張立辰，生威，胡高爽，張燕，王碩（天津科技大學食品工程與生物技術學院，教育部食品營養(yǎng)與安全重點實驗室，天津300457）

基于氯霉素單克隆抗體的ELISA方法的建立

張立辰，生威，胡高爽，張燕，王碩*
（天津科技大學食品工程與生物技術學院，教育部食品營養(yǎng)與安全重點實驗室，天津300457）

摘要：旨在建立一種用于檢測海產(chǎn)品中氯霉素殘留的ELISA檢測方法。利用活化酯法將氯霉素半抗原連接到載體蛋白KLH上，制備氯霉素人工抗原，并免疫小鼠。通過雜交瘤技術篩選出一株能穩(wěn)定分泌抗體的細胞株10A3B6E，經(jīng)小鼠體內培養(yǎng)制備腹水并經(jīng)純化得到單克隆抗體。單克隆抗體的重鏈為IgG1，輕鏈為Kappa。通過對免疫分析方法工作條件的優(yōu)化，建立了一種簡便、快捷、實用的檢測氯霉素的直接競爭ELISA方法。該方法IC50值為（0.54±0.04）ng/mL，IC15值為（0.10±0.03）ng/mL。該抗體與氯霉素琥珀酸鈉、甲砜霉素、氟甲砜霉素、鏈霉素的交叉反應率分別為78%、0.09%、0.25%和0.05%，與四環(huán)素的交叉反應率低于0.002%，說明該抗體是一種高特異性抗體。利用所建立的直接競爭ELISA方法對鱈魚和蝦樣品進行檢測，添加回收率在62.6%～120.0%之間，變異系數(shù)在0.94%～13.52%之間。本研究所建立的直接競爭ELISA方法具有較好的準確性和靈敏度，可以用來對海產(chǎn)品中的氯霉素殘留情況進行檢測。

關鍵詞：氯霉素；海產(chǎn)品；獸藥殘留；單克隆抗體；直接競爭ELISA

氯霉素是由委內瑞拉鏈霉菌的培養(yǎng)液中提取出來的一種抗生素類藥物，現(xiàn)主要用合成法生產(chǎn)[1]。氯霉素類藥物具有吸收良好、價格便宜、抑菌性強和體內分布廣泛等特點，因而被廣泛應用于水產(chǎn)動物疾病防控[2]。但是，氯霉素在養(yǎng)殖業(yè)生產(chǎn)中的過量使用會對食用者造成過敏、再生性障礙貧血、機體正常菌群失調和誘發(fā)癌癥等危害[3]。農(nóng)業(yè)部在2002年發(fā)布的第235號公告《動物源性食品中獸藥最高殘留限量》中明確規(guī)定禁止氯霉素在所有可食動物中使用，在所有的可食動物組織中，不得有氯霉素檢出。

目前，用于動物源性食品中氯霉素殘留的國家標準檢測方法是氣相色譜-質譜法和液相色譜-質譜-質譜法[4]。除此之外，傳統(tǒng)的檢測方法還有微生物法[5]、高效液相色譜法[6]、液相色譜電噴霧質譜聯(lián)用法[7]、毛細管電泳法[8]和免疫檢測方法[9-13]等。免疫檢測方法具有成本低、檢測時間短、易于操作、靈敏度高等優(yōu)點，因而在實際生產(chǎn)中得到廣泛的應用。本研究使用單克隆抗體技術，得到了一種高特異性的單克隆抗體，并利用該抗體建立了一種用于檢測海產(chǎn)品中氯霉素殘留的直接競爭ELISA方法。

1　材料與方法

1.1免疫動物與細胞株

實驗動物為健康雌性BALB/c小鼠：購自北京軍事醫(yī)學科學院。骨髓瘤細胞為SP2/0細胞：教育部食品營養(yǎng)與安全重點實驗室保存。

1.2試劑

氯霉素（CAP）標準品：購置于德國Dr.Ehrenstorfer公司；氯霉素琥珀酸鈉標準品、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）、N，N-二環(huán)己基碳二亞胺（DCC）、鑰孔嘁血藍蛋白（KLH）、辣根過氧化氫酶（HRP）、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑：均購置于美國Sigma公司；Free DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、HAT、HT、青鏈霉素雙抗：均購置于美國GIBCO公司；單克隆抗體亞型鑒定試劑盒：購置于美國Thermo公司；四氫呋喃：購置于天津市化學試劑六廠；乙酸乙酯：購置于國藥集團化學試劑有限公司。

