陳偉立等

摘 要 試驗(yàn)采用珍珠巖基質(zhì)培養(yǎng)法，研究缺鎂脅迫對(duì)枳砧‘砂糖橘植株的礦質(zhì)養(yǎng)分吸收和抗氧化活性等生理生化過(guò)程的影響。結(jié)果表明：與對(duì)照相比，缺鎂處理90 d導(dǎo)致‘砂糖橘植株葉片葉綠素含量顯著降低；N、P、K、Mg含量降低，但都未達(dá)到顯著水平，其中鎂含量下降幅度最大，為23.0%；另外，缺鎂處理3個(gè)月后發(fā)現(xiàn)N、P和Mg含量都降低，而鉀含量增加了2倍多。缺鎂脅迫引起葉片中過(guò)氧化氫和MDA含量增加，相應(yīng)地導(dǎo)致POD和CAT活性提高，但是SOD活性未受影響，APX活性變化也無(wú)規(guī)律。這些數(shù)據(jù)表明，90 d的缺鎂脅迫能夠引起‘砂糖橘植株葉片中活性氧的累積，POD和CAT可能參與了活性氧的清除。

關(guān)鍵詞 ‘砂糖橘 ；缺鎂 ；礦質(zhì)養(yǎng)分 ；抗氧化酶

分類號(hào) S 666

Influences of Magnesium Deficiency on the Mineral Nutrient Status

and Anti-oxidant Enzymes of‘ShatangjuPlants

CHEN Weili1） XIE Xiaolin1，2） LI Juan3） CHEN Jiezhong1） YAO Qing1）

（1 College of Horticulture， South China Agricultural University，

Guangzhou， Guangdong 510642， China；

2 Guangdong Institute of Microbiology， Guangzhou， Guangdong 510070， China

3 Department of Horticulture， Zhongkai University of Agriculture and Engineering，

Guangzhou， Guangdong 510225， China）

Abstract The influences of magnesium （Mg） deficiency on the physio-biochemical processes of ‘Shatangjuplants on trifoliate orange rootstock， e.g. uptake of mineral nutrients and anti-oxidant enzyme activities， were studied using perlite as substrate. The results showed that compared with the control， the treatment of Mg deficiency for 90 days significantly decreased the chlorophyll contents in the leaves of 'Shatangju' plants. And the contents of N， P， K and Mg declined without significant difference， among which the maximum reduction（23.0%） was found in Mg content. Besides， at the end of the treatment of Mg deficiency， the contents of N， P and Mg decreased， but not K. Mg deficiency induced the increase in the H2O2 and MDA contents， and accordingly increased the POD and CAT activities， however， SOD activity was not affected and the change in APX activity was stable. These data indicate that Mg deficiency for 90 days can induce the accumulation of reactive oxygen species （ROS） in the leaves of ‘Shatangjuplants， and that POD and CAT are possibly involved in scavenging ROS.

Keywords ‘Shatangju； magnesium deficiency ； mineral nutrients ； anti-oxidant enzymes

鎂是植物生長(zhǎng)的必需營(yíng)養(yǎng)元素，是葉綠素分子中的唯一金屬元素，也是許多酶的激活劑[1]。缺鎂現(xiàn)象經(jīng)常出現(xiàn)在紅壤中，主要是由于中國(guó)南部地區(qū)大量雨水、高溫和紅壤的高酸度引起鎂元素淋失造成。而且近年來(lái)，隨著N、P、K化肥用量的增加和有機(jī)肥用量的減少，土壤鎂營(yíng)養(yǎng)逐漸耗竭，植株缺鎂現(xiàn)象在南方各地陸續(xù)出現(xiàn)，并已成為限制當(dāng)?shù)刂参锂a(chǎn)量和品質(zhì)提高的一個(gè)重要因素。

缺鎂脅迫會(huì)使柑橘葉片黃化，壽命變短，葉綠素含量減少，光合作用率下降，根系發(fā)育所需營(yíng)養(yǎng)不足，活性氧產(chǎn)生加劇，出現(xiàn)植株早衰、大小年或不結(jié)果現(xiàn)象[2]。其中，活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）的產(chǎn)生在缺鎂大豆[3]、玉米[4]、桑樹[5]等植物中都有過(guò)報(bào)道。植株本身?yè)碛型晟频目寡趸烙到y(tǒng)，由超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化物酶（POD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、抗壞血酸過(guò)氧化物酶（APX）等抗氧化酶和抗壞血酸等抗氧化物組成，負(fù)責(zé)維持細(xì)胞內(nèi)活性氧的平衡[6]。缺鎂脅迫會(huì)增加水稻葉片中SOD、POD、CAT的活性和丙二醛（MDA）含量，MDA是對(duì)植株有害的過(guò)氧化產(chǎn)物，也是脂過(guò)氧化的常規(guī)指標(biāo)[7]?；钚匝鯐?huì)對(duì)諸如膜脂、蛋白質(zhì)和核酸等生物分子產(chǎn)生氧化傷害，導(dǎo)致細(xì)胞正常代謝的紊亂[8]，從而對(duì)植株產(chǎn)生傷害。

