陳燕 曹秉振 劉磊 克丙申 蘇凈 房淑欣

MELAS綜合征的臨床及基因診斷研究

陳燕 曹秉振 劉磊 克丙申 蘇凈 房淑欣

MELAS綜合征；線粒體DNA；聚合酶鏈反應

線粒體腦肌病伴高乳酸血癥及卒中樣發(fā)作(MELAS)是由線粒體結構或功能缺陷導致的以神經(jīng)肌肉系統(tǒng)病變?yōu)橹鞯亩嘞到y(tǒng)疾病，是一種母系遺傳病[1]。1984年Pavlakis等[2]報道了首例MELAS綜合征患者，該患者以腦卒中樣發(fā)作和高乳酸血癥為主要特點。研究發(fā)現(xiàn)其熱點突變?yōu)閙tDNAA3243G突變[3]。本研究報道5例MELAS患者的臨床特點及基因檢測結果。

1 對象和方法

1.1 對象 收集 2008-2011年就診濟南軍區(qū)總醫(yī)院臨床確診或疑診的MELAS綜合征患者5例。診斷標準：(1)臨床至少有1次卒中樣發(fā)作；(2)急性期在CT或MRI上可見與臨床表現(xiàn)相關的責任病灶；(3)腦脊液和(或)運動前后血乳酸升高；(4)肌肉活檢MGT染色可見破碎紅纖維(RRF)。

1.2 方法 總結分析5例患者的臨床表現(xiàn)、實驗室檢驗、電生理檢查、影像學檢查及基因突變檢測資料。

1.2.1 肌肉或腦組織活檢檢查：患者例1、2行肌肉活檢檢查，例2行電子顯微鏡檢查；例3、5行腦組織活檢檢查；例4在外醫(yī)院行肌肉活檢檢查。

1.2.2 基因學檢查：使用TaKaRa 血液DNA提取試劑盒(大連寶生物工程有限公司提供)提取患者靜脈血DNA，或使用TaKaRa 肌肉組織DNA提取試劑盒(大連寶生物工程有限公司提供)提取患者肌肉組織DNA。上游引物：P1：5′-CCTCCCTGTACGAAAGGACA-3′；下游引物: P2：5′-GCCTAGGTTGAGGTTGACCA-3′，P3：5′-CCGATCAGGG-CGTAGTTTGA-3′。行PCR擴增，各反應體系均為50 μL，具體方法如下：PCR反應參數(shù)設定：94℃預變性4 min，94℃變性30 s，退火溫度56℃ 30 s，72℃延伸1 min，35個循環(huán)，4℃保存。測DNA序列。

2 結果

2.1 臨床特點 5例患者均為男性，發(fā)病年齡為13～39歲，5例患者首發(fā)癥狀分別為精神癥狀伴左側肢體無力、視物不清伴四肢抽搐、頭痛伴視物模糊、頭痛伴左側肢體無力及視物不清，其中3例患者有卒中樣發(fā)作史，4例患者有肢體抽搐病史，4例表現(xiàn)為偏頭痛伴視力下降，2例患者有聽力損傷。

2.2 實驗室檢查結果 血乳酸增高4例，肌電圖檢查結果提示肌源性損害4例，5例患者腦電圖檢查均提示重度異常腦電圖表現(xiàn)，頭顱MRI檢查主要為顳、枕、頂葉的不對稱病灶(圖1)，3例患者肌肉組織有破碎紅纖維(圖2)，1例行肌肉電鏡檢查發(fā)現(xiàn)異常線粒體(圖3)，2例患者腦組織活檢可見皮層組織呈分層樣改變。

2.3 基因檢測結果 3例患者存在A3243G突變(圖4)，1例未發(fā)現(xiàn)3243位點的突變，但發(fā)現(xiàn)了A3136G及T3336C位點的突變，1例出現(xiàn)線粒體基因3314-3589之間276 bp的堿基缺失。

圖1 患者3第1次發(fā)作時腦MRI T2WI檢查示右側枕葉異常信號

圖2 患者1 肌肉組織可見典型破碎紅纖維(箭頭所示,MGT染色,×400)

圖3 患者2肌肉組織電鏡檢查發(fā)現(xiàn)異常線粒體，線粒體體積大小不一，出現(xiàn)巨線粒體(箭頭所示)，線粒體基質(zhì)電子密度不一，嵴的方向和形態(tài)各異

圖4 患者1肌肉組織基因測序圖譜，箭頭所示即為3243突變位點

3 討論 MELAS綜合征患者一般患病年齡較輕(<45歲)，缺乏常見的卒中危險因素，聽力障礙和偏頭痛、癲癇、精神癥狀多為首發(fā)癥狀，最終出現(xiàn)腦卒中樣發(fā)作，急性卒中以一側或雙側枕葉、顳葉受累最為常見，常出現(xiàn)非MELAS臨床表現(xiàn)，如線粒體心肌病、母系遺傳性糖尿病和/或耳聾以及無癥狀的基因攜帶者等。本研究5例患者發(fā)病年齡較輕，均小于45歲，首發(fā)癥狀分別為精神行為異常、偏頭痛樣發(fā)作、視物不清、肢體抽搐，5例患者中有3例出現(xiàn)卒中樣發(fā)作，4例患者出現(xiàn)偏盲，患者2、4出現(xiàn)聽力下降，患者1、2、4、5最后均有癲癇樣發(fā)作，為強直陣攣樣發(fā)作，此類癲癇樣發(fā)作發(fā)作間期腦電圖正常，常被誤診為癥狀性癲癇。

