蔡海濱++涂敏等

摘 要 針對(duì)常規(guī)石蠟切片方法無(wú)法制得橡膠樹(shù)木質(zhì)部切片的問(wèn)題，優(yōu)化了橡膠樹(shù)木質(zhì)部切片制作方法并進(jìn)行了驗(yàn)證評(píng)估。以3齡和30齡的橡膠樹(shù)木材為材料，經(jīng)FAA固定、乙醇預(yù)處理后，增加了以冰醋酸軟化木質(zhì)部這一步驟，用正丁醇取代二甲苯進(jìn)行組織透明，其余步驟參考常規(guī)方法。結(jié)果表明，優(yōu)化的石蠟切片方法可制作出完整、高質(zhì)量的木質(zhì)部切片，其木纖維的長(zhǎng)度、寬度與硝酸離析所得到的木纖維一致度高，為橡膠樹(shù)成齡木材的解剖學(xué)研究提供了方法。

關(guān)鍵詞 橡膠樹(shù) ；木質(zhì)部 ；石蠟切片 ；木纖維

分類號(hào) S794.1

An Improved Method for Paraffin Section Preparation of Hevea Xylem

CAI Haibin TU Min HU Yanshi

CHENG Han AN Zewei HUA Yuwei HUANG Huasun

（Rubber Research Institute /

Ministry of Agriculture Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of Rubber Tree /

State Center for Rubber Tree Breeding， CATAS， Danzhou， Hainan 571737）

Abstract In this paper， we improved and evaluated paraffin section method of Hevea xylem compared to the conventional method. 3-year-old and 30-year-old rubber tree woods were collected， fixed in FAA， pretreated by ethanol， softened by acetic acid and transparentized by n-butanol replacing xylene. The remaining steps referenced conventional method. The result indicated that the improved method could produce complete， high quality paraffin section of Hevea xylem. The length and width of wood fiber by paraffin section had high consistency with those obtained by nitrate segregation， which provided a method for the study of mature Hevea wood anatomy.

Keywords Hevea brasiliensis ； xylem ； paraffin section ； wood fiber

中國(guó)位于太平洋西岸，海南和廣東等沿海地區(qū)橡膠生產(chǎn)經(jīng)常遭受臺(tái)風(fēng)的嚴(yán)重危害[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，1951～1990年間，熱帶風(fēng)暴和臺(tái)風(fēng)在海南登陸共62次，平均每年1.55次[2]。解決橡膠樹(shù)的抗風(fēng)問(wèn)題是這些地區(qū)橡膠樹(shù)栽培與持續(xù)高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)的重要措施之一。研究表明，橡膠樹(shù)風(fēng)害是各種生物和非生物因子的綜合作用結(jié)果。與弱抗風(fēng)品種相比較，抗風(fēng)品種木材纖維較粗短、壁較薄、腔徑較大[3-4]。因此，橡膠樹(shù)木質(zhì)部石蠟切片制作在橡膠樹(shù)抗風(fēng)因子研究中非常重要。

石蠟切片（paraffin section）技術(shù)被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)、組織學(xué)、發(fā)育生物學(xué)和病理學(xué)等領(lǐng)域[5]，常應(yīng)用于動(dòng)、植物標(biāo)本的組織形態(tài)學(xué)觀察、細(xì)胞結(jié)構(gòu)學(xué)觀察、特定組織蛋白免疫組化、原位雜交及原位PCR 等，使細(xì)胞組織的形態(tài)觀察研究從簡(jiǎn)單的形態(tài)結(jié)構(gòu)深入到各種成分的定性觀察，又從定性轉(zhuǎn)向定量計(jì)測(cè)[6]。常規(guī)石蠟切片的制作過(guò)程包括石蠟組織塊制作、切片制作和染色，具體的制作過(guò)程是：取材→固定→沖洗→脫水→透明→浸蠟→包埋→切片→貼片→烤片→染色→封固。其中的每一個(gè)環(huán)節(jié)都是相互關(guān)聯(lián)，任何一個(gè)環(huán)節(jié)若不按規(guī)范操作，都會(huì)影響最終制片的質(zhì)量[7]。然而，在眾多組織中，以高大喬木的木質(zhì)部為材料制作石蠟切片尤為困難。筆者在總結(jié)前人研究的基礎(chǔ)上，通過(guò)長(zhǎng)期的摸索，改進(jìn)了常規(guī)石蠟切片制作方法，使得30齡的橡膠樹(shù)木質(zhì)部組織也能被制作出高質(zhì)量的切片。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

供試植物材料為3齡和30齡的橡膠樹(shù)品種PR107，由國(guó)家橡膠樹(shù)種質(zhì)資源圃提供。分別選取距地面1 m處的樹(shù)干，各3次重復(fù)。