1.3人工抗原的合成

1.3.1氯霉素半抗原與活化酯的合成

1.3.1.1氯霉素琥珀酸的合成

稱取氯霉素琥珀酸鈉1.1 g，溶于3 mL去離子水中，用1 mol/L HCl調pH到2，可以見到溶液中有大量沉淀生成。收集沉淀，用去離子水洗滌，凍干，即可得到白色粉末狀氯霉素琥珀酸。

1.3.1.2氯霉素琥珀酸活化酯的合成

稱取上步反應制得的氯霉素琥珀酸423.2 mg、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）126.7 mg溶于20 mL無水四氫呋喃（THF）中，冰浴環(huán)境下攪拌0.5 h。將227.0 mg N，N-二環(huán)己基碳二亞胺（DCC）溶于5 mL THF溶液，隨后加入到上述反應體系中。冰浴下繼續(xù)攪拌1 h，撤掉冰浴，攪拌過夜。用硅膠柱分離目標產(chǎn)物和其它雜質（展開劑，乙酸乙酯∶石油醚＝3∶1）。氯仿—石油醚重結晶，得到白色晶狀氯霉素琥珀酸活化酯固體。

1.3.2氯霉素免疫原的制備

將10 mg KLH載體蛋白溶于2 mL PBS中。稱取制得的氯霉素活化酯1 mg，用100 μL DMF溶解。在冰浴條件下，將活化酯溶液緩慢加入到蛋白溶液中。4℃反應16 h，反應結束后4℃透析3 d[透析液為0.01 mol/L、pH為7.4的磷酸鹽緩沖溶液（PBS）]，即可得到氯霉素免疫原，將免疫原置于-20℃下儲存。

1.3.3氯霉素酶標抗原的制備

將2mg辣根過氧化物酶（HRP）溶于2mL、50mol/L的磷酸氫二鉀溶液中。稱取氯霉素活化酯0.2 mg，用50 μL DMF溶解。在冰浴條件下，將活化酯溶液緩慢加入到蛋白溶液中。4℃反應16 h，反應結束后4℃透析3 d，即可得到氯霉素酶標抗原，將酶標抗原與等體積甘油混勻，置于-20℃下儲存。

1.4單克隆抗體的制備

1.4.1動物免疫

將制備好的氯霉素免疫原用生理鹽水稀釋成1 μg/μL的溶液（質量以載體蛋白的量計算），用等量弗氏完全佐劑制成油包水乳濁液。采用腹腔注射法免疫BALB/c小鼠，每只200 μL乳化劑（其中含有100 μg免疫原）。初次免疫后14 d進行第二次免疫，劑量與初免相同，但佐劑換為弗氏不完全佐劑，以后每隔14天免疫1次，所用佐劑都為弗氏不完全佐劑。用間接ELISA法測定小鼠的抗血清效價與特異性，選擇抗血清效價高、特異性強的小鼠進行細胞融合實驗。在第三次免疫完成后的14 d內進行沖刺免疫，免疫前不需乳化，但免疫原量加倍，沖刺免疫后3 d進行細胞融合。

1.4.2細胞融合與篩選

取出小鼠的脾臟，將小鼠的脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞融合。融合后的細胞加入96孔板中，用含有HAT的培養(yǎng)基培養(yǎng)。用間接ELISA法篩選出能夠特異性分泌氯霉素抗體的細胞。用有限稀釋法進行克隆化，得到能夠穩(wěn)定分泌氯霉素抗體的雜交瘤細胞株。1.4.3單克隆抗體的大量制備與純化

選取10周齡大的Balb/c小鼠，將石蠟油注入小鼠腹腔中。7 d后將篩選得到的細胞株接種到小鼠腹腔中制備腹水，收集的腹水4 000 r/min下離心10 min，除去脂肪、纖維和細胞，收集中層的液體，-20℃下儲存。腹水采用辛酸-硫酸銨沉淀法純化。

