彭丁晉

環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)檢測福氏志賀菌的實驗研究

彭丁晉

目的 了解并建立福氏志賀菌的快速、特異的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）檢測方法，探討快速、簡便、有效的消化道傳播性病原體的臨床診斷、飲水檢測和環(huán)境衛(wèi)生監(jiān)測等檢測手段。方法 對福氏志賀菌進行細(xì)菌培養(yǎng)，然后使用聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）和LAMP技術(shù)設(shè)計4條特異性引物，以及使用克隆等分子生物學(xué)方法進行DNA提取，然后對PCR方法與LAMP方法進行對比分析。結(jié)果LAMP擴增具有非常高的特異性，幾乎不會產(chǎn)生非特異性擴增；與PCR方法相比，LAMP檢測限更低，僅為5個拷貝；LAMP在等溫條件下擴增，不會因溫度改變而造成時間的損失，在1h內(nèi)可將靶序列擴增至109～1010倍，并且不需要模板的熱變性。結(jié)論 LAMP技術(shù)具有特異敏感簡單的特點，不需要特殊的儀器，在65℃時1h即可完成反應(yīng)，同時檢測結(jié)果可直接通過肉眼或加入熒光染料即可判斷。

環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)；福氏志賀菌；聚合酶鏈反應(yīng)；檢測；實驗研究

志賀菌屬是主要的腸道病原菌之一，在伯杰手冊（1984）中分為4個群（種）：痢疾志賀菌、福氏志賀菌、鮑氏志賀菌和宋氏志賀菌。志賀菌感染引起的細(xì)菌性痢疾是我國主要的腸道傳染病之一，是世界上，尤其是發(fā)展中國家重要的公共衛(wèi)生問題。為此，為了探尋相關(guān)疾病診斷、食品衛(wèi)生監(jiān)測及傳染病防控等的方便，本研究對我國比較常見的福氏志賀菌進行實驗研究，探討了快速、簡便、有效的消化道傳播性病原體的臨床診斷、飲水檢測和環(huán)境衛(wèi)生監(jiān)測等檢測手段，具體報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 菌種包括：弓形蟲（Toxoplasma gondii）、腸出血型大腸桿菌(Enterohehemorrhagic Escherichia coli) O157：H7、福氏志賀菌、霍亂弧菌（V.cholera）、副溶血性弧菌（V. parahaemolyticus）、輪狀病毒（Rotavirus）G3型及Norwalk病毒（Norovirus）GII型。

1.2 試劑與儀器 實驗設(shè)備包括：電子分析天平、低溫冰箱、常規(guī)顯微鏡、熒光顯微鏡、CO2培養(yǎng)箱、聚合酶鏈反應(yīng)儀、電泳儀等。培養(yǎng)基包括：營養(yǎng)瓊脂，營養(yǎng)肉湯，LB瓊脂平板。試劑包括：FTA緩沖液及Filter，TE緩沖液，TAE緩沖液，瓊脂糖凝膠，PCR反應(yīng)試劑，Bst DNA聚合酶，引物，24∶1的氯仿異戊醇，25∶24∶1的酚氯仿異戊醇，70%的乙醇，異丙醇，濃度為5mol/L的氯化鈉，10%的十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate,sodium salt，SDS），氨水，石油醚，無水乙醇，氯仿，裂解液，限制性核酸內(nèi)切酶等。

