曲　波（吉林工程職業(yè)學(xué)院，吉林四平136001）

產(chǎn)酸性蛋白酶菌株的誘變育種研究

曲波
（吉林工程職業(yè)學(xué)院，吉林四平136001）

摘要：從玉米浸泡液中篩選產(chǎn)酸性蛋白酶的菌株，命名Y-5.0，通過(guò)對(duì)選育獲得的Y-5.0進(jìn)行紫外-亞硝基胍交替誘變研究發(fā)現(xiàn)：紫外誘變最佳菌體稀釋度為10-5、最佳照射時(shí)間為20 s；NTG誘變最佳濃度為500 μg/mL、最佳誘變稀釋度為10-4、最佳誘變作用時(shí)間為50 min。通過(guò)三輪紫外和亞硝基胍（NTG）交替誘變篩選獲得高產(chǎn)蛋白酶的菌株N3-15，其產(chǎn)蛋白酶的活力最高為12 152 nKat/mL，其大大高于原始菌株Y-5.0的酶活，而且該菌株N3-15傳代5次產(chǎn)量穩(wěn)定。

關(guān)鍵詞：蛋白酶；菌株；誘變

從自然界經(jīng)稀釋涂布分離得到的菌種，由于其生產(chǎn)能力較低，一般不能滿足工業(yè)化大規(guī)模的生產(chǎn)。因此，采用物理或化學(xué)誘變方法選育高產(chǎn)的誘變菌株，彌補(bǔ)生產(chǎn)能力低的不足，這已成為一種常規(guī)的選育菌種技術(shù)[1]。其中紫外線是最常用的一種物理誘變方法，它直接作用于DNA，使其相鄰的胸腺嘧啶轉(zhuǎn)變成二聚體，其優(yōu)點(diǎn)是危險(xiǎn)性小、誘變效果較好。常用的化學(xué)誘變劑主要采用烷化劑中的亞硝基化合物，它的主要作用是引起DNA鏈中GC和AT的轉(zhuǎn)換，享有超誘變劑之稱[2]。

本試驗(yàn)以玉米浸泡液中篩選獲得一株產(chǎn)蛋白酶的菌株Y-5.0為出發(fā)菌株，經(jīng)過(guò)紫外-化學(xué)三輪交替誘變處理，篩選出一株高產(chǎn)蛋白酶的突變株，為進(jìn)一步提高蛋白酶的活力奠定良好基礎(chǔ)[3]。

1　材料、儀器及設(shè)備

1.1菌種

Y-5.0：中糧生化能源有限公司（公主嶺市）生產(chǎn)車間的玉米浸泡液中篩選獲得。

1.2試劑

亞硝基胍（NTG）、酵母膏、瓊脂、葡萄糖、酪蛋白、蛋白胨、（NH4）2SO4、CaCl2、FeSO4·7H2O、KH2PO4、MgSO4· 7H2O、NaCI、磷酸緩沖溶液[4]。

1.3培養(yǎng)基

YEPD培養(yǎng)基：葡萄糖2 g，酵母膏1 g，蛋白胨2 g，瓊脂1.5 g～2.0 g，pH 6.5。

分離培養(yǎng)基：葡萄糖2 g，酵母膏1 g，1%酪蛋白，蛋白胨2 g，瓊脂1.5 g～2.0 g，pH 6.5。

淀粉培養(yǎng)基：蛋白胨1 g，牛肉膏0.5 g，可溶性淀粉0.2 g，NaCl 0.5 g，瓊脂1.5 g～2.0 g，pH 6.5。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖2 g，酵母膏1 g，蛋白胨2 g，pH 6.5。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖2 g，酵母膏1 g，（NH4）2SO40.2 g，CaCI20.02 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，KH2PO40.2 g，MgSO4·7H2O 0.05 g，pH 6.5，接種量5%[5]。

