秦玉芝，邢錚，潘妃，熊興耀,2*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京 100081)

植物MYB 類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子以含有MYB 結(jié)構(gòu)域?yàn)楣餐卣鱗1]。每個(gè)MYB 結(jié)構(gòu)域以螺旋–轉(zhuǎn)角–螺旋(helix–tum–helix，HTH)的形式結(jié)合于目標(biāo)DNA 大溝處，調(diào)控目的基因的轉(zhuǎn)錄[2]。第1個(gè)植物myb 基因ZmMYBc1 是Paz–Ares 于1987年在玉米中發(fā)現(xiàn)的，ZmMYBc1 與動(dòng)物myb 基因的同源性達(dá)40%[3]。不同作物中myb 基因的數(shù)量各異，在玉米中表達(dá)的myb 基因約有80個(gè)以上[4]，擬南芥中MYB 類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子有129個(gè)[5]，馬鈴薯中MYB 類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子有117個(gè)。MYB 類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子中以R2R3–MYB 的數(shù)量最多，其功能涉及植物次生代謝調(diào)控、細(xì)胞形態(tài)發(fā)生、激素刺激和環(huán)境脅迫應(yīng)答、分生組織形成及細(xì)胞周期控制等過(guò)程[6]。關(guān)于馬鈴薯MYB 類(lèi)基因克隆和功能分析的報(bào)道尚少。在前期研究中，筆者發(fā)現(xiàn)了1個(gè)受光影響，并且對(duì)馬鈴薯花青素合成關(guān)鍵酶StCHS 基因表達(dá)具有明顯正向作用的MYB 轉(zhuǎn)錄因子(GenBank: DQ917781.1)[7]，本研究中通過(guò)同源克隆，在馬鈴薯原始栽培種Yan 中獲得了該轉(zhuǎn)錄因子(StR2R3– MYB1)的完整CDS 序列，并運(yùn)用現(xiàn)代生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)馬鈴薯StR2R3–MYB1 基因序列和蛋白質(zhì)序列特征進(jìn)行了比對(duì)、分析和預(yù)測(cè)，對(duì)基因表達(dá)的亞細(xì)胞定位、組織表達(dá)特異性及光照應(yīng)答模式進(jìn)行了分析，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

馬鈴薯原始栽培種 Yan(S. tuberosum subsp. andigena var. yanacochense)由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)馬鈴薯工程技術(shù)中心種質(zhì)資源庫(kù)提供。擬南芥原生質(zhì)體由湖南大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)研究院劉選明先生惠贈(zèng)。表達(dá)載體pEGAD、pEGAD–MYC、PA7–YFP、大腸桿菌DH5α、農(nóng)桿菌菌種Agl–0 均由湖南大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)研究院劉選明先生惠贈(zèng)；T 載體pGM–T 購(gòu)自天根生化公司。

1.2 方法

1.2.1 基因的克隆

根據(jù)表1 設(shè)計(jì)的引物，以由RNA 逆轉(zhuǎn)錄所得cDNA 為模板進(jìn)行RT–PCR 。

表1 StR2R3–MYB1 克隆引物 Table 1 Primer sequences for StR2R3–MYB1 cloning

1.2.2 序列生物信息學(xué)分析的相關(guān)網(wǎng)站和軟件

馬鈴薯基因組數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)站：http://www. potatogenome.net/index.php/Main_Page。

蛋白結(jié)構(gòu)域分析網(wǎng)站：http://www.Ncbi.nlm.nih.gov/。

轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域元件分析網(wǎng)站：PlantCARE (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)。

蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)網(wǎng)站：ProtParam(http://web. expasy.org/protparam/)。

卷曲螺旋結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)網(wǎng)站：COILSServer(http: //embnet.vital–it.ch/software/COILS_form.html)。

三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)網(wǎng)站：SWISS–MODEL(http:// swissmodel.expasy.org/)。

跨膜區(qū)域分析網(wǎng)站：TMHMM(http://www.cbs. dtu.dk/services/TMHMM/)。

信號(hào)肽分析工具網(wǎng)站：SignalIP3.0(http://www. cbs.dtu.dk/services/SignalP/)。

親疏水性分析網(wǎng)站：http://www.expasy.ch/cgi– bin/protscale.pl。

同源性分析采用GeneDoc 軟件。進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建采用MEGA5.0 軟件。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

定量PCR 反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性10min，95℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸20 s， 45個(gè)循環(huán)。

內(nèi)參為ActinB。所有檢測(cè)樣品均設(shè)置3次重復(fù)。定量引物見(jiàn)表2。

表2 StR2R3–MYB1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 引物 Table 2 qPCR primer sequences for StR2R3–MYB1

