郭春蘭，于春生，張雨竹，宋志儒，楊月，肖亞靜，孫冬梅

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，大慶 163319）

枯草芽孢桿菌（B.subtilis）作為植物病害主要生防細(xì)菌之一，備受各國研究工作者的青睞[1]。B.subtilis在生長代謝過程中能夠產(chǎn)生不同種類的拮抗物質(zhì)，主要為抗生素和抗菌蛋白，大多數(shù)能忍受蛋白酶的作用，但也有一些對蛋白酶敏感[2-3]；且多數(shù)能拮抗細(xì)菌，少數(shù)拮抗真菌[4-5]。國內(nèi)對枯草芽孢桿菌及其代謝產(chǎn)物穩(wěn)定性分析研究也很多，枯草芽胞桿菌B-916中分離出來的對真菌具有較強(qiáng)抑菌活性的蛋白，大小為41.9 kDa，具有一定耐熱性，對蛋白酶敏感，具有較寬的pH 適應(yīng)范圍[6]；具有抑制黃瓜枯萎病原菌作用的枯草芽胞桿菌中純化出具有抑菌活性的蛋白L37，其分子量為15 kDa，該蛋白對多種病原真菌具有抑制效果，且對蛋白酶、溫度等均不敏感，是一種非常穩(wěn)定的抑菌蛋白[7]。拮抗棉花黃萎菌的枯草芽孢桿菌BDT- 2 能產(chǎn)生分子量為約為30 kD 的抑菌物質(zhì)，有較好的酸堿穩(wěn)定性[8]。通過對枯草芽孢桿菌21發(fā)酵液抑菌物質(zhì)的穩(wěn)定性進(jìn)行分析（包括蛋白酶穩(wěn)定性、溫度穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性），并將生的抑菌物質(zhì)進(jìn)行了初步分離，為該菌產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)成分進(jìn)一步分離、純化和結(jié)構(gòu)測定打下了基礎(chǔ)。

1 材料及方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌種

拮抗枯草芽孢桿菌21、玉米圓斑病菌dq-1 由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院生物技術(shù)系微生物實驗室分離并保存。

1.1.2 供試培養(yǎng)基

馬鈴薯培養(yǎng)基（PDA）：去皮馬鈴薯200 g，蔗糖20 g，瓊脂15 g，蒸餾水1000 mL，pH 自然。

牛肉膏蛋白胨（培養(yǎng)基）：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL，pH 自然。

1.2 實驗方法

1.2.1 枯草芽孢桿菌21 上清液的準(zhǔn)備

將活化的枯草芽孢桿菌21 接種到無菌的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，180 r·min-1、28 ℃搖床振蕩培養(yǎng)24 h，作為種子液；將種子液8 mL 接種于裝液量為100 mL 的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件同上培養(yǎng)24 h，所得發(fā)酵液經(jīng)4 000 r·min-1離心，取上清備用。

1.2.2 抑菌物質(zhì)的穩(wěn)定性分析

1.2.2.1 抑菌物質(zhì)的溫度穩(wěn)定性分析

將1.2.1 獲得的發(fā)酵上清液分別經(jīng)40、50、60、70、80、90、100 ℃等不同溫度下處理30 min，以未經(jīng)處理的發(fā)酵上清液為對照，以玉米圓斑病菌為指示菌，采用牛津杯定量擴(kuò)散法進(jìn)行抑菌效果研究，用直徑0.55 cm 的打孔器將活化的玉米圓斑病菌打成大小均勻的菌碟接到PDA 平板的中央，距離菌碟邊緣3 cm 處接上牛津杯，將150 μL 的無菌發(fā)酵液接到牛津杯中，3 d 后測量并記錄抑菌半徑。

1.2.2.2 抑菌物質(zhì)的酸堿穩(wěn)定性分析

將1.2.1 獲得的發(fā)酵上清液分別用1 mol·L-1HCl或 NaOH 調(diào) 成 不 同 pH 值，pH 梯 度 分 別 為2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0，平衡30 min后，以玉米圓斑病菌作為供試菌進(jìn)行活性檢測，以未經(jīng)處理的發(fā)酵上清液為對照，采用牛津杯定量擴(kuò)散法進(jìn)行抑菌效果研究。

