張曉燕 常婷 劉沙沙 楊琨 李柱一

Tfh細胞在重癥肌無力患者胸腺中的表達及作用機制

張曉燕 常婷 劉沙沙 楊琨 李柱一

目的 探討Tfh細胞在重癥肌無力(MG)患者胸腺中乙酰膽堿受體抗體(AChR-Ab)產生中的作用及機制。方法 收集28例MG患者、9例無胸腺異常的先天性心臟病患者和9例未合并MG的胸腺增生患者。采用流式細胞術檢測胸腺中濾泡輔助T(Tfh)細胞和B細胞的比例，分別通過RT-PCR和Western-Blotting技術檢測胸腺中Th1、Th2和Tfh細胞特異性轉錄因子T-bet、GATA-3、Bcl-6 mRNA水平和細胞因子干擾素γ(IFN-γ)、白細胞介素4(IL-4)、IL-21表達；采用HE和多標免疫熒光染色觀察胸腺中生發(fā)中心以及Tfh細胞和B細胞之間的組織結構關系；采用放射免疫沉淀技術(RIA)檢測MG患者胸腺和血清中AChR-Ab滴度；免疫磁珠提取胸腺中Tfh細胞和B細胞共培養(yǎng)，檢測培養(yǎng)上清中IL-21和AChR-Ab滴度水平。結果 MG患者胸腺中Tfh細胞和B細胞比例及Tfh細胞相關轉錄因子Bcl-6 mRNA水平和細胞因子IL-21表達均較對照組增高(P<0.01)；MG患者胸腺中抗AChR-Ab滴度較對照組增高(P<0.01)；MG患者胸腺中存在異位生發(fā)中心，且在生發(fā)中心內Tfh細胞和B細胞存在共定位；MG患者胸腺Tfh和B細胞共培養(yǎng)上清中IL-21和AChR-Ab水平較對照組增多(P<0.01)，且AChR-Ab產生可以被IL-21中和抗體阻斷。 結論 Tfh細胞通過在MG患者胸腺中輔助B細胞形成異位生發(fā)中心及促進抗AChR-Ab產生參與MG的發(fā)生和發(fā)展。

T淋巴細胞，輔助誘導；重癥肌無力；胸腺增生；生發(fā)中心；受體，膽堿能；抗體

重癥肌無力(myasthenia gravis，MG)是神經系統(tǒng)自身免疫性疾病，80% 的MG是由乙酰膽堿受體抗體(acetylcholine receptor antibody，AChR-Ab)介導的主要累及神經肌肉接頭突觸后膜上煙堿型乙酰膽堿受體(AChR)的免疫性疾病[1]。MG患者的胸腺在AChR-Ab產生中具有重要作用[2]。80%的MG患者合并胸腺增生或者胸腺瘤；胸腺切除可使MG患者的臨床癥狀得到顯著改善[3]。目前觸發(fā)抗AChR-Ab產生的機制尚不明確。濾泡輔助性T細胞(T follicular helper cells， Tfh)是近期發(fā)現的T輔助細胞(T help，Th)亞群。Tfh細胞定位于生發(fā)中心，在輔助B細胞成熟及抗體產生中發(fā)揮核心作用[4]。近期研究顯示Tfh細胞參與了多種自身免疫性疾病的發(fā)生和發(fā)展[5]。MG患者外周血中Tfh細胞比例增高，且與疾病的嚴重程度呈正相關，表明Tfh細胞參與了MG的病理過程。但目前關于MG患者胸腺中Tfh細胞的表達及其作用機制尚不明確。

1 對象和方法

1.1 觀察對象 收集2012-05-2013-11第四軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院神經內科就診的確診為MG合并胸腺增生患者28例，其中男16例，女12例，發(fā)病年齡1.4～78.6歲，病程0.5～156個月。所有患者進行Ossermann分型，其中Ⅰ型9例，Ⅱ型6例，Ⅲ型6例，Ⅳ型7例。根據MG評分(quantitative MG scoring system, QMGs)對疾病的嚴重程度進行評估[6]。收集無胸腺異常的先天性心臟病患者9例，其中男5例，女4例，年齡0.9～38歲，術中為充分暴露術野而取其胸腺組織；另收集不合并MG的胸腺增生(Non-myasthenia gravis，NMG)患者9例，其中男5例，女4例，年齡21.2～78.1歲。