1.2.4 擬南芥原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化

取20μg 重組質(zhì)粒，加入100 μL 擬南芥原生質(zhì)體和110 μL PEG 溶液，混勻，放置30min。加入440 μL W5 溶液，23℃、750 r/min 離心1min。

1.2.5 光處理

新繼代的組培苗置于黑暗、22℃培養(yǎng)箱中生長(zhǎng)12 d，形成白化苗。將白化苗分別置于白光、藍(lán)光、紅光、遠(yuǎn)紅光培養(yǎng)箱中，于放置后0、0.5、1、2、4、8、12、24 h 取樣，–80℃保存。藍(lán)光、紅光、遠(yuǎn)紅光和白光光源分別為L(zhǎng)ED–藍(lán)光(波長(zhǎng)為 470 nm)，LED–紅光(波長(zhǎng)為 660 nm)，LED–遠(yuǎn)紅光(波長(zhǎng)為740 nm)和白色熒光燈。

2 結(jié)果與分析

2.1 馬鈴薯StR2R3–MYB1 基因的克隆與同源性分析

經(jīng)RT–PCR 擴(kuò)增，獲得1 條800 bp 的特異性片段。該片段包含1個(gè)全長(zhǎng)798 bp 的CDS 序列，編碼265個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的蛋白質(zhì)，命名為StR2R3– MYB1。馬鈴薯StR2R3–MYB1 蛋白序列與番茄、茄子的同源性高達(dá)99%，與擬南芥MYB113 的同源性也在70%以上(圖1～3)。

圖1 StR2R3–MYB1 氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果 Fig. 1 Homology analysis for amino acid sequence of StR2R3 – MYB1

圖2 StR2R3–MYB1 cDNA 序列與其氨基酸序列預(yù)測(cè)結(jié)果 Fig. 2 Prediction for cDNA and amino acid sequence of StR2R3–MYB1

圖3 StR2R3–MYB1 氨基酸序列同源性分析的結(jié)果 Fig.3 Homology analysis for amino acid sequence of StR2R3–MYB1

2.2 StR2R3–MYB1 蛋白序列結(jié)構(gòu)的分析

StR2R3–MYB1 蛋白全長(zhǎng)265 aa，主要氨基酸為天冬氨酸(9.8%)、亮氨酸(9.4%)、甘氨酸(7.5%)和谷氨酸(6.8%)，正/負(fù)電荷殘基數(shù)分別為32 和32，相對(duì)分子質(zhì)量為30.23，分子式為C1316H2072N386O399S17，等電點(diǎn)為6.95，不穩(wěn)定系數(shù)為47.52(＞40)，穩(wěn)定性弱，沒(méi)有跨膜信號(hào)，蛋白氨基酸序列不存在卷曲螺旋。StR2R3–MYB1 蛋白的疏水區(qū)域分布比較均衡，疏水性氨基酸多于親水性氨基酸，但其N(xiāo) 端具有明顯的親水區(qū)域（圖4）。

2.3 StR2R3–MYB1 核酸序列的結(jié)構(gòu)

StR2R3–MYB1 基因位于馬鈴薯10 號(hào)染色體的51 749 197～51 750 359 bp，基因全長(zhǎng)1 163 bp，由3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成。CDS 序列中含有2個(gè)DNA–結(jié)合結(jié)構(gòu)域，分別位于第21～71 aa 和第74～122 aa，屬于R2R3 類(lèi)MYB 轉(zhuǎn)錄因子，將該基因命名為StR2R3– MYB1。對(duì)啟動(dòng)子順式作用元件[8]進(jìn)行分析的結(jié)果表明，StR2R3–MYB1 基因的調(diào)控區(qū)域存在大量與光相關(guān)的元件，如G–Box、Box4、BoxⅡ、I–Box、MNF1 等，還存在脫落酸誘導(dǎo)相關(guān)元件ABRE、生物鐘相關(guān)元件Circadian 和茉莉酸甲酯相關(guān)元件CGTCA– motif (圖5)。

圖4 StR2R3-MYB1 蛋白疏水性/親水性預(yù)測(cè)結(jié)果 Fig. 4 StR2R3-MYB1 protein hydrophobic/hydrophilic prediction

2.4 StR2R3–MYB1 蛋白的亞細(xì)胞定位分析

將構(gòu)建好的StR2R3–MYB1 與YFP 融合蛋白表達(dá)載體轉(zhuǎn)化擬南芥原生質(zhì)體，在激光共聚焦掃描顯微鏡下觀(guān)察基因的亞細(xì)胞定位情況，可見(jiàn)StR2R3–MYB1∷YFP 融合蛋白定位在細(xì)胞核內(nèi) (圖6)。

