孫海森，劉勝軍，李建磊，蔣再慧，崔廣佳，孫超，潘增濤，張瑩

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，大慶 163319）

黑龍江省的肉鵝飼養(yǎng)量和鵝絨產(chǎn)量一直位列全國前茅。在鵝的飼養(yǎng)管理中，繁殖率低一直是制約養(yǎng)鵝業(yè)發(fā)展的重要問題，其中公鵝精液品質(zhì)差是造成繁殖率低的一個(gè)重要因素，表現(xiàn)為精子密度低、畸形率高、精液量少等等，且鵝群中精液質(zhì)量變異較大[1]。所以，在鵝的飼養(yǎng)中，為保證種蛋受精率，公鵝飼養(yǎng)量較大，公母鵝配比較低，由此提高了飼養(yǎng)成本，降低了養(yǎng)殖效益。

從遺傳上提高種公鵝的繁殖力和精液品質(zhì)，是從根本解決該問題的方法[2]。 FSH（Follicle Stimulating Hormone，卵泡刺激素）是一種糖蛋白類促性腺激素，由動物垂體前葉嗜堿性細(xì)胞分泌，促進(jìn)性腺中類固醇激素的生成和配子的發(fā)育[3]。在人類中，F(xiàn)SH 作用于睪丸曲細(xì)精管中的支持細(xì)胞來刺激精子成熟，可以與睪酮協(xié)同作用調(diào)節(jié)支持細(xì)胞的功能，而支持細(xì)胞對精細(xì)胞有支持和營養(yǎng)的作用，調(diào)節(jié)精子的發(fā)生并構(gòu)成血睪屏障[4-5]。FSH 可解離成α 和β 兩個(gè)亞基。

目前已經(jīng)有很多研究將FSHβ 基因作為與家畜精液品質(zhì)相關(guān)的候選基因。Dai（2009）等發(fā)現(xiàn)FSHβ亞基基因外顯子3 上4453 A＞C 突變導(dǎo)致103 位絲氨酸變?yōu)榫彼?，此突變會降低牛精液質(zhì)量和受胎率[6]。韓厚明等[8]研究了雞FSHβ 亞基基因5’調(diào)控區(qū)的單核苷酸多態(tài)性，檢測發(fā)現(xiàn)該區(qū)域存在6 個(gè)SNP位點(diǎn)，即G-494A，T-470A，A-464G，-450 處插入堿基A，A-405G，A-361G，位點(diǎn)與雞早期產(chǎn)蛋性能有關(guān)。牛曉童[6]發(fā)現(xiàn)外顯子FSHβ 外顯子3 的C126T 突變與皖西白鵝和萊茵鵝產(chǎn)蛋量有關(guān)。

FSHβ 亞基基因由3 個(gè)外顯子和2 個(gè)內(nèi)含子組成，其中外顯子1 在cDNA 5’UTR 區(qū)域，只有外顯子2 和部分外顯子3 參與編碼氨基酸。鵝FSHβ 亞基基因mRNA 序列長396 bp（GenBank：EU563910.1），編碼131 個(gè)氨基酸（GenBank：ACC97141.1）。鵝與雞的FSHβ 亞基基因mRNA 同源性為96%（NCBI blastn在線程序比對）。雞的FSHβ 基因編碼的氨基酸中前20 個(gè)為信號肽序列，其余111 個(gè)位成熟蛋白質(zhì)。

鑒于以上FSHβ 基因?qū)影l(fā)生發(fā)育及雌禽的繁殖性能等的重要作用，研究旨在揭示FSHβ 基因的多態(tài)性與公鵝精液品質(zhì)、精子活力等性狀變異的內(nèi)在關(guān)系，探索影響鵝精液品質(zhì)差異的遺傳機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)選用10～11月齡公鵝143 只。群體來自黑龍江省大慶市北方種鵝場。對公鵝進(jìn)行采精訓(xùn)練2周后，按照腹背式按摩法進(jìn)行人工采精，測量每個(gè)個(gè)體的精液體積、精子密度、精子畸形率和精子活率4個(gè)指標(biāo)。4 個(gè)指標(biāo)的測量方法，與之前發(fā)表的文章相同[1]。

1.2 試驗(yàn)方法

對所有試驗(yàn)公鵝翅下靜脈采血，ACD 溶液抗凝，所得血樣-80 ℃保存。使用全血基因組DNA 提取試劑盒（北京博爾誠科技有限公司）提取所有公鵝的DNA 樣本。采用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)檢測FSHβ 基因SNP（C126T）位點(diǎn)的多態(tài)性，對該位點(diǎn)分型使用的是 Sequenom 公司的MassARRAY iPLEX 軟件平臺（Sequenom，San Diego，CA）。檢測試驗(yàn)中使用了兩個(gè)PCR 引物和一個(gè)延伸引物，序列見表1。

表1 基因分型所使用的引物序列Table 1 Primer sequences of the genotyping

SNP 位點(diǎn)的選擇是參考相關(guān)文獻(xiàn)，同時(shí)比對NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫內(nèi)基因信息得到的，并記錄SNP 附近約200 bp 左右的參考序列，用于飛行質(zhì)譜檢測中引物的設(shè)計(jì)。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析方法