‘砂糖橘（Citrus reticulate Blanco cv. Shatangju）是廣東省最具特色的柑橘品種之一，是許多地方農(nóng)村的主要經(jīng)濟(jì)來(lái)源。對(duì)廣東省‘砂糖橘主產(chǎn)區(qū)的調(diào)查表明，98.1%的果園土壤交換性鎂和84.9%的果園樹體葉片鎂含量處于低量水平[9]。缺鎂導(dǎo)致‘砂糖橘植株葉片黃化，果實(shí)變小，著色變差，可滴定酸、維生素C和還原糖的含量提高，風(fēng)味偏酸[10]。本研究以枳砧‘砂糖橘為試材，探索了缺鎂對(duì)‘砂糖橘植株礦質(zhì)養(yǎng)分吸收和抗氧化酶系統(tǒng)的影響，為‘砂糖橘缺鎂的深入研究及大田指導(dǎo)提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為嫁接于枳[Poncirus trifoliata （L.） Raf.]砧上的兩年生‘砂糖橘（Citrus reticulate Blanco cv. Shatangju）幼苗，盆栽試驗(yàn)于2011年4月至6月在華南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院溫室大棚內(nèi)進(jìn)行[光強(qiáng)為600～850 μmol/（m2·s），相對(duì)濕度為60%-80%，晝夜溫度分別為28±4℃和18±2℃]。將從育苗袋中取出的幼苗根部洗凈后移栽至裝有珍珠巖的塑料盆（9 L）中，每盆種植4株幼苗。

以Hoagland完全營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)5個(gè)月后選擇生長(zhǎng)一致的幼苗作如下2個(gè)處理：正常供鎂的對(duì)照處理（對(duì)照）和缺鎂處理（缺鎂）。對(duì)照處理施用的營(yíng)養(yǎng)液為Hoagland完全營(yíng)養(yǎng)液，其中鎂源為MgSO4·7H2O；缺鎂處理的營(yíng)養(yǎng)液為未添加MgSO4·7H2O的Hoagland營(yíng)養(yǎng)液，并通過(guò)添加Na2SO4使處理間SO42-濃度保持一致。每個(gè)處理設(shè)6個(gè)重復(fù)，共12盆。試驗(yàn)期間，每隔1 d加入200 mL營(yíng)養(yǎng)液，每隔10 d取1次樣，各枝條采4片完全老熟葉片，共取10次樣。

1.2 方法

1.2.1 葉綠素和礦質(zhì)養(yǎng)分含量測(cè)定

葉綠素含量的測(cè)定根據(jù)《現(xiàn)代植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》[11]的方法進(jìn)行。葉片N含量用凱氏定N法測(cè)定，P含量用釩鉬黃比色法測(cè)定，K含量用火餡光度計(jì)測(cè)定，葉片Ca、Mg和Zn用原子吸收分光光度計(jì)法測(cè)定[12]。

1.2.2 抗氧化酶活性的測(cè)定

SOD、POD和CAT的粗酶提取液制備參照王春林等[13]的方法。SOD的活性根據(jù)Beauchamp等 [14]所述方法進(jìn)行測(cè)定；POD活性的測(cè)定方法：記錄3 mL反應(yīng)體系（1 mL 0.3%H2O2，0.95 mL 0.2%愈創(chuàng)木酚，1 mL 50 mmol/L，pH=7.0的磷酸緩沖液和0.05 mL粗酶提取液）在470 nm處的OD降低值，將每分鐘變化0.01定義為1個(gè)活力單位，計(jì)算POD；CAT活性的測(cè)定按照Ding等 [7]的方法進(jìn)行。

