蘇榮欣 ，李 偉，齊 崴 ，何志敏

(1. 天津大學(xué)化工學(xué)院化學(xué)工程聯(lián)合國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300072；2. 天津化學(xué)化工協(xié)同創(chuàng)新中心，天津 300072)

蛋白酶是目前商業(yè)化程度最高、應(yīng)用最廣的一類酶[1]．堿性蛋白酶作為蛋白酶的一種，已被證明在洗滌添加劑[2]、食品、服裝、醫(yī)藥以及檢測(cè)試劑等行業(yè)具有很大的應(yīng)用前景[3]．目前，對(duì)堿性蛋白酶的研究多集中在從不同的動(dòng)物組織、植物組織和菌種中提取并純化堿性蛋白酶[4-11]．而對(duì)酶活的檢測(cè)一直使用傳統(tǒng)的比色方法[12-13]，檢測(cè)過程較為繁瑣，檢測(cè)靈敏度較低．有關(guān)檢測(cè)方法的研究極少報(bào)道．由于堿性蛋白酶的酶活一般較弱，開發(fā)一種可快速、準(zhǔn)確且靈敏檢測(cè)堿性蛋白酶的方法極具現(xiàn)實(shí)意義．

金納米顆粒具有超小尺寸、良好生物相容性和較低的生物毒性，從而吸引了大量研究者的興趣．而熒光金納米簇不僅具有金納米顆粒的優(yōu)點(diǎn)，更具有良好的熒光性質(zhì)，因此被大量應(yīng)用到熒光標(biāo)記、生物檢測(cè)以及小分子檢測(cè)中[14-16]．近年來，蛋白合成金納米簇方法得以建立[17-19]，使得熒光金納米簇的應(yīng)用范圍獲得進(jìn)一步擴(kuò)展[20]．

筆者利用以溶菌酶為模板合成的金納米簇，建立堿性蛋白酶濃度的定量檢測(cè)方法，考察金納米簇與堿性蛋白酶溶液體積比、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間對(duì)檢測(cè)靈敏度的影響規(guī)律，進(jìn)一步確定該方法的檢測(cè)范圍和檢測(cè)限．

1 堿性蛋白酶檢測(cè)原理

本檢測(cè)方法的檢測(cè)原理如圖 1所示．在 pH為13的條件下，溶菌酶作為模板劑和還原劑合成由 25個(gè)金原子組成的金納米簇．在溶菌酶的保護(hù)下，金納米簇可以穩(wěn)定存在，并且保持熒光性能．保持 pH為13的條件下，加入堿性蛋白酶，堿性蛋白酶將包覆金納米簇上的溶菌酶水解，使金納米簇失去保護(hù)，從而使環(huán)境中的氧氣猝滅金納米簇的熒光[21]．本檢測(cè)方法就是利用堿性蛋白酶水解溶菌酶導(dǎo)致熒光猝滅，并根據(jù)熒光猝滅的程度對(duì)體系中堿性蛋白酶的含量進(jìn)行準(zhǔn)確、靈敏地檢測(cè)．由于在堿性條件下，其他蛋白酶的活性很低，因此本方法對(duì)堿性蛋白酶檢測(cè)具有較好的選擇性．

圖1 利用蛋白酶剪切作用檢測(cè)堿性蛋白酶的原理Fig.1 Schematic illustration of the detection of alkaline protease based on their scissor

2 實(shí) 驗(yàn)

2.1 儀器與藥品

儀器：熒光光譜儀(安捷倫科技有限公司)；JEM-2100F透射電子顯微鏡(日本 JEOL公司)；恒溫水浴搖床(優(yōu)萊博技術(shù)有限公司)；SevenGo? pH-SG2型pH計(jì)(梅特勒-托利多公司)；TU-1810型紫外分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限公司)．