1.1.2 試劑及儀器

試劑包括切片石蠟、二甲苯、FAA固定劑、冰醋酸、80%乙醇、95%乙醇、100%乙醇、正丁醇、番紅染液、硝酸、鉻酸、結(jié)晶紫、樹(shù)膠等；主要儀器：LEICA RM2235切片機(jī)、LEICA DMLB顯微鏡。

1.2 方法

1.2.1 常規(guī)石蠟切片方法制作橡膠樹(shù)木質(zhì)部切片[8-9]

在橡膠樹(shù)木材處（距離木材韌皮部3～5 cm）切取約0.5 cm×1 cm×1 cm（橫×弦×徑向）的樣品木材小塊 → FAA固定液固定 → 80%乙醇（1 h）→ 95%乙醇（1 h）→ 100%乙醇（1 h×3次）→二甲苯Ⅰ（1 h）→二甲苯Ⅱ（1 h）→二甲苯Ⅲ（1 h）→二甲苯/石蠟（V∶V=1∶1）（65℃，48～72 h）→石蠟Ⅰ（65℃滲蠟4 h）→ 石蠟Ⅱ（65℃，4 h）→石蠟Ⅲ（65℃，4 h）→包埋→切片（10 μm）→貼片→展片→番紅染色（30 min）→ 顯微觀察。

1.2.2 優(yōu)化的石蠟切片方法制作橡膠樹(shù)木質(zhì)部切片[10-12]

取材→固定液固定→80%乙醇（1 h）→ 95%乙醇（1 h）→ 100%乙醇（1 h×3次）→冰醋酸（36～48 h）→冰醋酸/無(wú)水乙醇（V∶V=1∶3，1 h）→無(wú)水乙醇（1 h×3次）→ 100%乙醇/正丁醇（V∶V=1∶1，1 h）→ 正丁醇Ⅰ（2 h）→正丁醇Ⅱ（2 h）→正丁醇Ⅲ（2 h）→正丁醇/石蠟（V∶V=1∶1，65℃，12～16 h），后續(xù)步驟與常規(guī)方法一致。

1.2.3 優(yōu)化的石蠟切片制作方法有效性驗(yàn)證

在橡膠樹(shù)木材（距離木材韌皮部3～5 cm）處切取1 cm×1 cm×1 cm（橫×弦×徑向）的樣品木材小塊；從樣品木材小塊上切下縱向1 cm長(zhǎng)的火柴桿粗細(xì)的小棒，3次重復(fù)；采用硝酸離析法[13-15]對(duì)木質(zhì)部纖維進(jìn)行結(jié)構(gòu)解剖，用0.10 kg/L鉻酸與10%（φ）硝酸（V∶V=1∶1）的混合液離析木材小棒4～5 d；離析后的材料經(jīng)水清洗、系列乙醇脫水、0.01 kg/L的結(jié)晶紫染液染色、 二甲苯透明、樹(shù)膠封片后，在光學(xué)顯微鏡下觀察，拍照測(cè)量木纖維的長(zhǎng)度與寬度。

2 結(jié)果與分析

2.1 2種方法的木質(zhì)部切片結(jié)果比較

用常規(guī)的石蠟切片方法，無(wú)法獲得完整的3齡和30齡的橡膠樹(shù)木質(zhì)部切片（圖1-A），主要表現(xiàn)在：（1）切片時(shí)，石蠟與木質(zhì)部脫離；（2）木質(zhì)部脫水后硬且脆，容易破碎；（3）脫蠟染色時(shí)，木質(zhì)部發(fā)生卷曲、脫落。而優(yōu)化的石蠟切片方法可以制作3齡幼樹(shù)和30齡老樹(shù)完整、高質(zhì)量的木質(zhì)部石蠟切片，能清晰觀察到細(xì)長(zhǎng)的木纖維細(xì)胞以及緊密排列在四周的木射線細(xì)胞（圖1-B和圖1-C）。

2.2 優(yōu)化法與硝酸離析所得木纖維比較

用硝酸離析后得到的木質(zhì)部，經(jīng)顯微觀測(cè)可清晰見(jiàn)到分散的木纖維細(xì)胞（圖1-D）。分別測(cè)量?jī)?yōu)化法和硝酸離析所得到木纖維的長(zhǎng)度與寬度，通過(guò)DPS數(shù)據(jù)比較發(fā)現(xiàn)，優(yōu)化的石蠟切片中9份實(shí)驗(yàn)材料的木纖維長(zhǎng)度均小于硝酸離析所得的木纖維長(zhǎng)度，但二者差異不顯著（圖2），二者木纖維寬度的數(shù)據(jù)差異也極?。▓D3）。