1.4儀器與設(shè)備

本試驗(yàn)所用到的儀器與設(shè)備詳見(jiàn)表1。

表1　儀器設(shè)備Table 1　Instruments and equipments

2　方法

2.1紫外誘變最佳濃度梯度的確定

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌體制成菌懸液，吸取1 mL用無(wú)菌生理鹽水依次梯度稀釋至10-6濃度，分別吸取各稀釋度的菌懸液100 μL均勻涂布于YEPD培養(yǎng)基凝固平板中[6]。將涂布平板與紫外燈下照射20 s，避光保存在30℃培養(yǎng)箱中48 h，查數(shù)誘變后的菌落個(gè)數(shù)，確定最佳稀釋梯度[7]。

試驗(yàn)均以未經(jīng)過(guò)紫外線照射的YEPD培養(yǎng)基平板為對(duì)照。

2.2紫外誘變最佳照射時(shí)間的確定

取100 μL稀釋度為10-5的菌懸液均勻地涂布到Y(jié)EPD固體培養(yǎng)基平板中，分別在紫外線燈下照射10、20、30 s。避光保存在30℃培養(yǎng)箱中48 h，查數(shù)誘變后的菌落個(gè)數(shù)，確定最佳紫外照射時(shí)間[8]。

試驗(yàn)均以未經(jīng)過(guò)紫外線照射培養(yǎng)的YEPD培養(yǎng)基平板為對(duì)照。

2.3NTG最佳濃度的確定

分別配制濃度為100、300、500μg/mL和700μg/mL 的NTG溶液。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌懸液離心-磷酸緩沖液洗滌-NTG誘變40 min-離心-磷酸緩沖液洗滌-取各稀釋濃度的菌懸液100 μL均勻涂布于YEPD固體培養(yǎng)基平板中，30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，查數(shù)誘變后的菌落個(gè)數(shù)，確定最佳NTG濃度[9]。

2.4NTG誘變最佳作用時(shí)間的確定

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌株制成菌懸液離心-磷酸緩沖液洗滌-NTG作用不同時(shí)間（20、30、40、50、60、70 min）-離心-磷酸緩沖液洗滌-取各稀釋濃度的菌懸液100 μL均勻涂布于YEPD固體培養(yǎng)基平板中，30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，查數(shù)誘變后的菌落個(gè)數(shù)，確定最佳NTG誘變時(shí)間[10]。

2.5NTG誘變最佳稀釋梯度的確定

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌懸液-離心-磷酸緩沖液洗滌-NTG誘變40 min-離心-磷酸緩沖液洗滌-依次稀釋梯度至10-5，分別取不同稀釋度菌懸液100 μL涂布于YEPD固體培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，查數(shù)誘變后的菌落個(gè)數(shù)，確定最佳NTG菌體濃度[11]。

2.6紫外和亞硝基胍（NTG）交替誘變育種

取100 μL稀釋度為10-4的對(duì)數(shù)期菌懸液均勻涂布于YEPD固體培養(yǎng)基平板中，在紫外線燈下照射20s，避光保存在30℃培養(yǎng)箱中48 h。挑選誘變后長(zhǎng)勢(shì)良好的菌株反復(fù)篩選發(fā)酵，測(cè)定發(fā)酵液的蛋白酶活力[12]。將蛋白酶活力高的菌株傳代4次并發(fā)酵測(cè)蛋白酶活力。

將紫外誘變后產(chǎn)量穩(wěn)定的的高產(chǎn)菌株經(jīng)NTG誘變40 min，均勻涂布于YEPD培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，挑選誘變后長(zhǎng)勢(shì)良好的菌株反復(fù)篩選發(fā)酵，測(cè)定發(fā)酵液的蛋白酶活力。將蛋白酶活力高的菌株傳代5次并發(fā)酵測(cè)蛋白酶活力。