2.5 StR2R3–MYB1 基因表達(dá)模式的分析

實(shí)時(shí)熒光定量PCR 分析結(jié)果顯示，StR2R3– MYB1 在根、莖、葉的相對(duì)表達(dá)量依次升高(表3)。

表3 StR2R3–MYB1 基因在不同組織部位的相對(duì)表達(dá)量 Table 3 Gene expression pattern analysis for StR2R3–MYB1

2.6 光調(diào)節(jié)StR2R3–MYB1 基因的表達(dá)

黑暗培養(yǎng)12 d 的馬鈴薯白化苗轉(zhuǎn)移至白光下生長(zhǎng)0、0.5、2、4、8、12、24 h 的StR2R3–MYB1基因表達(dá)量隨光處理時(shí)間的延長(zhǎng)呈上升趨勢(shì)(圖7)， StR2R3–MYB1 的表達(dá)受到了白光的誘導(dǎo)。分別用紅、藍(lán)和遠(yuǎn)紅光處理白化苗后，3 種單色光都能誘導(dǎo)StR2R3–MYB1 的表達(dá)，其中遠(yuǎn)紅光、藍(lán)光誘導(dǎo)4 h 時(shí)，StR2R3–MYB1 的表達(dá)量出現(xiàn)第1個(gè)峰值，隨后下降，在12 h 后回升。紅光對(duì)StR2R3–MYB1 的誘導(dǎo)作用在8 h 后開(kāi)始顯現(xiàn)(圖7)。

圖7 光調(diào)節(jié)StR2R3–MYB1 基因的表達(dá) Fig. 7 Expression of light regulationgene of StR2R3–MYB1

3 結(jié)論與討論

在植物響應(yīng)逆境脅迫的信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)中，轉(zhuǎn)錄因子起著重要的作用。序列分析結(jié)果表明，馬鈴薯StR2R3–MYB1 與其他MYB家族轉(zhuǎn)錄因子在DNA 結(jié)合域具有高度保守性，屬于典型的R2R3 類(lèi)型MYB 轉(zhuǎn)錄因子。核苷酸序列和氨基酸序列分析結(jié)果表明，StR2R3–MYB1 的調(diào)控區(qū)域存在大量與光相關(guān)的元件，如G–Box、Box4、BoxⅡ、I–Box、MNF1等，還存在脫落酸誘導(dǎo)相關(guān)元件ABRE、生物鐘相關(guān)元件Circadian、茉莉酸甲酯相關(guān)元件CGTCA。StR2R3–MYB1 的轉(zhuǎn)錄很可能受光信號(hào)及環(huán)境脅迫的誘導(dǎo)。StR2R3–MYB1 氨基酸序列上沒(méi)有跨膜信號(hào)，不存在卷曲螺旋，具有明顯的親水區(qū)域，氨基酸殘基與水分子的相互作用較強(qiáng)，表明該蛋白的穩(wěn)定性較低。亞細(xì)胞定位分析發(fā)現(xiàn)StR2R3–MYB1 蛋白在細(xì)胞核中表達(dá)，這正符合轉(zhuǎn)錄因子的亞細(xì)胞定位特征。系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果表明，StR2R3–MYB1 與擬南芥AtMTB113、AtMTB90 和茄子SmMYB 及番茄SlCMYB1 同屬于1個(gè)亞族。該亞族MYB 轉(zhuǎn)錄因子的功能多數(shù)與花青素合成相關(guān)，如AtMTB113 與花青素積累有關(guān)[8–9]，而AtMTB90 與色素合成相關(guān)[10]，SmMYB 與花青素合成相關(guān)[11]，SlCMYB1 則與冷誘導(dǎo)、低溫脅迫相關(guān)[12]。筆者的前期研究[7]中運(yùn)用多因子及其互作逐步回歸法建立光照度、溫度和處理時(shí)間影響基因表達(dá)的模式，發(fā)現(xiàn)環(huán)境溫度與StR2R3–MYB1 和StPAL、StDFR 基因的表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)，環(huán)境光照度與StR2R3–MYB1 和StCHS、StDFR的表達(dá)呈正相關(guān)。馬鈴薯StR2R3–MYB1 轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子對(duì)StCHS 基因的表達(dá)具有明顯正向影響。本研究中StR2R3–MYB1 蛋白結(jié)構(gòu)分析、蛋白功能預(yù)測(cè)、基因組織表達(dá)特性分析及光處理后基因表達(dá)特性分析等研究結(jié)果，使前期研究中的推斷StR2R3–MYB1 與受光和低溫調(diào)節(jié)的馬鈴薯花青素合成相關(guān)[7]得到了進(jìn)一步的印證。

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