基因頻率、基因型頻率的計(jì)算，以及H-W 平衡的檢測是使用SAS 8.0 軟件中的FREQ 過程實(shí)現(xiàn)的（SAS Institute Inc.，Cary，NC）。利用SAS 8.0 軟件中的GLM 過程分析基因型多態(tài)性與精液品質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)性，數(shù)學(xué)模型如下：

Y=μ+S+G+e

其中，Y 為受試個(gè)體精液品質(zhì)性狀的表型值，μ為試驗(yàn)群體平均值，S 為家系的固定效應(yīng)，G 為基因型的固定效應(yīng)，e 為隨機(jī)誤差。

4 個(gè)精液品質(zhì)性狀的相關(guān)性檢驗(yàn)是使用SAS 8.0軟件中的CORR 過程實(shí)現(xiàn)的。

2 結(jié)果與討論

經(jīng)檢驗(yàn)，F(xiàn)SHβ 基因內(nèi)含子2 的126 位點(diǎn)存在一個(gè)C/T 突變，該位點(diǎn)在試驗(yàn)143 只公籽鵝中的基因頻率和基因型頻率見表2。試驗(yàn)群體在該位點(diǎn)有三個(gè)基因型：CC，CT 和TT，其頻率分別是0.08，0.44 和0.48。并且SNP（C126T）位點(diǎn)在試驗(yàn)群體中處于Hardy-Weinberg 平衡（P＞0.05）。說明該群體在該位點(diǎn)未經(jīng)選擇。

表2 FSHβ-C126T 位點(diǎn)基因頻率和基因型頻率及Hardy-Weinberg 平衡檢驗(yàn)Table 2 Gene and genotype frequencies of SNP（C126T）in FSHβ gene and Hardy-Weinberg equilibrium test

由表3 可見，精液體積與精子活率呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），精液體積與精子密度、精子密度與精子活率呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）；其他精液品質(zhì)性狀之間無顯著相關(guān)性（P＞0.05）。

表3 精液品質(zhì)性狀之間的相關(guān)性Table 3 Correlation analysis among the different semen quality traits

從表4 中可以看出，SNP（C126T）位點(diǎn)的三種基因型對精液品質(zhì)性狀有不同影響。精液體積方面，TT型顯著高于CC 型和CT 型（P＜0.05）；精子密度方面，CC 型和TT 型顯著高于CT 型（P＜0.05），CC 型和TT型之間差異不顯著（P＞0.05）；精子活率方面，TT 型和CT 型之間差異不顯著（P＞0.05），但顯著高于CC 型（P＜0.05）；三種基因型的精子畸形率無顯著差異（P＞0.05）。

表4 SNP 基因型與性狀的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果Table 4 Association analysis of SNP（C126T）and semen quality traits

研究在鵝FSHβ 基因內(nèi)發(fā)現(xiàn)單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)SNP（C126T），并且該位點(diǎn)的不同基因型與鵝精液品質(zhì)性狀存在顯著相關(guān)關(guān)系。這說明FSHβ 基因會影響鵝的繁殖性能，這與牛曉童的研究結(jié)論一致[7]。SNP（C126T）位于FSHβ 基因的第2 內(nèi)含子。有大量研究表明，內(nèi)含子的多態(tài)性會影響基因表達(dá)水平，如果蠅和人類的內(nèi)含子突變可引起基因表達(dá)的變化[8]。Jungerius 的研究表明IGF2 基因的三個(gè)內(nèi)含子中的可調(diào)控基因表達(dá)，最終影響豬的脂肪與肌肉的沉積[9]；雌激素受體基因（ESR）內(nèi)含子1 的突變可增加產(chǎn)仔數(shù)[10]；另外，趙要風(fēng)等利用PCR-RFLP 方法檢測香豬FSHβ 亞基基因的多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)其內(nèi)含子1 存在BamH1 酶切位點(diǎn)，可導(dǎo)致豬的產(chǎn)仔數(shù)增加[11]。

2005年，陳少康等用17 條引物篩選了吉林白鵝關(guān)于公鵝繁殖性能的分子標(biāo)記，結(jié)果條帶多態(tài)率90.63%，平均每條引物能夠擴(kuò)增出9.41 個(gè)片段[12]。這樣的結(jié)果說明，調(diào)控公鵝的遺傳機(jī)制還很復(fù)雜。在研究中，由于籽鵝基因組序列尚未完成測序，序列信息不足，也可能造成試驗(yàn)誤差。這使得對于鵝的繁殖力研究更加困難。

綜合以上精液品質(zhì)之間的相關(guān)性和SNP（C126T）位點(diǎn)與精液品質(zhì)性狀之間的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果，初步判斷在FSHβ 基因第2 內(nèi)含子126 位點(diǎn)，TT 型為影響籽鵝精液品質(zhì)的優(yōu)勢基因型，推測在SNP（C126T）位點(diǎn)是純合TT 型的公鵝個(gè)體精液品質(zhì)更佳，繁殖力更強(qiáng)，結(jié)果為提高公鵝繁殖力和精液品質(zhì)的遺傳研究提供了重要的參考信息。

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