1.5抗體的亞型鑒定

使用單克隆抗體亞型鑒定試劑盒（Therm，USA）對細胞株所產(chǎn)抗體進行亞型鑒定。

1.6直接競爭ELISA檢測方法的操作步驟

將氯霉素單克隆抗體用包被緩沖液稀釋，以每孔100 μL（抗體0.01 μg/孔）的體積加入到96孔酶標板中。將酶標板放置于4℃條件下過夜。第二天棄去孔中液體，用PBST清洗板孔3次，拍干；每孔加入200 μL封閉液（0.5%脫脂乳粉），37℃下孵育1 h，棄去孔中液體，洗板3次，拍干；每孔加入50 μL稀釋到一定濃度的標準品（或樣品）和50 μL的酶標抗原，以加入50 μL PBS和50 μL酶標抗原的孔作為對照，只加入100 μL PBS的孔作為空白，37℃孵育1 h，洗板3次，拍干；每孔加入100 μL顯色液，37℃顯色15 min后，每孔加入50 μL終止液終止顯色反應。在雙波長方式（450 nm為檢測波長，650 nm為參比波長）下用酶標儀測定各孔的OD值。

1.7樣品稀釋液離子強度和pH的優(yōu)化

分別使用0.01、0.03 mol/L和0.05 mol/L的PBS （pH 7.4）作為樣品稀釋液，建立直接競爭ELISA標準曲線，選擇方法IC50值較低，且ODmax值（對照孔的吸光度值）較為適宜的PBS濃度。

在相同離子強度的前提下，分別使用pH為5.7、7.4和8.5的PBS作為樣品稀釋液，建立直接競爭ELISA標準曲線，選擇方法IC50值較低，且ODmax值較為適宜的pH的PBS。

1.8抗體交叉反應性的測定

使用3種氯霉素的結構類似物（氯霉素琥珀酸鈉、甲砜霉素、氟甲砜霉素）和兩種其它獸藥（鏈霉素、四環(huán)素）代替氯霉素用直接競爭ELISA法建立標準曲線，并分別計算其IC50值。交叉反應率計算公式如下：

1.9樣品處理

稱取2 g均質過的樣品（鱈魚或對蝦），加入6 mL乙酸乙酯，震蕩1 min，4 729 r/min離心20 min。取3 mL上清液，60℃下氮氣吹干。1 mL PBS（0.05 mol/L，pH5.7）復溶殘余物，用于ELISA檢測。

1.10添加回收率的測定

向鱈魚、對蝦樣品中分別添加10、30、100 ng/g的氯霉素，用以上優(yōu)化好的方法處理樣品后，用直接競爭ELISA方法檢測樣品中氯霉素的含量并計算相應的回收率。

2　結果與討論

2.1小鼠抗血清效價與特異性測定

經(jīng)過3次免疫，小鼠體內抗血清的效價都能達到1∶64 000。從中選擇抗血清特異性最強的小鼠，進行細胞融合實驗。

2.2單克隆抗體細胞篩選

經(jīng)過細胞融合與篩選，最終得到一株既能穩(wěn)定分泌氯霉素單克隆抗體、又能無限增殖的雜交瘤細胞10A3B6E。細胞上清液特異性測定對100 ng/mL氯霉素標準品抑制率為91%。

2.3單克隆抗體亞型鑒定

經(jīng)單克隆抗體亞型鑒定試劑盒鑒定，細胞株10A3B6E所產(chǎn)單克隆抗體重鏈亞型為IgG1，輕鏈亞型為Kappa。

2.4標準品稀釋液離子強度和pH的優(yōu)化

分別使用3種不同離子強度的PBS作為稀釋液進行標準曲線的建立見表1。

表1　稀釋液離子強度的優(yōu)化Table 1　Optimization of ionic strength of assay buffer

如表1，不同濃度的PBS對ODmax的影響不大，但用0.05 mol/L的PBS建立的標準曲線IC50值最低，因此在后續(xù)實驗中采用該種PBS。

在0.05 mol/L的濃度下，分別使用3種不同pH的PBS作為稀釋液進行標準曲線的建立見表2。

表2　稀釋液pH的優(yōu)化Table 2　Optimization of pH of assay buffer

如表2，不同pH的PBS對ODmax的影響不大，但用pH 5.7的PBS建立的標準曲線IC50值最低，因此在后續(xù)實驗中采用該種PBS。

2.5氯霉素ELISA方法標準曲線

以氯霉素濃度的對數(shù)值作為標準曲線的橫坐標，以抑制率作為縱坐標建立標準曲線，如圖1所示。

圖1　氯霉素直接競爭ELISA標準抑制曲線Fig.1　Standard inhibition curve of ELISA for chloramphenicol