1.2 主要試劑和儀器 人淋巴細胞分離液購于MP Biomedicals公司；CD4-FITC、CXCR5-APC、ICOS-PE單克隆抗體購于Biolegend公司；反轉錄試劑盒購于Takara公司；抗人白細胞介素-21(IL-21)、β-actin單克隆抗體購于Millipore公司；抗人干擾素γ(IFN-γ)單克隆抗體購于Abcam公司；抗人IL-4單克隆抗體購于Cell Signaling Tech公司；PCR引物由上海生工公司合成。T-bet，上游引物：5′-CTTGGTGTGGACTGAGATTGC-3′，下游引物：5′-ACTGGAAGGATAGGGGGACA-3′；GATA-3，上游引物：5′-AGACCACCACAACCACACTCT-3′，下游引物：5′-GATGCCTTCCTTCTTCATAGTCA-3′；Bcl-6，上游引物：5′-CCAGCAAAGAAGAAGAGAGACC-3′，下游引物：5′-CTGTGGACTAACCAGACCCTTC-3′；GAPDH，上游引物：5′-GACCTGACCTGCCGTCTA-3′，下游引物：5′-AGGAGTGGGTGTCGCTGT-3′；流式細胞儀購于BD公司；熒光定量PCR儀購于Bio-Rad公司；高速低溫離心機購于Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 流式細胞術檢測胸腺單細胞懸液中Tfh細胞比例：采用機械方法分離胸腺中單細胞懸液。取1×105個胸腺細胞加入抗人CD4-FITC、CXCR5-ACP、ICOS-PE、CD3-APC、CD19-PE單克隆抗體避光孵育30 min，洗液、固定后使用流式細胞儀檢測CD4+CXCR5+ICOS+Tfh細胞和CD3-CD19+B細胞比例。

1.3.2 胸腺CD4+T細胞亞群特異性轉錄因子和細胞因子檢測：將胸腺組織勻漿后離心，提取上清液。采用RT-PCR檢測T-bet、GATA-3、Bcl-6 mRNA水平；采用Western-Blot檢測胸腺中IL-21、IL-4、IFN-γ表達水平。

1.3.3 胸腺組織上清中抗AChR-Ab滴度檢測：采用放射免疫沉淀法檢測。取外傷截肢患者的肌肉組織，使用低溫高速離心機離心機提取AChR，加人血清或胸腺組織勻漿上清，再加入125I標記的α-BuTx充分混勻后4 ℃過夜；加入兔抗人γ-球蛋白IgG，混勻后4 ℃靜置2 h，4 ℃離心、洗滌后γ計數儀中計數，抗體滴度以nmol/L表示。

1.3.4 胸腺組織HE和免疫熒光染色：取新鮮胸腺組織，OTC包埋，連續(xù)切片制成10 μm冷凍切片。通過HE染色，光鏡下觀察生發(fā)中心的數量并拍照；將切片用5% (質量濃度)BSA封閉1 h后加入抗人CD4、CD19、CD35、CXCR5單克隆抗體，4 ℃孵育過夜。第2天洗滌后加入熒光標記二抗FITC、PE、Percp-cy5.5，37 ℃避光孵育2 h后洗滌，50%(體積分數)的甘油封片，共聚焦顯微鏡下觀察CD4+CXCR5+、CD19+、CD35+細胞之間的組織結構關系并拍片。