1.3 方法 所有方法流程為：相關(guān)病原體待擴增靶基因的選取→利用環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)，專用引物軟件設(shè)計4條常規(guī)引物→相關(guān)病原體的準(zhǔn)備及基因組DNA的提取→LAMP擴增反應(yīng)條件的優(yōu)化和建立→LAMP法與PCR比較（包括酶切鑒定和測序鑒定）→數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。菌種培養(yǎng)方法：使用平板劃線法在營養(yǎng)瓊脂平板培養(yǎng)基中將儲存好的福氏志賀菌進行單菌落分離，然后將其放進37℃的恒溫環(huán)境中培養(yǎng)進行12h的倒置培養(yǎng)。然后再將單菌落樣品與3mL液體培養(yǎng)基進行接種，并放在37℃的恒溫環(huán)境中培養(yǎng)12h。然后再將培養(yǎng)好的樣品與120mL相同的液體培養(yǎng)基進行接種，并放在37℃的恒溫環(huán)境中培養(yǎng)12h，然后在4℃環(huán)境中保存?zhèn)溆谩?/p>

福氏志賀菌基因組提取方法：先在1.5mL的離心管中放入

1mL培養(yǎng)液離心1min，離心率為11000轉(zhuǎn)/min。然后去掉上清液。然后使用滅菌純水對菌體進行清洗，進而沉淀，反復(fù)2次。然后加入裂解液50μL，并在37℃的恒定環(huán)境中放置10min。然后再加三蒸水100μL進行懸浮，并進行煮沸，持續(xù)10min，然后使用離心試管離心1min，離心率為11000轉(zhuǎn)/min，再去上清液以備用。

引物制定和測試方法為：（1）目的基因的選取，登陸Genbank查詢目的基因序列，利用LAMP專用軟件設(shè)計4條特異性引物;（2）相關(guān)病原體的準(zhǔn)備和基因組DNA的提取，并用PCR鑒定;（3）LAMP擴增反應(yīng)條件的優(yōu)化和建立;（4）LAMP與PCR的敏感性和特異性的比較;（5）酶切鑒定LAMP產(chǎn)物;（6）測序鑒定LAMP產(chǎn)物。

2 結(jié)果

2.1 LAMP檢測方法的建立 采用設(shè)計的針對ipaH基因的LAMP引物對福氏志賀菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 12022DNA模板進行擴增，電泳結(jié)果顯示在凝膠上出現(xiàn)典型的LAMP反應(yīng)梯形電泳條帶，陰性對照無條帶，表明擴增結(jié)果為陽性，結(jié)果真實可信。肉眼觀察反應(yīng)管，發(fā)現(xiàn)陽性反應(yīng)管中液體出現(xiàn)少量混濁，離心可見白色沉淀，而陰性對照管中無變化。分別加入1μL熒光染料1000×SYBR GREEN I，發(fā)現(xiàn)陽性反應(yīng)管中液體變綠色，而陰性對照管呈現(xiàn)橙色。見圖1～圖3。

圖1 志賀菌LAMP檢測電泳結(jié)果

圖2 志賀菌LAMP檢測濁度結(jié)果

圖3 志賀菌LAMP 檢測熒光染料分析結(jié)果

2.2 特異性 采用優(yōu)化的LAMP反應(yīng)體系擴增，同時對所有收集到的驗證菌株開展LAMP引物特異性驗證，部分驗證結(jié)果見圖4。結(jié)果顯示目標(biāo)菌均可被檢出，其它非目標(biāo)菌均未見擴增，表明所設(shè)計引物特異性強，反應(yīng)體系適宜。

2.3 靈敏度 經(jīng)平板計數(shù)法算出志賀菌原始菌濃度為6.1×106cfu/mL，比較目標(biāo)菌的LAMP和PCR檢測靈敏度，結(jié)果見圖5。LAMP和PCR檢測靈敏度分別為：6.1×101cfu/ mL和6.1×102cfu/mL，LAMP比PCR靈敏度高1個數(shù)量級。

