàn)所用的引物數(shù)量偏少，因此選用的50份廣西莪術(shù)種質(zhì)材料的聚類(lèi)結(jié)果并不能完全反映出不同來(lái)源種質(zhì)間彼此的親緣關(guān)系。廣西莪術(shù)遺傳背景復(fù)雜，通過(guò)常規(guī)的形態(tài)學(xué)方法對(duì)其進(jìn)行分類(lèi)存在一定的局限性。因此，對(duì)于廣西莪術(shù)遺傳多樣性不僅要結(jié)合前期的形態(tài)學(xué)研究、藥材產(chǎn)量、成分分析研究等方面進(jìn)行深入探討，還要充分利用近年來(lái)快速發(fā)展的分子標(biāo)記技術(shù)做深層次的研究。試驗(yàn)利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)。從分子水平上分析了不同來(lái)源地廣西莪術(shù)種質(zhì)資源的遺傳多樣性.并對(duì)它們之間的親緣關(guān)系進(jìn)行了探討，初步揭示了廣西莪術(shù)種質(zhì)資源之間的遺傳差異，這將對(duì)廣西莪術(shù)的優(yōu)良地方品種鑒定篩選與新品種選育提供分子生物學(xué)依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 中華人民共和國(guó)國(guó)家藥典編纂委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（一部）[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2010.

[2] 王 建，趙應(yīng)學(xué).不同種質(zhì)類(lèi)型廣西莪術(shù)揮發(fā)油成分多樣性研究[J].藥物分析雜志，2010，30（6）：1072-1075.

[3] 佟 磊，史克莉.不同提取方法對(duì)莪術(shù)揮發(fā)油成分的影響[J].湖北中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，12（6）：35-37.

[4] 王曉華，朱 華，王孝勛，等.廣西莪術(shù)葉與根莖、塊根揮發(fā)油的比較研究[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2012，23（7）：1650-1652.

[5] 錢(qián)敏艷，趙海龍.不同植物材料粗提取DNA的比較研究[J].中學(xué)生物學(xué)，2011，27（1）：43-44.

[6] SIGRIST M S，PINHEIRO J B，AZEVEDO-FILHO J A， et al. Development，characterization and cross species amplification of polymorphic microsatellite markers from expressed sequence tags of turmeric （Curcuma longa L.）[J].Molecular Biotechnology，2010，44（2）：140-147.

[7] KOMATSU K， SASAKI Y，TANAKA K，et al.Morphological，genetic，and chemical polymorphism of Curcuma kwangsiensis[J]. J Nat Med，2008，62：413-422.

[8] HUSSAIN Z，TYAGI R K，SHARMA R，et al. Genetic diversity in in vitro-conserved germplasm of Curcuma L.as revealed by RAPD markers[J]. Biol Plant，2008，52（4）：627-633.

[9] RATHORE P，DOHARE P，VARMA S，et al. Curcuma oil：Reduces early accumulation of oxidative product and is anti-apoptogenic in transient focal ischemia in rat brain[J]. Neurochem Res，2008，33（9）：1672-1682.

[10] 陶銀龍，王佐元，丁文勇，等.5個(gè)溫郁金居群遺傳多樣性的RAPD分析[J].紹興文理學(xué)院學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2013，33（9）：53-57.

[11] 冷春鴻，陶正明，吳志剛，等.不同產(chǎn)地溫郁金遺傳多樣性的SRAP分析[J].中藥材，2009，32（10）：1507-1510.

[12] 陶正明，冷春鴻，吳志剛，等.溫郁金遺傳多樣性的ISSR分析[J]，浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2009，21（3）：207-210.

[13] 王佐元，陶銀龍，鄭蔚虹.5個(gè)溫郁金居群遺傳多樣性的ISSR分析[J].高師理科學(xué)刊，2013，33（6）：58-62.

[14] 王曉慧，湯曉闖，楊恩秀，等.莪術(shù)不同種和居群的ISSR-PCR分析[J].中國(guó)中藥雜志，2008，33（18）：2037-2040.