1.3.5 胸腺細胞體外培養(yǎng)：取MG患者胸腺和正常胸腺組織各6例，使用細胞免疫磁珠分離胸腺單細胞懸液中CD4+CXCR5+Tfh細胞和CD19+B細胞共孵育7 d，體系中加入100 ng/mL金黃色葡萄球菌腸毒素B刺激。通過ELISA和放射免疫沉淀檢測上清中IL-21濃度及抗AChR-Ab滴度。

1.4 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，對數據進行正態(tài)性檢驗，不符合正態(tài)分布的計量資料以中位數表示，采用Wilcoxon秩和檢驗。相關性檢驗采用Spearman法分析。以雙側P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組胸腺Tfh細胞比例、相關細胞因子及轉錄因子水平 MG患者胸腺單細胞懸液中Tfh細胞比例、Bcl-6 mRNA、IL-21水平較對照組均顯著升高(均P<0.01)，且Tfh細胞比例和IL-21表達水平均與QMG評分呈正相關(P<0.01)。而Th1和Th2細胞轉錄因子T-bet、GATA-3，細胞因子IL-4和IFN-γ在各組之間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結果見圖1～8。

HC：正常胸腺組，NMG：未合并重癥肌無力的胸腺增生組，MG：重癥肌無力組，圖2～6、圖9～11同

圖1 流式細胞術檢測各組胸腺Tfh細胞比例

圖2 各組胸腺Tfh細胞比例檢測結果分析(*P<0.01)

圖3 各組胸腺T-bet mRNA相對表達水平比較

圖4 各組胸腺GATA-3 mRNA相對表達水平比較

圖5 各組胸腺Bcl-6 mRNA相對表達水平比較(*P<0.01)

IFN-γ：干擾素γ，IL-4：白細胞介素4，圖16同

圖6 Western-Blot檢測各組胸腺組織中IFN-γ、IL-4、IL-21的相對表達水平

圖7 MG患者胸腺Tfh細胞比例和QMG評分的相關性分析

圖8 MG患者胸腺IL-21 mRNA表達相對水平和QMG評分的相關性分析

圖9 流式細胞術檢測各組胸腺中B細胞比例

圖10 各組胸腺中B細胞比例比較(**P<0.01)

AChR-Ab：乙酰膽堿受體抗體，圖12、13、16同

圖11 各實驗組胸腺中抗AChR-Ab滴度比較(**P<0.01)

圖12 MG患者胸腺中Tfh細胞和抗AChR-Ab滴度的相關性分析

圖13 MG患者血清和胸腺中抗AChR-Ab滴度比較(*P<0.05)

2.2 各組胸腺B細胞比例及抗AChR-Ab水平 MG患者胸腺中B細胞比例較對照組顯著增高(P<0.01)，而正常胸腺組和NMG組之間比較無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。MG患者胸腺中抗AChR-Ab滴度較對照組顯著增高(P<0.01)，且較MG患者血清中AChR-Ab滴度增高(P<0.05)；MG患者胸腺中AChR-Ab滴度與胸腺中Tfh細胞比例呈正相關(P<0.01)。結果見圖9～13。

2.3 胸腺生發(fā)中心Tfh和B細胞相互作用 HE和多標免疫熒光染色發(fā)現MG患者增生的胸腺中存在異位生發(fā)中心，而正常人胸腺中無生發(fā)中心結構；MG患者胸腺生發(fā)中心中Tfh細胞與B細胞之間存在共定位(圖14、15)。

2.4 MG患者胸腺細胞體外培養(yǎng)上清液IL-21和抗AChR-Ab水平 MG患者胸腺Tfh細胞和B細胞共培養(yǎng)可產生大量的IL-21和抗AChR-Ab，經IL-21中和抗體阻斷Tfh細胞作用后抗體滴度明顯下降(圖16)。

3 討論

胸腺異常在MG的發(fā)病機制中具有重要作用[7]。多項研究證實MG患者胸腺中具有表達AChR的肌樣細胞，抗原提呈細胞-濾泡樹突狀細 胞，參與自身反應的T、B細胞及T-B細胞相互作用的場所——異位生發(fā)中心，具備了針對AChR異常免疫反應的必須條件，但抗體產生的始動機制尚不明確。