1.2.2.3 抑菌物質(zhì)的蛋白酶穩(wěn)定性分析

將1.2.1 獲得的發(fā)酵上清液分別用1N 的NaOH調(diào)至pH=7，加入胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶K、堿性蛋白酶至終濃度為0.2 mg·mL-1，37 ℃水浴中酶解4 h。以未經(jīng)處理的發(fā)酵上清液作對照，以玉米圓斑病菌為指示菌，采用牛津杯定量擴(kuò)散法進(jìn)行抑菌效果研究。相對抑菌能力=處理后的抑菌圈半徑/對照組抑菌半徑×100%。

1.2.3 抑菌物質(zhì)的初步分離

1.2.3.1 硫酸銨分級鹽析

取枯草芽孢桿菌21 發(fā)酵液500 mL，經(jīng)4 000 r·min-1離心10 min 后取上清液，棄除菌體和發(fā)酵殘渣，向上清液中加入固體硫酸銨至20%飽和度（冰浴中），冰箱中靜置6 h 后，4 000 r·min-1離心15 min，收集沉淀。將收集的上清液在冰浴中再加入固體硫酸銨，依次按照同樣的方法調(diào)節(jié)硫酸銨飽和度分別為30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%。收集每一個飽和度的沉淀蛋白，分別溶解在10 mL 50 mmol·L-1pH6.0 的磷酸緩沖液中，轉(zhuǎn)入8 000～14 000 kDa 透析袋中，放在外液為磷酸緩沖液的容器中充分透析脫鹽，3～4 h 更換一次外液，更換外液4～5 次，中間用5%氫氧化鋇檢測除鹽情況。透析好的的蛋白粗提液經(jīng)0.22 μm 孔徑的細(xì)菌過濾器過濾制成無菌濾液，以玉米圓斑病病菌為指示菌，分別測定各沉淀成分的活性。

2 結(jié)果分析

2.1 發(fā)酵液的穩(wěn)定性分析

2.1.1 發(fā)酵液的溫度穩(wěn)定性分析

發(fā)酵液經(jīng)40～50 ℃的不同溫度處理后，與對照組總比抑菌效果沒有明顯的改變，相對抑菌能力穩(wěn)定在88%～100%，與對照差異不顯著（P=0.05）。發(fā)酵液經(jīng)80～90 ℃處理后，抑菌效果發(fā)生明顯變化，相對抑菌能力低于65%，當(dāng)處理溫度為100 ℃時，發(fā)酵液幾乎沒有抑菌效果（圖1，2）。

圖1 抑菌活性物質(zhì)的溫度穩(wěn)定性Fig.1 Heat stability of the antibacterial activity

圖2 抑菌活性物質(zhì)的溫度穩(wěn)定性Fig.2 Heat stability of the antibacterial activity

2.1.2 發(fā)酵液的酸堿穩(wěn)定性分析

發(fā)酵液經(jīng)不同的pH 處理后，在pH 5 之間時抑菌活性穩(wěn)定，與對照組比差異不顯著（P=0.05），當(dāng)pH 值4，6～9 時。抑菌效果發(fā)生明顯的下降趨勢，相對抑菌能力在60%～50%，且與對照組差異顯著（P=0.05），當(dāng)pH值低于4 或高于9 時發(fā)酵液幾乎沒有活性（圖3，4）。

圖3 不同pH 處理對發(fā)酵液的抑菌活性影響Fig.3 Activity of the antibacterial compounds at different pH values

圖4 不同pH 處理對發(fā)酵液的抑菌活性影響Fig.4 Activity of the antibacterial compounds at different pH Values

2.1.3 發(fā)酵液的蛋白酶穩(wěn)定性分析

用不同的蛋白酶對發(fā)酵液進(jìn)行處理后，發(fā)酵液的抑菌活性在堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶的作用下變化較明顯，相對抑菌能力下降到70%～80%，與對照組比差異顯著（P=0.05）胰蛋白酶和蛋白酶K 對發(fā)酵液的抑菌活性影響不大，相對抑菌能力仍在95%以上，與對照組比差異不顯著（P=0.05）（圖5，6）。