IC50值為（0.54±0.04）ng/mL、IC15值為（0.10±0.03）ng/mL。

2.6抗體交叉反應性

抗體交叉反應的結果如表3所示。

表3　氯霉素抗體與其它獸藥的交叉反應Table 3　Cross-reactivity of chloramphenicol monoclonal antibody with other veterinary drugs

該單克隆抗體與氯霉素琥珀酸鈉有較大的交叉反應，這是由于半抗原是用氯霉素琥珀酸鈉合成的。而抗體與其結構類似物：氟甲砜霉素、甲砜霉素交叉反應較小，與其他常用獸藥鏈霉素、四環(huán)素并無交叉反應。說明該單克隆抗體對氯霉素有很好的特異性。

2.7添加回收實驗

將3種不同濃度的氯霉素標準品添加到鱈魚與對蝦樣品中，進行添加回收實驗見表4。

表4　ELISA檢測樣品中氯霉素含量的回收率Table 4　Recoveries of chloramphenicol in spiked samples by ELISA

如表4所示，添加回收率在62.6%～120%之間，變異系數(shù)在0.94%～13.52%之間，方法具有較好的準確性和靈敏度。

3　結論

氯霉素相對分子質量為323.13，是一種小分子物質。本身不具有免疫原性，必須與大分子載體蛋白連接才能在動物體內形成免疫應答。本研究將氯霉素的衍生物氯霉素琥珀酸鈉用鹽酸酸化形成羧基末端，制備半抗原氯霉素琥珀酸。利用活化酯法將半抗原與載體蛋白KLH偶聯(lián)制備人工免疫原。免疫原免疫小鼠后，利用雜交瘤技術，制得氯霉素單克隆抗體。使用該單克隆抗體建立的直接競爭ELISA檢測方法，IC50值為（0.54±0.04）ng/mL，IC15值為（0.10±0.03）ng/mL?？贵w與合成半抗原的原料氯霉素琥珀酸鈉有交叉反應，與其余幾種常用獸藥交叉反應很小，特異性較好。通過對鱈魚、對蝦兩種基質的樣品檢測可以看出，方法有很好的準確性。所建立的直接競爭ELISA方法可以應用于海產(chǎn)品中氯霉素殘留的檢測。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.24.033

收稿日期：2014-07-16

基金項目：“十二五”國家科技支撐計劃（2012BAD28B05）；天津市科技計劃項目（11ZCGHHZ01100）

作者簡介：張立辰（1988—），男（漢），碩士，研究方向：食品安全檢測。*通信作者：王碩（1969—），教授，博導，研究方向：食品安全和免疫學檢測。

Study on An Enzyme Linked Immunosorbent Assay Based on A Monoclonal Antibody for the Detection of Chloramphenicol

ZHANG Li-chen，SHENG Wei，HU Gao-shuang，ZHANG Yan，WANG Shuo*
（Key Laboratory of Food Nutrition and Safety，Ministry of Education of China，The School of Food Engineering and Biological Technology Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China）

Abstract：The aim of this research was to develop an ELISA to detect chloramphenicol in marine products.The chloramphenicol succinate was conjugated to keyhole limpet hemocyanin by activated ester method to prepare the immunogen for immunizing mices.Through a hybridoma cell line，a strain of cells which can produce antichloramphenicol monoclonal antibody was obtained.Ascites was produced by mice vivo culcure and purified to obtain monoclonal antibody.The heavy chain of the antibody was IgG1，and the light chain was Kappa.A direct competitive ELISA using above-mentioned monoclonal antibody was developed for the detection of chloramphenicol by optimizing the working conditions of assay.The IC50value was（0.54±0.04）ng/mL，IC15value was（0.10±0.03）ng/mL.Cross-reactivities with chloramphenicol sodium succinate，thiamphenicol，florfenicol，streptomycin and tetracycline were 78%，0.09%，0.25%，0.05%and＜0.002%respectively，which indicated that the assay had high specificity.The recoveries for chloramphenicol from cod and shrimp samples were ranged from 62.6%to 120%and the coefficients of variation were between 0.94%-13.52%.The ELISA allows for a rapid，sensitive，specific，accurate，and low-cost determination of chloramphenicol residues in marine products.

Key words：chloramphenicol；marine products；veterinary drug residues；monoclone antibody；direct competitive ELISA