圖4 志賀菌LAMP 特異性驗證結(jié)果

圖5 志賀菌LAMP和PCR靈敏度結(jié)果

3 討論

在我國以福氏引起的菌痢較為多見。目前，我國福氏志賀菌的診斷仍主要依靠傳統(tǒng)的檢測方法，已不能滿足疾病早期檢測的需要[1-2]。近年來，不斷發(fā)展的免疫熒光技術(shù)、酶聯(lián)免疫技術(shù)、放射免疫技術(shù)等免疫學(xué)方法已逐步應(yīng)用于病原體的檢測，但仍存在操作繁瑣、敏感性偏低等問題[3]。各式PCR方法敏感、準(zhǔn)確、快速，可替代病原學(xué)檢測，但需要昂貴的儀器設(shè)備、較高檢測費用以及對檢測人員較高的技術(shù)要求而使其不能用于病原體現(xiàn)場快速檢測和基層普及應(yīng)用。因此，建立特異、便捷的檢測方法對病原體的早期診斷和疾病控制都具有非常重要的意義[4-5]。LAMP技術(shù)是一種新型等溫核酸擴增方法，針對靶基因的6個位點設(shè)計4條LAMP引物，利用一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶（Bst DNA聚合酶），在恒溫條件(65℃左右)保溫約60min，即可完成核酸擴增反應(yīng)，反應(yīng)速度還可通過設(shè)計2條環(huán)引物使其增加1/2～1/3，由于LAMP引物的設(shè)計針對靶基因的位點比PCR多，故比PCR特異性更強，另外LAMP反應(yīng)能產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物-焦磷酸鎂離子，在反應(yīng)管中形成白色混濁，結(jié)果可通過肉眼或者濁度計對擴增副產(chǎn)物焦磷酸鎂沉淀的濁度進行判定；也可用結(jié)合雙鏈DNA的熒光染料SYBR Green I染色，在紫外燈下或日光下通過肉眼進行判定，如果含有擴增產(chǎn)物，反應(yīng)混合物變綠；反之，則保持 SYBR Green I 的橙色不變。通過逆轉(zhuǎn)錄酶，還可進行RT-LAMP而完成針對RNA的擴增。該技術(shù)具有不需要PCR儀、肉眼可判斷結(jié)果及反應(yīng)時間短等優(yōu)點，目前已有成功用于病原體檢測的報道[6-7]。

從本研究來看，LAMP技術(shù)具有以下4個優(yōu)點：（1）特異性強：4條引物對靶序列的6個特異序列區(qū)的識別，保證了LAMP擴增的高度特異性，幾乎不會產(chǎn)生非特異性擴增。（2）敏感性高：與PCR相比，其檢測限更低，僅為5個拷貝。（3）等溫高效：LAMP在等溫條件下擴增，不會因溫度改變而造成時間的損失，在1h內(nèi)可將靶序列擴增至109～1010倍，且不需要模板的熱變性。（4）操作簡便：反應(yīng)不需PCR儀和特殊試劑；產(chǎn)物檢測不需繁瑣的電泳，肉眼即可判定。通過逆轉(zhuǎn)錄酶，LAMP還能進行RNA高效擴增?？傊摷夹g(shù)具有特異、敏感、不需要PCR儀、肉眼可判斷結(jié)果及反應(yīng)時間短等優(yōu)點。

從檢測的敏感度和準(zhǔn)確度來講，其對DNA模板的純度的依賴非常大，同時模板上DNA的量也是影響檢測敏感度和準(zhǔn)確度的重要因素。本研究使用了FTA濾膜，使得在測量菌懸液的濃度時，測量的數(shù)值可以高達62cfu/mL，遠遠高于文獻報道的最高值1062cfu/ mL[7]。雖然普通裂解法跟FTA提取法一樣，都具有操作容易、檢測時間短的優(yōu)點。但是，普通熱裂解容易導(dǎo)致模板出錯，從而可能延遲時間。而傳統(tǒng)的試劑盒法、飽和酚法、熱裂解法的檢測時間都比較長，而FTA法則兼具操作簡單和檢測時間短的優(yōu)點，遂為實驗室廣泛采用的方法。而在實際的檢測過程中，由于檢測品都含有大量的淀粉、脂肪、金屬離子、膠原蛋白及相關(guān)的蛋白質(zhì)，因此會影響致病菌檢測的靈敏度。而使用FTA濾膜，則可以完全避免其影響，其對DNA的吸附完全可以抵消上述因素的影響，故而其靈敏度比較高，同時操作也比較簡單，比較利于現(xiàn)實的食品安全檢測。