APX的提取與活性測(cè)定方法如下：0.100 g葉片加入提取液[50 mmol/L磷酸緩沖液（pH=7.0），1 mmol/L抗壞血酸，1 mmol/L乙二胺四乙酸]研磨，然后在4℃離心（8000 r/min，20 min），上清液定容至2 mL即為粗酶提取液。記錄3 mL反應(yīng)混合液[50 mmol/L磷酸緩沖液（pH為7.0），0.5 mmol/L抗壞血酸，0.5 mmol/L H2O2，0.1 mL酶液]在1 min內(nèi)290 nm下的光吸收值變化，以每分鐘吸光值變化0.01為1個(gè)酶活力單位計(jì)算APX活性。

1.2.3 H2O2和MDA含量的測(cè)定

稱取0.100 g葉片，參照林植芳[15]的方法測(cè)定H2O2含量；參照Sudhakar等[16]的硫代巴比妥酸法測(cè)定MDA含量。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

運(yùn)用Microsoft Excel軟件處理數(shù)據(jù)及制作圖表，顯著性分析用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉綠素含量及葉片養(yǎng)分

由圖1可知，在試驗(yàn)開始1個(gè)月后，缺鎂處理植株的葉片葉綠素a、葉綠素b及葉綠素總含量始終低于對(duì)照處理的植株，但是兩者的差異僅在最后一次取樣時(shí)達(dá)到顯著，而且不同于對(duì)照處理，隨著缺鎂處理的進(jìn)行，葉綠素a、葉綠素b及葉綠素總含量都要低于初次采樣值。這表明缺鎂處理3個(gè)月后才能導(dǎo)致‘砂糖橘葉片的葉綠素含量顯著降低。

試驗(yàn)開始前（0 d）和結(jié)束后（90 d）‘砂糖橘植株葉片的氮、磷、鉀和鎂含量如表1所示。經(jīng)過(guò)3個(gè)月的試驗(yàn)期，對(duì)照處理的植株葉片中氮、磷、鉀和鎂的含量均有不同程度的增加，而缺鎂處理的植株葉片中只有鉀的含量增加了，其余養(yǎng)分含量都有一定程度的減少，鎂含量降低幅度最大。在取樣的90 d時(shí)間點(diǎn)，缺鎂處理植株葉片各養(yǎng)分含量都要低于對(duì)照組，降低幅度的大小順序?yàn)殒V>鉀>磷>氮，但是都沒有達(dá)到顯著水平。這些結(jié)果表明缺鎂處理不僅降低‘砂糖橘植株葉片中的鎂含量，還影響鉀、磷、氮的吸收與同化。

2.2 葉片中過(guò)氧化氫和MDA的含量

圖2的數(shù)據(jù)表明，缺鎂導(dǎo)致‘砂糖橘植株葉片中過(guò)氧化氫含量有所升高，但是僅在70 d時(shí)表現(xiàn)出顯著性差異；與之類似，盡管可能由于幼苗移栽時(shí)需要適應(yīng)時(shí)間導(dǎo)致在20 d之前缺鎂處理的葉片MDA含量低于對(duì)照處理，但是20 d之后缺鎂處理均導(dǎo)致‘砂糖橘植株葉片的MDA含量有所升高，且其差異在40 d達(dá)到極顯著水平。這些結(jié)果表明，缺鎂的‘砂糖橘植株葉片中活性氧被激發(fā)，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞膜破損。

2.3 抗氧化酶活性

由圖3可以看出，缺鎂處理對(duì)‘砂糖橘植株葉片的SOD活性影響不大，但是對(duì)POD、CAT和APX活性均產(chǎn)生一定影響。在20 d之后，缺鎂處理增加了POD和CAT的活性，30 d和40 d時(shí)缺鎂處理和對(duì)照之間的POD活性存在顯著差異；但是，缺鎂處理對(duì)APX活性的影響不穩(wěn)定（圖3）。這些結(jié)果表明，缺鎂處理對(duì)‘砂糖橘植株葉片中抗氧化酶活性產(chǎn)生一定的影響，提高其對(duì)缺鎂脅迫的適應(yīng)能力。