Tfh細胞是近期發(fā)現的Th細胞亞群，主要在輔助B細胞促進病理性自身抗體產生中發(fā)揮重要作用[4]，但迄今為止，Tfh細胞在MG患者胸腺中的表達及作用機制尚不明確。該研究發(fā)現，MG患者增生的胸腺中Tfh細胞比例較健康對照和單純胸腺瘤組增高，且與患者疾病嚴重程度呈正相關。Bcl-6是Tfh細胞特異性的轉錄因子，負責Tfh細胞的分化和增殖，是Tfh細胞區(qū)別于Th1、Th2和Th17細胞的標志物[8]。IL-21是Tfh細胞特異性的細胞因子，在Tfh細胞發(fā)育及胸腺生發(fā)中心B細胞的活化和存活中發(fā)揮重要作用。該研究結果顯示，MG患者胸腺中Bcl-6和IL-21表達水平均較健康對照和單純胸腺瘤組增高，而Th1和Th2細胞的特異性轉錄因子T-bet、GATA-3和細胞因子IFN-γ、IL-4在各組之間比較差異無統(tǒng)計學意義，提示MG患者胸腺中發(fā)揮主要作用的是Tfh細胞而并非Th1和Th2細胞。

B細胞產生抗體需要Th細胞的輔助。既往研究認為Th2細胞通過其分泌的細胞因子IL-4作用于B細胞，輔助B細胞增殖及抗體類別轉換[9]。但IL-4缺陷的小鼠仍然能夠產生T細胞依賴的抗體[10]，因此提示其他Th細胞同樣具有輔助B細胞產生抗體的作用。2008年King等[11]研究證實了Tfh細胞在輔助B細胞產生抗體的過程中發(fā)揮核心作用，但Tfh細胞在MG發(fā)病中的作用和機制尚不明確。該研究通過免疫熒光染色法觀察到在MG患者增生的胸腺中存在異位生發(fā)中心。生理性的生發(fā)中心存在于二級淋巴器官，但在類風濕關節(jié)炎患者的關節(jié)滑膜組織、系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者的脊髓及MG患者的胸腺中均發(fā)現存在異位生發(fā)中心，是自身免疫性疾病的特征性標志[12]。然而MG患者胸腺中異位生發(fā)中心形成的啟動機制尚不明確。本研究發(fā)現MG患者胸腺的異位生發(fā)中心中Tfh細胞和B細胞明顯增多，并存在共定位，提示MG患者胸腺中Tfh細胞和B細胞存在相互作用可能促進異位生發(fā)中心形成。生發(fā)中心是T-B細胞相互作用產生抗體的場所。因此，作者推測在MG患者胸腺中Tfh細胞參與了輔助B細胞產生抗AChR-Ab的過程。為了進一步研究Tfh/B細胞相互作用的效應機制，本研究從MG患者增生的胸腺和健康人胸腺中分別分離出Tfh細胞和B細胞進行共培養(yǎng)，通過對共培養(yǎng)上清的檢測發(fā)現MG患者Tfh細胞可分泌出大量的IL-21，提示Tfh細胞發(fā)揮其效應需要IL-21的參與；MG患者胸腺中B細胞與MG患者或健康人Tfh細胞共培養(yǎng)均可以產生高濃度的抗AChR-Ab，進一步表明Tfh細胞的作用是輔助B細胞產生抗體；通過向培養(yǎng)體系中加入IL-21中和抗體阻斷IL-21的作用后抗AChR-Ab滴度明顯下降。以上結果表明MG患者胸腺中Tfh細胞通過IL-21作用于B細胞誘導自身抗體產生，部分闡明了MG患者胸腺中異常免疫反應的病理機制。

A：MG患者增生的胸腺中胸腺正常組織結構存在，可見胸腺小葉，并有多發(fā)的異位生發(fā)中心；B：MG患者胸腺中異位生發(fā)中心(GC)周圍可見Hassall’s小體；C：健康人胸腺