挑取上述誘變后蛋白酶活力含量較高的高產(chǎn)菌株進(jìn)行紫外誘變，篩選誘變后的高產(chǎn)菌株發(fā)酵測(cè)其蛋白酶活力。反復(fù)如上，經(jīng)過(guò)三輪紫外和亞硝基胍（NTG）交替誘變，選育高產(chǎn)酸性蛋白酶菌株[13]。挑選誘變后長(zhǎng)勢(shì)良好的菌株反復(fù)篩選發(fā)酵，測(cè)定發(fā)酵液的蛋白酶活力。將蛋白酶活力高的菌株傳代5次并發(fā)酵測(cè)蛋白酶活力。

試驗(yàn)均做3個(gè)平行樣。

3　結(jié)果與分析

3.1紫外誘變最佳濃度梯度的選擇

紫外誘變最佳濃度梯度的選擇試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2　紫外誘變最佳濃度的選擇Table 2　The choice of the best concentration of UV mutagenesis

由于菌體的致死率在70%～80%之間，菌體發(fā)生正突變的機(jī)率較大。從表2中可看出，當(dāng)稀釋度為10-4時(shí)，菌株的致死率為75.5%，隨著稀釋梯度的減小，菌株的致死率在不斷地增大；因?yàn)楣ぷ髁康脑蜻x擇稀釋度10-5，故在以后的試驗(yàn)中采用10-5為最佳稀釋度。

3.2紫外誘變最佳時(shí)間的確定

紫外誘變最佳時(shí)間的確定試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3　紫外誘變最佳時(shí)間的確定Table 3　UV mutagenesis to determine the best time

由表3紫外誘變的最佳時(shí)間結(jié)果顯示：隨著紫外照射時(shí)間的延長(zhǎng)，菌株的致死率在不斷地增大。當(dāng)紫外照射的誘變時(shí)間為20 s時(shí)，誘變菌株的致死率在78.18%，因此確定最佳誘變時(shí)間為20 s。

3.3NTG最佳濃度的確定

NTG最佳濃度的確定試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。

表4　NTG最佳濃度的確定Table 4　Determine the optimal concentration of NTG

由表4可以看出最佳NTG濃度為500 μg/mL。表4顯示隨著NTG濃度的不斷增大加，菌株的致死率也在不斷地增加，其在500 μg/mL時(shí)滿足致死率在70%～80%的范圍，其向正突變的幾率較大。

3.4NTG最佳作用時(shí)間的確定

NTG最佳作用時(shí)間的確定試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5。

表5　NTG最佳作用時(shí)間的確定Table 5　Best time to determine the role of NTG

從表5可以看出NTG最佳作用時(shí)間為50 min。表5顯示隨著NTG作用時(shí)間的延長(zhǎng)，致死率在不斷地增大，其在50 min時(shí)滿足致死率在70%～80%的范圍，其向正突變的幾率較大，故確定今后試驗(yàn)NTG誘變時(shí)間為50 min。

3.5NTG最佳稀釋度的確定

NTG最佳稀釋度的確定試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表6。

表6　NTG最佳稀釋度的確定Table 6　Determination of the optimal dilution of NTG

從表6可以看出，從稀釋度10-3遞增至10-6，致死率在不斷地減少；當(dāng)稀釋度為10-4時(shí)滿足最佳致死率范圍，致死率為70.32%，因此選擇10-4時(shí)為最佳NTG稀釋度。

3.6三輪紫外-化學(xué)復(fù)合誘變

采用Folin-酚法測(cè)定光密度OD680nm值，計(jì)算蛋白酶酶活力。

表7為第一輪紫外誘變后菌株發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶的酶活力。

表7　第一輪紫外誘變后菌株發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶的活力Table 7　After the first round of UV mutagenesis producing protease fermentation

從表7可以看出，突變株UV1-8產(chǎn)蛋白酶的活力最高，達(dá)到2 476 nKat/mL。以突變株UV1-8為出發(fā)菌株進(jìn)行以下試驗(yàn)的NTG誘變。表8為第一輪NTG誘變后菌株發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶的酶活力。

表8　第一輪NTG誘變后菌株發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶的活力Table 8　NTG mutant strain after the first round of protease fermentation