藥品溶菌酶(梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司)；氯金酸(HAuCl4·4H2O，阿拉丁公司，上海)；實(shí)驗(yàn)所用堿性蛋白酶(200,unit/g)；胃蛋白酶、胰蛋白酶、葡萄糖氧化酶和過氧化氫酶均來自北京普博欣生物科技有限責(zé)任公司；配置緩沖液所用的氯化鉀和氫氧化鈉來自阿拉丁公司，均為分析純．

2.2 溶菌酶穩(wěn)定的金納米簇的制備

合成金納米簇所需玻璃容器均經(jīng)徹底清洗，并用王水(HNO3和 HCl體積比為 1∶3)浸泡，用雙蒸水充分沖洗并烘干后使用．以溶菌酶為模板合成金納米簇的方法參見文獻(xiàn)[17，22-23]．本實(shí)驗(yàn)合成金納米簇的方法為：將 125,mg溶菌酶在快速攪拌的條件下溶解到 5,mL雙蒸水中，待充分溶解之后加入 5,mL 10,mmol/L的氯金酸溶液，室溫下充分混合 1～2,min，此時(shí)混合溶液變?yōu)樽厣褂?1,mol/L的氫氧化鈉溶液將混合溶液的pH調(diào)節(jié)到13，由于超過了溶菌酶的等電點(diǎn)，此時(shí)出現(xiàn)白色沉淀．在室溫下攪拌1～2,min后，將反應(yīng)溶液轉(zhuǎn)入 37,℃恒溫水浴搖床中，200,r/min，反應(yīng) 12,h．反應(yīng)后溶液變?yōu)榧t色，避光冷藏待用．

2.3 檢測(cè)方法條件優(yōu)化

為了在短時(shí)間內(nèi)獲得最好的檢測(cè)效果，本實(shí)驗(yàn)考察了金納米簇的制備時(shí)間、檢測(cè)反應(yīng)溫度、溶菌酶比例及反應(yīng)時(shí)間的影響，進(jìn)而確定反應(yīng)進(jìn)行的條件．后續(xù)的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)按優(yōu)化后的條件進(jìn)行．

2.4 堿性蛋白酶檢測(cè)

堿性蛋白酶檢測(cè)中所用到的緩沖溶液均提前過膜，防止雜質(zhì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響．將 10,mg堿性蛋白酶溶解到1,mL pH為13的氯化鉀-氫氧化鈉緩沖溶液中配制成 5,mg/mL的母液，而后稀釋成不同濃度的酶溶液．選擇 pH為 13的緩沖溶液是為了既保證堿性蛋白酶活性的條件，又不影響金納米簇的熒光性質(zhì)．在7,mL干凈的離心管中，依次加入2.7,mL不同濃度的堿性蛋白酶溶液和 3,mL金納米簇溶液，混勻后放入 40,℃的恒溫水浴搖床中，200,r/min，反應(yīng)3,h．采用熒光光譜儀在激發(fā)光波長(zhǎng)為532,nm的條件下檢測(cè)所得溶液在600～900,nm的發(fā)射光光譜.

3 結(jié)果與討論

3.1 金納米簇的表征

如圖2所示，在該實(shí)驗(yàn)條件下合成的金納米簇粒徑在 3～10,nm 之間，大于藍(lán)光金納米簇粒徑[19]，較為符合文獻(xiàn)[17]所報(bào)道的發(fā)紅光金納米簇的粒徑．

在 350,nm 紫外光照射下，可以看到合成的金納米簇可以發(fā)出紅色熒光．使用熒光光譜儀進(jìn)一步確定金納米簇的激發(fā)和發(fā)射光譜．如圖 3所示，所獲得的金納米簇的激發(fā)波長(zhǎng)為 532,nm，在此激發(fā)波長(zhǎng)下，金納米簇的發(fā)射波長(zhǎng)為 670,nm左右．所有數(shù)據(jù)經(jīng)歸一化處理．

圖2 金納米簇的透射電鏡圖Fig.2 TEM image of Au NCs

圖3 金納米簇的熒光激發(fā)(EX)和發(fā)射(EM)光譜Fig.3 Fluorescence excitation (EX) and emission (EM)spectra of Au NCs