圖14 胸腺HE染色結果

A：MG患者胸腺中可見由T細胞、B細胞及樹突狀細胞構成的異位生發(fā)中心；B：健康人胸腺；C：MG患者胸腺異位生發(fā)中心存在大量Tfh細胞；D：MG患者胸腺生發(fā)中心存在大量B細胞；E～F：MG患者胸腺生發(fā)中心Tfh細胞和B細胞之間存在共定位(圖F為圖E方框部分的放大圖)

圖15 胸腺免疫熒光染色結果

圖16 MG患者胸腺細胞體外培養(yǎng)上清液IL-21(A)和抗AChR-Ab(B)水平比較

綜上所述，本研究證實了Tfh參與了MG患者的病理過程，且其主要作用是輔助B細胞在MG患者胸腺中形成異位生發(fā)中心，并促進自身抗體產生，提示通過研究Tfh細胞和B細胞之間的相互作用可能為治療MG提供新的作用靶點。

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(本文編輯：時秋寬)

The role of intrathymic Tfh cells in myasthenia gravis

ZHANGXiaoyan,CHANGTing,LIUShasha,YANGKun,LIZhuyi*.

*DepartmentofNeurology,TangduHospital,TheFourthMilitaryMedicalUniversity,Xi’anShaanxi710038,China

Li Zhuyi, Email: lizhuyi@fmmu.edu.cn

Objective To study the role of T follicular helper (Tfh)cells in the pathogenesis of myasthenia gravis(MG).Methods Twenty-eight MG patients were recruited in our study. Non-MG-associated thymic hyperplasia (NMG) and non-thymic abnormal congenital heart disease patients were used as controls. The frequencies of Tfh cells and B cells in thymocytes were detected via flow cytometry. The transcription factor T-bet, GATA-3 and Bcl-6 mRNA expressions in thymocytes were detected with Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction(RT-PCR). Cytokines interferon γ(IFN-γ), interleukin-4(IL-4) and interleukin-21(IL-21) in thymocytes were measured by Western-Blotting. Anti-human acetylcholine receptor (AChR) antibody in the serum or thymic tissue homogenate supernatant was assayed using the radioimmunoprecipitation method(RIA).CD4, CD19, CD35, CXCR5 in the thymus were observed by hematoxylin-eosin(HE) and immunofluorescence staining. CD19+B cells and CD4+CXCR5+T cells were isolated from thymus using immunomagnetic sorting method and were co-cultured. The IL-21 and anti-AChR antibody secretions in co-culture supernatant were detected after 7 days. Results The frequency of Tfh cells and B cells increased significantly in thymocytes of MG patients compared with NMG and HC, and Tfh cells counts positively correlated with disease severity. Tfh cell-associated transcription factors Bcl-6 mRNA and cytokines IL-21 expression were enhanced in the thymocytes of MG patients. Germinal center structure was observed in MG thymus through HE and immunofluorescence staining, which was not observed in the control group. Tfh cells and B cells co-localized in the germinal center of the MG thymus. High level of IL-21 and anti-AChR antibody concentrations were detected in the co-culture of patients Tfh and B cells but the autoantibody titers decreased dramatically by the presence of anti-IL-21 antibodies. Conclusions The enhanced frequency of Tfh cell was involved in the pathological process of MG, and increased its severity probably via accelerated AChR antibody production in thymus.

T-lymphocytes,helper-inducer; myasthenia gravis; thymic hyperlasia; germinal centers; receptors,cholinergic; antibodies

10.3969/j.issn.1006-2963.2015.05.002

國家自然科學基金資助項目(31270952)

730050 蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院神經內科(張曉燕)；710038第四軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院神經內科(常婷、劉沙沙、李柱一)；710032第四軍醫(yī)大學免疫教研室(楊琨)

李柱一，Email: lizhuyi@fmmu.edu.cn

R746.1

A

1006-2963 (2015)05-0309-06

2015-05-04)