3 討論與結(jié)論

本試驗(yàn)中，缺鎂對(duì)‘砂糖橘植株葉片中氮、磷、鉀和鎂含量的影響不顯著，這是因?yàn)樵囼?yàn)材料為兩年生苗，其枝干內(nèi)貯存的氮、磷、鉀、鎂等養(yǎng)分在3個(gè)月的試驗(yàn)期內(nèi)能維持葉片生長(zhǎng)的需要?？梢酝茰y(cè)，如果本試驗(yàn)再延長(zhǎng)3個(gè)月甚至更長(zhǎng)時(shí)間，那么缺鎂處理和對(duì)照的差異將更為明顯。盡管如此，與對(duì)照處理相比，本試驗(yàn)中缺鎂處理3個(gè)月后氮、磷、鉀、鎂的含量還是出現(xiàn)不同程度的下降，且以鎂的下降幅度最大，另一方面，不同于對(duì)照處理中四種元素都比處理開始時(shí)增加了，缺鎂處理中只有鉀含量增加了2倍多，而氮、磷和鎂都降低了。這些結(jié)果說(shuō)明，缺鎂對(duì)植株其他養(yǎng)分的吸收也具有抑制（氮、磷）或促進(jìn)（鉀）作用。鎂與鉀之間的拮抗作用在阿萊檬[16]和水稻[17]等許多作物上已有報(bào)道，這是因?yàn)樗鼈兌际顷?yáng)離子，從而競(jìng)爭(zhēng)通用離子載體進(jìn)入植株體內(nèi)[18]，此外，植株對(duì)鎂的吸收還會(huì)強(qiáng)烈受到其它陽(yáng)離子如NH4+、Ca2+、Mn2+、H+和Al3+等的抑制[19]。

鎂是葉綠素的構(gòu)成成分之一，缺鎂不利于葉綠素的合成[1]。本試驗(yàn)中，‘砂糖橘植株葉片中葉綠素含量在缺鎂處理3個(gè)月后顯著下降，這與在缺鎂‘春見橘橙[20]和龍眼[21]葉片中觀察到的一致。葉綠素含量的減少將會(huì)導(dǎo)致葉片褪綠黃化，這與我們?cè)诖筇飾l件下的觀察一致[9-10]。

在大多數(shù)的脅迫條件下，植物細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)活性氧的累積，進(jìn)而破壞植物細(xì)胞，導(dǎo)致器官衰老。本試驗(yàn)中的缺鎂處理在‘砂糖橘植株葉片也造成一定程度的脅迫，表現(xiàn)為葉片中過(guò)氧化氫累積，這種缺鎂誘導(dǎo)的活性氧進(jìn)而攻擊細(xì)胞膜，造成細(xì)胞內(nèi)含物外泄，葉片MDA含量增加。缺鎂誘導(dǎo)過(guò)氧化氫累積和MDA含量增加在‘春見橘橙[20]、龍眼[21]、黃瓜[22]和紅地球葡萄[23]上都有報(bào)道。

植物應(yīng)對(duì)環(huán)境脅迫下活性氧的累積的重要機(jī)制之一是啟動(dòng)抗氧化酶系統(tǒng)[6]。本試驗(yàn)的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，缺鎂處理3個(gè)月的‘砂糖橘植株葉片中SOD活性受缺鎂脅迫影響較小，APX活性對(duì)缺鎂脅迫的響應(yīng)沒有規(guī)律。這表明SOD和APX可能沒有參與‘砂糖橘植株葉片中活性氧的清除，這與Tewari等[5]在研究缺鎂脅迫對(duì)桑樹的影響試驗(yàn)中所觀察的結(jié)果不一致。另一方面，本試驗(yàn)中，POD和CAT活性在缺鎂處理的植株中高于對(duì)照植株，這與在玉米[4]、桑樹[5]和大豆[24]等植株上的結(jié)果相一致。本試驗(yàn)結(jié)果和前人的研究結(jié)果綜合表明，在應(yīng)對(duì)缺鎂脅迫時(shí)，啟動(dòng)抗氧化酶系統(tǒng)是共同機(jī)制，但是參與作用的抗氧化酶種類則因物種的不同而有差異。尹永強(qiáng)等[25]指出，在SOD、CAT、APX和POD中，POD一般在老化組織中活性較高，幼嫩組織中活性較弱，而鎂在植株體內(nèi)為可移動(dòng)性，缺鎂主要從老葉開始，這可能是在大多數(shù)植物上發(fā)現(xiàn)POD對(duì)缺鎂脅迫積極響應(yīng)的原因之一。

參考文獻(xiàn)

[1] Sun N， Zeng X， Li J， et al.Effects of magnesium compound with fertilizer on daylily （Hemerocallis citrine Baroni） growth and soil nutrients[J]. Agricultural sciences in China， 2006， 5（2）： 123-129.

[2] 熊英杰，陳少風(fēng)，李恩香，等. 植物缺鎂研究進(jìn)展及展望[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（15）：7 754-7 757.

[3] Cakmak I， Marschner H. Magnesium deficiency and high light intensity enhance activities of superoxide dismutase， ascorbate peroxidase， and glutathione reductase in bean leaves[J]. Plant Physiology， 1992， 98（4）： 1 222-1 227.