圖5 不同蛋白酶處理對發(fā)酵液抑菌活性物質(zhì)的穩(wěn)定性Fig.5 Sensitivity of the antibacterial compounds to proteolytic enzymes

發(fā)酵液的穩(wěn)定發(fā)性分析得到發(fā)酵液在溫度40～50 ℃、pH5，有較好的穩(wěn)定性，但對不同蛋白酶穩(wěn)定性不同，其對堿性蛋白和木瓜蛋白酶較穩(wěn)定，對胰蛋白酶和蛋白酶k 表現(xiàn)很好的穩(wěn)定性。

2.2 粗提蛋白的抑菌效果

由圖7，8 可知，拮抗物質(zhì)在硫酸銨飽和度為30%～70%時被沉淀下來，飽和度為60%以下時沉淀的拮抗物質(zhì)較多，且多次離心等操作會使拮抗物質(zhì)有所損失或失去活性，所以，選定硫酸銨的沉淀濃度為60%。將所得到的粗提物有經(jīng)過茚三酮反應(yīng)，初步確定粗提物為蛋白類。

圖7 不同硫酸銨飽和度沉淀的蛋白質(zhì)的抑菌效果Fig.7 The antibacterial effects of the crude extract proteins after ammonium sulfate precipitation

圖8 不同硫酸銨飽和度沉淀的蛋白質(zhì)的抑菌效果Fig.8 The antibacterial effects of the crude extract proteins after ammonium sulfate precipitation

3 結(jié)論與討論

枯草芽孢桿菌的利用途徑有兩種：一是將制成活菌制劑使用；二是通過發(fā)酵，利用其產(chǎn)生的抗菌活性物質(zhì)?？莶菅挎邨U菌分泌的抗菌物質(zhì)主要有兩類，即低分子量抗菌素和高分子量抗菌蛋白質(zhì)[9]。

研究通過對枯草芽孢桿菌21 的抑菌物質(zhì)進(jìn)行穩(wěn)定性分析和初步分離可知：抑菌成分對蛋白酶具有一定的耐受性，特別是對蛋白酶K 和胰蛋白酶，對溫度和酸堿度比較敏感。除分離的具有耐熱性、耐酸堿性的低分子的抗菌物質(zhì)，也已經(jīng)分離到的分子量較大的蛋白類抑菌物質(zhì)，大部分表現(xiàn)出耐熱性、對酸堿環(huán)境不同的適應(yīng)性以及對蛋白酶的敏感性[10-12]。硫酸銨沉淀法濃縮和初級純化蛋白質(zhì)常用的方法，大多數(shù)的研究者都是通過先用硫酸銨沉淀，在經(jīng)過柱層析或薄層層析，SDS-PAGE 電泳的方法將所得到的蛋白進(jìn)一步純化，進(jìn)行提純的；孫瑤[13]，賈翠英[14]，陳愛香[15]等分離的抑菌蛋白都是先由硫酸銨沉淀方法進(jìn)行粗提的，高濃度的鹽離子在蛋白質(zhì)溶液中可與蛋白質(zhì)競爭水分子，從而破壞蛋白質(zhì)表面的水化膜，降低其溶解度，使之從溶液中沉淀出來，各種蛋白質(zhì)的溶解度不同，因而可利用不同濃度的鹽溶液來沉淀不同的蛋白質(zhì)，這種方法稱之為鹽析。經(jīng)不同硫酸銨飽和度沉淀得到了具有抑菌作用的物質(zhì)為蛋白類的抑菌成分，可能為蛋白類或肽類，是否含有其他的抑菌成分，還需要進(jìn)一步研究，從發(fā)酵液中能得到該物質(zhì)，表明起作用的應(yīng)屬典型的分泌型蛋白，分泌型蛋白的種類現(xiàn)在主要包括低分子抗菌肽和大分子蛋白類，在今后的實驗中經(jīng)進(jìn)一步純化該抑菌蛋白，更好地利用該枯草芽孢桿菌提供理論依據(jù)。

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