拜錦美+洪加平+成強(qiáng)+陳京都+吳紅軍

摘要：以膠體金免疫層析法為研究方法，研究免疫分析技術(shù)在獸藥殘留檢測中的應(yīng)用效果。建立一種用于快速檢測動物制品中磺胺類藥物的膠體金免疫層析法，檢測動物制品中磺胺類藥物殘留。膠體金采用檸檬酸三鈉還原法制備顆粒直徑為20 mm的膠體金纖維素膜，對待測樣品中的磺胺類藥物羽包被抗原中競爭集合膠體金標(biāo)記抗磺胺類藥物多克隆抗體相結(jié)合，用肉眼觀察檢測線顏色深淺變化。采用該種檢測手段，對豬肉、肌肉和魚類樣品進(jìn)行簡單提取和稀釋之后，就能夠直接開始檢測。視覺檢測限度為0.01 mg/kg，檢測時間在10 min以內(nèi)，操作簡便，靈敏性較高。膠體金免疫層析法具有較高的靈敏性和特異性，整個操作過程簡單，容易操作，檢測結(jié)穩(wěn)定，可以作為磺胺類藥物現(xiàn)場檢查使用，在今后的動物獸藥殘留檢測中值得推廣應(yīng)用。

關(guān)鍵詞：膠體金層析法；獸藥殘留；應(yīng)用

拜錦美，洪加平，成 強(qiáng)，等. 免疫分析技術(shù)在獸藥殘留檢測中的有效利用[J]. 農(nóng)業(yè)工程技術(shù)，2017，37（08）：14+17

進(jìn)入新世紀(jì)以來，畜牧產(chǎn)業(yè)不斷向前發(fā)展，獸藥在畜牧產(chǎn)業(yè)中的應(yīng)用范圍和應(yīng)用頻率在逐年增加，其在防控多種疾病，促進(jìn)畜禽動物健康生長、提高飼料利用率和改善畜禽產(chǎn)品質(zhì)量以及品質(zhì)方面發(fā)揮著十分重要的作用，逐漸成為未來現(xiàn)代化畜牧產(chǎn)業(yè)發(fā)展不可或缺的生產(chǎn)資料。

但是畜牧行業(yè)在使用獸藥過程中還存在很多問題，大劑量、多種類的過度使用，導(dǎo)致了動物體內(nèi)的藥物積累量不斷提升，在整個動物養(yǎng)殖周期內(nèi)，動物很難全部將其代謝出去。消費(fèi)者在購買了藥物殘留的畜禽產(chǎn)品之后，將過量的藥物引入人的體內(nèi)，最終導(dǎo)致人藥物蓄積，給肝腎造成嚴(yán)重負(fù)擔(dān)。

現(xiàn)階段，動物制品藥物殘留已經(jīng)成為制約畜牧產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵性因素。為了解決獸藥殘留問題，本次研究過程中建立了一種用于快速檢測獸藥殘留的膠體金層析檢測法。

1 試驗(yàn)方法和試驗(yàn)材料

1.1 試驗(yàn)材料和儀器

試驗(yàn)材料：氯金酸、磺胺異噁唑、磺胺噻唑、磺胺氯噠嗪、磺胺甲二唑、聚乙二醇、牛血清白蛋白、羊抗兔IgG、抗磺胺類多克隆抗體、磺胺類半抗原[1]。

儀器：硝酸纖維素膜、蛋白純化儀、紫外/可見分光光度計、樣品墊、膠體金結(jié)合墊、吸水墊、PVC 襯板、劃膜儀、切條機(jī)[2]。

購于市場的豬肉、雞肉和鯽魚，液相儀器檢測為不含磺胺類藥物的陰性樣品。

1.2 膠體金免疫層析試紙條制備

首先，采用免疫親和層析法對磺胺類藥物多克隆抗體進(jìn)行純化；其次，膠體金制備[3]。將100 mL0.01%的氯金酸用恒溫電磁攪拌器加熱到沸騰，加熱攪拌的同時向其中添加2 mL1%的檸檬酸三鈉，當(dāng)溶液變?yōu)闊o色繼續(xù)攪拌8 min，冷卻到室溫環(huán)境下，向其中加入雙蒸水回復(fù)到原來體積，在4℃的冰箱中保溫。

膠體金1 mL，用0.2 mol/L的碳酸鉀溶液調(diào)節(jié)膠體pH值到9.0，一邊攪拌一邊加入抗磺胺類多克隆抗體28 ?g，充分?jǐn)嚢? min后靜置50 min，再向其中添加10 mL濃度為20%的聚乙二醇和20 ?L濃度為20%牛血清蛋白溶液，充分?jǐn)嚢? min，4℃離心3 min處理，將上層100 ?L清夜去除，然后保存。