高乳酸血癥是MELAS綜合征的特征性表現(xiàn)，高乳酸血癥對此病的早期診斷具有重要的臨床價值。5例患者中有4例化驗血乳酸增高。MRI檢查可見顳葉、頂葉、枕葉的廣泛長T1和長T2信號，以皮層下白質(zhì)受累為主。病灶不符合單血管分布，血管檢查無腦動脈粥樣硬化、狹窄的證據(jù)，病灶區(qū)域腦血流不是減少而是增加[4]。且具有病灶的移行性和易復發(fā)性。5例患者均出現(xiàn)枕葉、顳葉或頂葉損害，病灶不對稱。骨骼肌活檢冷凍切片，MGT染色可見有大量異常線粒體聚集的破碎紅纖維，電鏡下可見大量異常線粒體，部分病例可見類結晶樣的包涵體[5]。對此病診斷具有重要的意義。

MELAS綜合征患者的線粒體突變位點中最常見的是A3243G的突變，約占全部突變的80%，其次是T3271C，約占10%[6]。有研究發(fā)現(xiàn)突變通過連續(xù)的世代遺傳，使突變的mtDNA逐漸增加，可出現(xiàn)遺傳早現(xiàn)現(xiàn)象[7]。本研究發(fā)現(xiàn)患者1存在A3243G突變，且突變型明顯大于野生型，患者2、4亦發(fā)現(xiàn)了典型的A3243G突變，均為突變型與野生型混合，且野生型大于突變型?；颊?沒有發(fā)現(xiàn)3243位點的突變，但發(fā)現(xiàn)了T3336C的突變和A3136G的突變，其中3336位點全部為突變型，經(jīng)檢索PubMed此突變?yōu)橥x突變，無臨床意義，未檢測到3136位點的突變與MELAS綜合征有關。該例患者基因測序未檢測到3243位點的突變，其原因可能與其突變水平低，未達到此方法可以檢測到的水平有關，需要用更敏感的試驗方法來進一步檢測；也可能患者無3243位點突變，需要做進一步的研究?；颊?經(jīng)PCR檢測發(fā)現(xiàn)了1條約為200 bp的異常基因條帶，通過多次行PCR并電泳檢測排除偽差后，仍有約為200 bp的異?；驐l帶，經(jīng)測序未發(fā)現(xiàn)3243位點的基因突變，而出現(xiàn)了3314-3589之間276 bp的堿基缺失，考慮mtDNA 3314-3589屬于MTND1基因，該基因的表達產(chǎn)物是還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸脫氫酶(NADH)，后者是構成線粒體呼吸鏈復合體Ⅰ的7個亞基之一。因此推測，mtDNA 3314-3589之間大片段的堿基缺失，可能導致MTND1基因的表達異常，影響NADH的活性，從而影響線粒體ATP的生成減少，最終導致腦組織、肌肉組織等的功能甚至結構異常。

綜上所述，對于出現(xiàn)卒中樣發(fā)作、抽搐、運動不耐受等癥狀，腦MRI多發(fā)性且與血管分布區(qū)不一致性的影像信號的年輕患者時，應高度懷疑本病的可能，并行乳酸丙酮酸運動耐量試驗、肌活檢檢查以明確診斷，可留取患者靜脈血，用PCR產(chǎn)物直接行線粒體基因測序確診，直接測序可避免PCR本身造成的基因突變。但由于MELAS綜合征患者的基因突變位點多，只針對特定位點的測序有一定的局限性。

[1]Wang Z, Xiao J, Xie S, et al. MR evaluation of cerebral oxygen metabolism and blood flow in stroke-like episodes of MELAS[J].J Neurol Sci, 2012,323(1-2):173-177.

[2]Pavlakis SG, Phillips PC, DiMauro S, et al.Mitochondria myopathy, encephalomyopathy,lactic acidosis, and stroke-like episodes:a distinctive clinical syndrome[J].Ann Neurol,1984,16(4):481-488．

[3]Goto Y, Nonaka I, Horai S. A mutation in the tRNA (Leu) (UUR) gene associated with the MELAS subgroup of mitochondrial encephalomyopathies[J]. Nature,1990,348(6302): 651-653．

[4]黃文才，湯群峰，李國雄，等.線粒體腦肌病卒中樣病灶的磁共振診斷及波譜分析[J].實用放射性雜志,2010,26(4)：457.

[5]賈建平,崔麗英,王偉,等. 神經(jīng)病學[M].第6版. 北京:人民衛(wèi)生出版社,2008.378-382.

[6]Choi BO, Hwang JH, Cho EM, et al. Mutational analysis of whole mitochondrial DNA in patients with MELAS and MERRF diseases[J]. EXP Mol Med,2010,42(6):446-455.

[7]DiMauro S, Schon EA. Mitochondrial respiratory chain diseases[J]. N Eng ZJ Med, 2003,348(26):2656-2668.

(本文編輯：鄒晨雙)

10.3969/j.issn.1006-2963.2015.04.021

250031山東省交通醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科(陳燕、劉磊、房淑欣)；250031濟南軍區(qū)總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 (曹秉振、克丙申、蘇凈)

陳燕，Email：law1984 @126.com

R596.1;R742.8+9

D

1006-2963 (2015)04-0379-02

2014-11-21)