從表8可以看出，蛋白酶活力最高的菌株為N1-Ⅴ突變株，蛋白酶活力達(dá)到5 226 nKat/mL。

表9為第二輪紫外誘變后篩選出產(chǎn)蛋白酶活力較高的菌株。

表9　第二輪紫外誘變后菌株發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶的活力Table 9　After the second round of UV mutagenesis producing protease

從表9可以看出，突變株UV2-18的蛋白酶活力最高為7 827 nKat/mL。表10為第二輪NTG誘變后菌株發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶菌株。

表1　0 第二輪NTG誘變后菌株發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶的活力Table 10　NTG mutant strain after the second round of protease fermentation

從表10可以看出，突變株N2-Ⅲ蛋白酶活力最高為9 144 nKat/mL。

表11為第三輪紫外誘變后篩選獲得的產(chǎn)蛋白酶活力較高的菌株。

表1　1　第三輪紫外誘變后菌株發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶活力Table 11　After the third round of UV mutagenesis protease fermentation products

從表11可以看出，UV3-34突變株蛋白酶活力為10 569 nKat/mL。表12為第三輪NTG誘變后篩選獲得的產(chǎn)蛋白酶活力較高的菌株。

表1　2 第三輪NTG誘變后菌株發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶活力Table 12　NTG mutant strain after the third round of protease fermentation products

從表12可以看出，其中N3-15突變株的蛋白酶活力最高，其蛋白酶活力為12 152 nKat/mL。

將紫外-NTG交替誘變后產(chǎn)蛋白酶活力最高的N3-15突變株連續(xù)傳代5次，發(fā)酵測(cè)定其蛋白酶活力如表13所示。

表1　3第三輪NTG誘變后N3-15菌株5次傳代發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶活力Table 13　The third round of NTG mutagenesis N3-15 strain of 5 passages fermentation of protease activity

從表13可以看出該突變株產(chǎn)蛋白酶活力穩(wěn)定，其蛋白酶酶活力為12 152 nKat/mL。

4　結(jié)論

通過(guò)對(duì)選育獲得的Y-5.0進(jìn)行紫外-亞硝基胍交替誘變研究發(fā)現(xiàn)：紫外誘變最佳菌體稀釋度為10-5、最佳照射時(shí)間為20 s；NTG誘變最佳濃度為500 μg/mL、最佳誘變稀釋度為10-4、最佳誘變作用時(shí)間為50 min。通過(guò)三輪紫外和亞硝基胍（NTG）交替誘變篩選獲得高產(chǎn)蛋白酶的菌株N3-15，其產(chǎn)蛋白酶的活力最高為12 152 nKat/mL，其大大高于原始菌株Y-5.0的酶活，而且該菌株N3-15傳代5次產(chǎn)量穩(wěn)定。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.20.045

收稿日期：2015-03-24

作者簡(jiǎn)介：曲波（1982—），男（漢），講師，研究生，研究方向：食品發(fā)酵，食品營(yíng)養(yǎng)。

Research on the Mutation Breeding of Acid Protease-producing Strains

QU Bo
（Jilin Engineering Vocational College，Siping 136001，Jilin，China）

Abstract：Screening the high-yield strains of acid protease from the corn immersion.The high-yield strains of acid protease was named Y-5.0.Mutagenesis studies of Y-5.0 showed that the best conditions of UV mutagenesis：the dilution of bacteria was 10-5，the best exposure time of UV mutagenesis was 20 s，NTG mutagenesis best conditions：NTG concentration was 500 ug/mL，NTG mutagenesis dilution was 10-4，the best action time of NTG mutagenesis was 50 min.By three times of UV and nitrosoguanidine（NTG）mutation alternately breeding screening，we obtained the highest protease activity mutant named N3-15，the activity of Its producing protease reached 12 152 nKat/mL，far exceeding the activity of the original strain Y-5.0.This strain passed five times and performed a good genetic stability.

Key words：protease；strain；mutagenesis