配制金標(biāo)抗體稀釋液。100 mL雙蒸水加入12 g的三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽，1 mLTween-20，1 g的牛血清蛋白和0.5 mL的聚乙二醇以及0.5 mL含量為10%的疊氮鈉溶液。

膠體金免疫層析條制備[4]。將包被好的磷酸鹽緩沖溶液稀釋為原來濃度的1、2、4、6、8倍，將劃膜儀器的參數(shù)設(shè)定為0.6、0.8、1.0、1.2 ?L/cm，劃膜干燥后使用金標(biāo)抗體按照1：4、1：8、1：10、1：12、1：15的比例稀釋，觀察試紙條控制線和檢測線的長度以及顏色變化情況；最后，準(zhǔn)確稱量豬肉、雞肉和魚肉2 g，切碎后放入試劑瓶中加入0.5 mL和1.5 mL的甲醇和PBST溶液，均勻攪拌后過濾，得到的濾液用磷酸鹽緩沖溶液稀釋10倍[5]。

2 結(jié)果分析

2.1 膠體金測試條靈敏度分析

將待測樣品滴入樣品墊上，由于毛細(xì)管作用，樣品中的磺胺類藥物和固定在顯色中的包被抗原競爭結(jié)合膠體金標(biāo)記的抗體相結(jié)合，磺胺類藥物的含量越高，與抗體結(jié)合的越少，從而使得檢測線的周圍和空白對照區(qū)域顏色較淺。檢測線所固定的包被抗原所結(jié)合的金標(biāo)抗體少于一定數(shù)量的話，檢測線顏色就會消失，而質(zhì)控線會始終顯示紅色。通過對8種磺胺類藥物進(jìn)行測試發(fā)現(xiàn)，前五種的檢測靈敏度較高，所以本次研究過程中選擇使用磺胺異噁唑、磺胺噻唑、磺胺對甲氧嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺氯噠嗪作為研究藥物。詳細(xì)情況見表1所示。

2.2 豬肉、雞肉和魚肉樣品檢測結(jié)果分析

將上述五種磺胺類藥物分別添加到上述豬肉、雞肉和魚肉樣品中，最終濃度為0、0.01、0.05、0.1 mg/kg[6]，并按照上述測試方法對樣品濾液進(jìn)行處理，得到了如圖1所示。通過對圖1進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，磺胺異噁唑、磺胺噻唑、磺胺對甲氧嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺氯噠嗪五種磺胺類藥物在豬肉、雞肉和魚肉中視覺檢測標(biāo)準(zhǔn)為0.01 mg/kg。同時對氯霉素、萊克多巴胺、鹽酸克倫特羅、恩諾沙星的檢測結(jié)果顯示，上述物質(zhì)濃度在1000 mg/mL時不存在交叉反應(yīng)，本次試驗(yàn)制備的試紙條對磺胺類藥物有較強(qiáng)的特異性。

3 討論

膠體金層析法在應(yīng)用過程中，膠體金的制備十分關(guān)鍵，膠金粒的大小是否均勻一致是判斷膠體金穩(wěn)定性的主要指標(biāo)，如果膠體金顆粒直徑變異范圍過大，就會顯著影響到試驗(yàn)的穩(wěn)定性和重復(fù)性，如果顆粒形狀不規(guī)則，蛋白固定不緊固，會嚴(yán)重影響到檢測結(jié)果[7]。

本次研究過程，在某農(nóng)貿(mào)市場和超級市場中隨機(jī)采集雞肉樣品250份，用膠體金層析法進(jìn)行檢測，檢測出11份雞肉中含有磺胺類藥物，其中8份雞肉中磺胺類藥物的濃度高達(dá)10-100 mg/g，有3份雞肉磺胺類藥物的濃度高達(dá)100 mg/g以上，效果比較顯著。

本次試驗(yàn)過程中建立的膠體金層析法對五種磺胺類藥物的殘留進(jìn)行了檢測，并且磺胺異噁唑、磺胺噻唑、磺胺對甲氧嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺氯噠嗪五種磺胺類藥物殘留檢測和氯霉素、萊克多巴胺、鹽酸克倫特羅、恩諾沙星之間不存在交叉反應(yīng)。在進(jìn)行雞肉、豬肉和魚肉等制品藥物殘留檢測過程中，方便快捷，視覺檢測標(biāo)準(zhǔn)為為0.01 mg/kg，并且制備的試紙保存時間較久，操作容易，直接通過目測診斷，相信在今后的獸藥殘留檢測會有更好的應(yīng)用。

參考文獻(xiàn)

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