3.2 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

為了獲得最佳的檢測(cè)結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)考察了檢測(cè)體系中金納米簇與酶溶液比例、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間對(duì)檢測(cè)效果的影響．之后的檢測(cè)按照優(yōu)化后的條件進(jìn)行．

3.2.1 反應(yīng)機(jī)理驗(yàn)證

為了驗(yàn)證反應(yīng)機(jī)理，檢測(cè)了金納米簇與堿性蛋白酶反應(yīng)前后粒徑的變化．實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖 4所示，曲線1對(duì)應(yīng)未與堿性蛋白酶反應(yīng)的金納米簇的粒徑分布，曲線 2對(duì)應(yīng) 100,μg/mL堿性蛋白酶 2,700,μL，在 40,℃條件下與 300,μL金納米簇溶液反應(yīng) 2,h后的粒徑分布．可以看到金納米簇粒徑在反應(yīng)前后從 8,nm左右下降到 4,nm 左右，這證明了堿性蛋白酶與金納米簇表面包覆的溶菌酶相互作用，將溶菌酶水解，從而驗(yàn)證了之前所設(shè)計(jì)的反應(yīng)機(jī)理．

3.2.2 金納米簇與酶溶液比例的確定

由于堿性蛋白酶的酶活較弱，為了在短時(shí)間內(nèi)達(dá)到對(duì)堿性蛋白酶的有效檢測(cè)，檢測(cè)體系中酶溶液應(yīng)占較大比例．這里考察了金納米簇溶液與 100,μg/mL堿性蛋白酶溶液體積比分別為 4∶6、2∶8、1∶9和5∶95條件下，在40,℃下反應(yīng)2,h后熒光強(qiáng)度相對(duì)降低值(即熒光信號(hào))(I0－I)/I0．結(jié)果如圖 5所示，熒光信號(hào)隨著堿性蛋白酶溶液比例的增高而增高．雖然體積比為5∶95時(shí)信號(hào)最強(qiáng)，但由于在該比例下熒光強(qiáng)度較弱，當(dāng)酶濃度較低時(shí)，檢測(cè)信號(hào)波動(dòng)較大．因此1∶9被選為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)比例．

圖5 不同金納米簇與堿性蛋白酶溶液體積比的熒光信號(hào)Fig.5 Fluorescence signals made by different volume ratios of Au NCs to alkaline protease solution

3.2.3 反應(yīng)溫度的確定

由于堿性蛋白酶的最適溫度在 40～55,℃之間，本實(shí)驗(yàn)分別檢驗(yàn)了 37,℃、40,℃、45,℃、50,℃和 55,℃條件下，2.7,mL 100,μg/mL的堿性蛋白酶溶液與300,μL金納米簇溶液混合后熒光相對(duì)下降值(即熒光信號(hào))(I0－I)/I0隨時(shí)間的變化．結(jié)果如圖 6所示，37,℃條件下，基本無熒光信號(hào)；40,℃、45,℃、50,℃和55,℃條件下，熒光信號(hào)均隨時(shí)間增加逐漸增強(qiáng)．雖然熒光信號(hào)的程度隨溫度升高而增強(qiáng)，但為了避免由于高溫對(duì)金納米簇?zé)晒鈴?qiáng)度的影響，本實(shí)驗(yàn)選取較溫和的條件，即40,℃，為反應(yīng)溫度．

3.2.4 反應(yīng)時(shí)間的確定

為了使本檢測(cè)方法可以在較短時(shí)間內(nèi)達(dá)到對(duì)堿性蛋白酶的靈敏檢測(cè)，考察了 0,μg/mL和 500,μg/mL堿性蛋白酶溶液可獲得的熒光信號(hào)隨時(shí)間的變化，以便選擇合適的反應(yīng)時(shí)間．如圖 7所示，反應(yīng) 60,min后，500,μg/mL和 0,μg/mL堿性蛋白酶所產(chǎn)生的熒光信號(hào)差別隨反應(yīng)的進(jìn)行逐漸增大．由于本方法將檢測(cè)較寬濃度范圍的堿性蛋白酶，故選擇反應(yīng)時(shí)間為180 min．