3 討論

橡膠樹(shù)木質(zhì)部石蠟切片制作的質(zhì)量直接關(guān)系到木纖維觀測(cè)的準(zhǔn)確性，進(jìn)而影響橡膠樹(shù)木材特性的研究。通過(guò)3齡和30齡的橡膠樹(shù)品種PR107木質(zhì)部石蠟切片制作，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，常規(guī)的植物石蠟切片方法不能用于制作橡膠樹(shù)木質(zhì)部石蠟切片，因此，筆者對(duì)其進(jìn)行了改進(jìn)，主要包括：（1）增加醋酸軟化這一步驟，通過(guò)醋酸38 h的軟化，橡膠樹(shù)木質(zhì)部組織變得松軟，容易浸蠟，利于順利完成切片，大大少于樹(shù)芯切片的軟化時(shí)間[于70%乙醇與甘油的混合液（V∶V=1∶1）中進(jìn)行軟化，軟化時(shí)間需大于1周][16]；（2）用正丁醇取代二甲苯作為透明劑，二甲苯氣味難聞且有毒，用正丁醇替換既保證了實(shí)驗(yàn)效果，同時(shí)比較環(huán)保，對(duì)人體傷害小；（3）優(yōu)化了橡膠樹(shù)木質(zhì)部組織脫水、軟化、透明和浸蠟等步驟的處理時(shí)間，使木質(zhì)部石蠟制片的效果達(dá)到最佳。結(jié)果發(fā)現(xiàn)石蠟切片的木纖維長(zhǎng)度均小于硝酸離析所得的木纖維長(zhǎng)度，主要原因是石蠟切片中的木纖維相互交錯(cuò)，起始點(diǎn)與終止點(diǎn)較難準(zhǔn)確把握。本研究通過(guò)對(duì)常規(guī)石蠟切片方法的改進(jìn)，制出完整、優(yōu)質(zhì)的橡膠樹(shù)木質(zhì)部切片，不僅為橡膠樹(shù)成齡木材的解剖學(xué)研究提供了方法，同時(shí)也為其它高大喬木木質(zhì)部的研究奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1] 黃宗道. 熱帶北緣橡膠樹(shù)栽培[M]. 廣州：廣東科技出版社，1987.

[2] 黃華孫. 中國(guó)橡膠樹(shù)育種五十年[M]. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2005.

[3] 鄭興峰，邱德勒，陶忠良，等. 巴西橡膠樹(shù)不同抗風(fēng)性品系木材胞壁纖絲角[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)，2002，23（1）：14-18.

[4] 付志一，焦群英. 植物細(xì)胞力學(xué)模型研究進(jìn)展[J]. 力學(xué)進(jìn)展，2005，35（3）：404-410.

[5] 何鳳仙. 植物學(xué)實(shí)驗(yàn)[M]. 北京：高等教育出版社，2000：25.

[6] 丘安經(jīng). 植物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M]. 廣州：華南理工大學(xué)出版社，2003：121.

[7] 侯春春，徐 水. 淺析影響石蠟切片質(zhì)量的關(guān)鍵因素[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2009，25（23）：94-98.

[8] 施恩青. 改良與常規(guī)石蠟切片方法在切片質(zhì)量方面的比較[J]. 齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2014，35（16）：2 442-2 443.

[9] 楊捷頻. 常規(guī)石蠟切片方法的改良[J]. 生物學(xué)雜志，2006，23（1）：45-46.

[10] 帥煥麗，楊途熙，魏安智，等. 杏花芽石蠟切片方法的改良[J]. 果樹(shù)學(xué)報(bào)，2011，28（3）：536-539，552.

[11] 毛曉霞. 石蠟切片制作方法的改良[J]. 安徽農(nóng)學(xué)通報(bào)，2013，19（8）：15-16，39.

[12] 李 璐. 石蠟切片制作的注意事項(xiàng)[J]. 臨床合理用藥雜志，2012，5（3）：107-108.

[13] 徐 茜，陳亞寧. 胡楊莖木質(zhì)部解剖結(jié)構(gòu)與水力特性對(duì)干旱脅迫處理的響應(yīng)[J]. 中國(guó)生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2012，20（8）：1 059-1 065.

[14] 史剛榮，王旭明，張 錚. 安徽黃山華中五味子次生木質(zhì)部的生態(tài)解剖[J]. 廣西植物，2007，27（2）： 161-166.

[15] 鄭興峰，陶忠良，邱德勃，等. 巴西橡膠樹(shù)抗風(fēng)品系木材纖維的解剖特征[J]. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2003，24（1）：47-49.

[16] 張軍周，勾曉華，趙志千，等. 樹(shù)輪生態(tài)學(xué)研究中微樹(shù)芯石蠟切片制作的方法探討[J]. 植物生態(tài)學(xué)報(bào)， 2013，37（10）：972-977.