在實驗過程中，靶基因的選擇是保證實驗檢測特異度的關(guān)鍵。一般來講都是選擇檢測特異性比較好的保守的基因作為靶基因，并以此設(shè)計好相應(yīng)的引物，這是保證本實驗高特異性的關(guān)鍵步驟。對于福氏志賀菌的研究，研究者對于引物的選擇差異比較大，因此也決定了研究結(jié)果的天差萬別[8-9]。但總體來講，選擇引物的原則是：選擇基因的保守區(qū)，同時優(yōu)先選擇發(fā)夾型的結(jié)構(gòu)，經(jīng)過嚴(yán)格的NCBI比對，對那些堿基互補良好，Tm值比較適中，而且G+C%的含量比較符合的基因進行優(yōu)先考慮。唯有如此，才能真正保證現(xiàn)實檢測的特異度?？梢姡锏倪x擇是決定LAMP法能否成果的關(guān)鍵。在整個檢測過程中，擴增溫度的優(yōu)化、體系的配置以及引物濃度的配置都是非常重要的。通過本實驗結(jié)果來看，最佳的擴增溫度為65℃。LAMP法操作簡單、特異度高，使用PCR法其測試的成本非常高，而且操作不易，敏感度和特異度不能與LAMP法相比較。但是，LAMP法也有其缺點，主要是因為LAMP法的反應(yīng)體系不太穩(wěn)定，因此需要進行擴增4個引物，其與酶共同進行反應(yīng)測試才可以得到比較好的結(jié)果[10]。因此，對于LAMP法的研究還需要持續(xù)，對不同的反應(yīng)體系進行測試，以酶切反應(yīng)的結(jié)果進行校準(zhǔn)，從而達到優(yōu)化體系的目的。雖然LAMP法有這一缺點，但由于其操作簡單、時間短的優(yōu)點，因此臨床開發(fā)的價值非常大。

而且，本研究建立了人乳福氏志賀菌的快速、特異的LAMP檢測方法，優(yōu)化反應(yīng)條件研制出相應(yīng)病原體的現(xiàn)場快速檢測試劑盒。相信這樣的試劑盒開發(fā)，將會有非常的實際應(yīng)用價值。總而言之，LAMP技術(shù)具有特異敏感簡單的特點，不需要特殊的儀器，在65℃時1h即可完成反應(yīng)，同時檢測結(jié)果可直接通過肉眼或加入熒光染料即可判斷，非常值得進行技術(shù)推廣。

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Objective To study on LAMP detection of Shigella flexner and investigate the fast, simple, effective gastrointestinal borne pathogens of clinical diagnosis, drinking water testing and environmental health monitoring and other detection methods. Methods Shigella flexneri were cultured, and then used the PCR and LAMP technology to design 4 primers, and the use of cloning and other molecular biology methods for DNA extraction, and then the PCR method and LAMP method were compared and analyzed.Results LAMP amplification had very high specificity, there was almost no nonspecific amplification; compared with the PCR method, the detection limit of LAMP was lower, only 5 copies; LAMP amplification under isothermal conditions, no time loss caused by temperature change, within the 1h target sequence could be amplified to 109-1010 times. Conclusion LAMP technology has the characteristics of specific sensitive simple, does not require special equipment, to complete the 1h reaction at 65℃, and the detection results can be directly by the naked eye or adding fluorescent dye can be judged.

LAMP; Shigella flexneri; CPR; Detection; Experimental study

10.3969/j.issn.1009-4393.2015.5.001

湖南省教育廳課題 （11C1163）

湖南 422000 邵陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校微生物教研室（彭丁晉）