圖6 不同反應(yīng)溫度下熒光信號(hào)隨時(shí)間的變化Fig.6 Change of fluorescence signal with reaction time at different temperatures

圖7 堿性蛋白酶質(zhì)量濃度為 0,μg/mL 和 500,μg/mL 時(shí)熒光信號(hào)隨反應(yīng)時(shí)間的變化Fig.7 Change of fluorescence signal with reaction time in 0 μg/mL and 500 μg/mL alkaline protease solution

3.3 堿性蛋白酶檢測(cè)曲線的建立

依照第2.2節(jié)方法進(jìn)行堿性蛋白酶檢測(cè)實(shí)驗(yàn)．實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：當(dāng)反應(yīng)時(shí)間相同時(shí)，隨著酶濃度的增加，熒光強(qiáng)度降低更多．從圖 8可見，堿性蛋白酶質(zhì)量濃度與相應(yīng)的熒光信號(hào)在對(duì)數(shù)坐標(biāo)下呈線性，在 2～2,000,μg/mL 范圍內(nèi)成良好線性(R2＝0.986)，檢測(cè)限為 0.1,μg/mL(S/N＝3)．根據(jù)堿性蛋白酶的酶活值(200,unit/g)，檢測(cè)線性區(qū)間為 4×10-5～0.04,unit/mL，檢測(cè)限為 2×10-6,unit/mL．證明該方法可檢測(cè)的堿性蛋白酶含量線性范圍較大．

3.4 方法選擇性考察

為了考察本檢測(cè)方法對(duì)堿性蛋白酶檢測(cè)是否具有專一性，本實(shí)驗(yàn)引入胃蛋白酶和胰蛋白酶作為蛋白酶類干擾物，引入葡萄糖氧化酶和過氧化氫酶作為其他酶類干擾物．實(shí)驗(yàn)中用到的所有酶的質(zhì)量濃度均為 500,μg/mL．干擾酶檢測(cè)實(shí)驗(yàn)條件與堿性蛋白酶檢測(cè)相同．如圖 9所示，堿性蛋白酶所產(chǎn)生的信號(hào)明顯大于其他蛋白酶或其他種類酶，證明該檢測(cè)方法具有實(shí)際應(yīng)用的可能．值得注意的是，胃蛋白酶的檢測(cè)信號(hào)為負(fù)值，說明加入胃蛋白酶后，金納米簇的熒光強(qiáng)度不降反增．這是因?yàn)槲傅鞍酌冈趬A性條件下沒有剪切蛋白的活性，由于它本身也是一種蛋白，同樣可作為合成金納米簇的還原劑和穩(wěn)定劑．因此，在反應(yīng)過程中，那些未被溶菌酶吸附還原的 A uCl4-有可能會(huì)被胃蛋白酶還原為熒光金納米簇，使熒光強(qiáng)度升高.

圖9 金納米簇對(duì)堿性蛋白酶和其他干擾物的熒光響應(yīng)Fig.9 Fluorescence responses of Au NCs to alkaline protease and other interfering substances

4 結(jié) 語

本文利用堿性蛋白酶與金納米簇表面包覆的溶菌酶的相互作用，建立了一種堿性蛋白酶靈敏、高效的熒光檢測(cè)技術(shù)，研究了金納米簇與堿性蛋白酶溶液體積比、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間對(duì)檢測(cè)靈敏性的影響，發(fā)現(xiàn)當(dāng)金納米簇與堿性蛋白酶溶液體積比為 1∶9、反應(yīng)溫度為40,℃、反應(yīng)時(shí)間為3,h的條件下，檢測(cè)效果最好．該方法檢測(cè)線性區(qū)間為4×10-5～0.04 unit/mL，檢測(cè)限為 2×10-6,unit/mL，同時(shí)為蛋白穩(wěn)定的熒光金屬納米簇拓展了一種新的生物檢測(cè)應(yīng)用．

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