[4] Tewari K， Kumar P， Tewari N， et al. Macronutrient deficiencies and differential antioxidant responses-influence on the activity and expression of superoxide dismutase in maize[J]. Plant Science， 2004， 166（3）： 687-694.

[5] Tewari R， Kumar P， Sharma P. Magnesium deficiency induced oxidative stress and antioxidant responses in mulberry plants[J]. Scientia Horticulturae， 2006， 108（1）： 7-14.

[6] Apel K，Hirt H.Reactive oxygen species： metabolism， oxidative stress， and signal transduction[J]. Annual Review of Plant Biology， 2004， 55：373-399.

[7] Ding Y， Chang C， Luo W， et al. High potassium aggravates the oxidative stress induced by magnesium deficiency in rice leaves[J]. Pedosphere，2008， 18（3）： 316-327.

[8] Scandalios JG. Oxidative stress： molecular perception and transduction of signals triggering antioxidant gene defenses[J]. Brazilian Journal of Medical and Biological Research， 2005， 38（7）： 995-1 014.

[9] 陳偉立，陳 意，崔 航，等. 廣東省砂糖橘主產(chǎn)區(qū)果園土壤與樹體養(yǎng)分狀況分析. 中國(guó)南方果樹，2013，42（1）：5-7，11.

[10] 陳偉立，王雨南，崔 航，等.‘十月桔黃化與正常植株的礦質(zhì)養(yǎng)分及果實(shí)品質(zhì)比較. 中國(guó)南方果樹，2012，41（6）：5-7，19.

[11] 湯章城. 現(xiàn)代植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指南[M]. 科學(xué)出版社，1999：95-96.

[12] 鮑士旦. 土壤農(nóng)化分析[M]. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2000：257-282.

[13] 王春林，張玉鑫，陳年來(lái)，等. BTH誘導(dǎo)甜瓜愈傷組織活性氧代謝和抗性酶活性的信號(hào)途徑. 果樹學(xué)報(bào)，2012，29（2）：246-252.

[14] Beauchamp C， Fridovich I. Superoxide dismutase： improved assays and an assay applicable to acrylamide gels[J]. Analytical Biochemistry，1971， 44（1）： 276-287.

[15] 林植芳，李雙順，林桂珠，等. 衰老葉片和葉綠體中H2O2的累積與膜脂過(guò)氧化的關(guān)系[J]. 植物生理學(xué)報(bào)，1988，14（1）：16-12.

[16] Bleda， F J， Madrid， R， Garc I A， et al. Chlorophyll fluorescence and mineral nutrition in citrus leaves under salinity stress[J]. Journal of Plant Nutrition， 2011， 34（11）： 1 579-1 592.

[17] Ding Y C， Chang C R， Luo W， et al. High potassium aggravates the oxidative stress induced by magnesium deficiency in rice leaves[J]. Pedosphere，2008， 18（3）： 316-327.

[18] Marschner H， Marschner P. Marschner's mineral nutrition of higher plants[M]. Academic press， 2012： 165.

[19] Ding Y， Luo W， Xu G. Characterisation of magnesium nutrition and interaction of magnesium and potassium in rice[J]. Annals of Applied Biology，2006， 149（2）： 111-123.

[20] 申 燕，肖家欣，楊 慧，等.鎂脅迫對(duì)‘春見橘橙生長(zhǎng)和礦質(zhì)元素分布及葉片超微結(jié)構(gòu)的影響[J]. 園藝學(xué)報(bào)，2011（5）：849-858.

[21] 李 延，劉星輝. 缺鎂脅迫對(duì)龍眼葉片衰老的影響[J]. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2002（3）：311-314.

[22] 楊廣東，朱祝軍，計(jì)玉妹. 不同光強(qiáng)和缺鎂脅迫對(duì)黃瓜葉片葉綠素?zé)晒馓匦院突钚匝醍a(chǎn)生的影響[J]. 植物營(yíng)養(yǎng)與肥料學(xué)報(bào)，2002，8（1）：115-118.

[23] 商佳胤，集 賢，常永義，等. 缺鎂對(duì)紅地球葡萄幼苗生理特性的影響[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009（8）：3 399-3 400，3 440.

[24] 王 芳，劉 鵬，史 鋒，等. 鎂對(duì)大豆葉片抗氧化代謝的影響[J]. 中國(guó)油料作物學(xué)報(bào)，2006，28（1）：32-38.

[25] 尹永強(qiáng)，胡建斌，鄧明軍. 植物葉片抗氧化系統(tǒng)及其對(duì)逆境脅迫的響應(yīng)研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2007，23（1）：105-110.