陳銀岳，孫葉,2，霍永久，占今舜，劉明美，詹康，趙國(guó)琦*

(1.揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009；2.揚(yáng)州循天嶺生物科技有限公司，江蘇 揚(yáng)州 225009)

蛹蟲(chóng)草(Cordyceps military)，又名北冬蟲(chóng)夏草、北蛹蟲(chóng)草等，屬于麥角菌科真菌屬子囊菌種[1]。蛹蟲(chóng)草含有多種生物活性物質(zhì)，包括蟲(chóng)草素、蟲(chóng)草多糖、甘露醇(蟲(chóng)草酸)、類胡蘿卜素以及多種氨基酸等[2–3]，其中對(duì)蟲(chóng)草多糖、蟲(chóng)草素、蟲(chóng)草酸等的研究報(bào)道較多[4–6]，而涉及蟲(chóng)草類的胡蘿卜素相關(guān)報(bào)道較少。類胡蘿卜素是一類由8個(gè)異戊二烯單位連接而成的親脂化合物[7]，可用作天然色素添加劑，應(yīng)用于食品、化妝品等領(lǐng)域[8]。有研究指出，化工合成的類胡蘿卜素不具有抗病效果[9]，而天然類胡蘿卜素具有較好的抗癌、抗氧化功效[10–11]，所以開(kāi)展天然類胡蘿卜素的提取工藝研究很有必要。Dong等[12]從蛹蟲(chóng)草中提取出一類新的類胡蘿卜素，并指出這種類胡蘿卜素具有一定的水溶性，更易于機(jī)體吸收，這引發(fā)了天然類胡蘿卜素研究領(lǐng)域的又一次激烈討論。

常用類胡蘿卜素的提取方法包括溶劑萃取法、酶反應(yīng)法、微波提取法、超聲提取法以及超臨界流體萃取法等[13]。酶反應(yīng)法需要使用價(jià)格昂貴的酶，而超臨界流體萃取法需要專門的儀器設(shè)備，考慮到現(xiàn)有的設(shè)備條件以及試驗(yàn)成本，計(jì)劃采用溶劑萃取法，并在前人成果的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)不同的試驗(yàn)處理方法，提取蛹蟲(chóng)草類胡蘿卜素，對(duì)比提取得率，得出較好的提取方法并對(duì)該方法的提取條件進(jìn)行優(yōu)化，以提高提取得率，為蛹蟲(chóng)草類胡蘿卜素生物活性的研究及其產(chǎn)品開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蛹蟲(chóng)草子實(shí)體品種為‘cm–20’，由揚(yáng)州市農(nóng)科院輻照中心提供，常溫保存。β–類胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自Sigma公司。丙酮、氯仿、石油醚、2,6–二叔丁基對(duì)甲酚(BHT)等購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)，為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

LyoQUEST–55冷凍干燥機(jī)(德菲科學(xué)儀器有限公司)；FW80高速萬(wàn)能粉碎機(jī)(天津市泰斯特儀器有限公司)；KQ–500DE超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；EM720微波爐(美的集團(tuán))；FA2004萬(wàn)分天平(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司)；UV7502c紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海壘固儀器有限公司)；SpectraMax M5酶標(biāo)儀(美谷分子儀器有限公司)。

1.3 方法

由于類胡蘿卜素遇高溫、光照、氧氣環(huán)境易降解，故試驗(yàn)的所有操作都在弱光或無(wú)光條件下進(jìn)行。

1.3.1 蛹蟲(chóng)草粉末的制備

首先將所獲得的蛹蟲(chóng)草子實(shí)體置于冷凍干燥機(jī)內(nèi)進(jìn)行干燥，然后將凍干至恒重的蛹蟲(chóng)草子實(shí)體放入粉碎機(jī)中粉碎，過(guò)孔徑為0.25 mm 的篩，將過(guò)篩后的樣品放入錫箔紙包裹的廣口瓶中密封，保存于－30℃冰柜中。

1.3.2 β–胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)曲線方程的建立

稱取4.6mg β–胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品，加入2mL 氯仿，然后用石油醚定容至50mL。取定容好的石油醚溶液1mL 用丙酮定容至10mL，再分別取定容好的丙酮溶液0、0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0mL，用丙酮定容至2mL，用分光光度計(jì)在450 nm 處測(cè)吸光度值。以吸光度值為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)β–胡蘿卜素濃度為橫坐標(biāo)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出線性回歸方程為y=0.129x–0.09, R2=0.999 3，類胡蘿卜素含量計(jì)算公式：c=x·V/m。式中x 為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出的提取液中類胡蘿卜素含量(μg/mL)；V 為丙酮提取液體積(mL)；m 為稱取的粉末樣品質(zhì)量(g)。

1.3.3 不同提取方法試驗(yàn)

在溶劑萃取的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)不同的試驗(yàn)處理法，比較不同方法的提取效果，得出較好提取方法。具體如下：

1) 酸熱提取法。參考張志軍等[14]優(yōu)化的酸熱提取法(下稱“優(yōu)化法”)試驗(yàn)方案進(jìn)行蛹蟲(chóng)草類胡蘿卜素的提取：稱取0.200g蛹蟲(chóng)草粉末，按料液比1∶10 加入2 mol/L 鹽酸，浸泡40min，沸水浴4min，迅速冷卻，加入蒸餾水洗滌，3 000 r/min 離心10min，棄上清液，重復(fù)洗滌1次。加入15mL 丙酮和適量抗氧化劑，室溫下浸提30min，3 000 r/min離心10min，得上清液，即為類胡蘿卜素提取液，之后用相同體積丙酮清洗沉淀2次，合并收集上清液，重復(fù)3次。

2) 超聲提取法。稱取0.200g 蛹蟲(chóng)草粉末，加入15mL 丙酮和適量抗氧化劑，室溫下超聲處理30min(時(shí)刻監(jiān)控水溫，超聲功率300 W)，之后3 000 r/min 離心10min，得上清液，即為類胡蘿卜素提取液，之后用相同體積丙酮清洗沉淀2次，合并收集上清液，重復(fù)3次。

3) 酸熱超聲提取法。稱取0.200g 蛹蟲(chóng)草粉末，按料液比1∶10 加入2 mol/L 鹽酸，浸泡40min，沸水浴4min，迅速冷卻，加入蒸餾水洗滌，3 000 r/min 離心10min，棄上清液，重復(fù)洗滌1次。加入15mL 丙酮和適量抗氧化劑，室溫下超聲處理30min(時(shí)刻監(jiān)控水溫，超聲功率300 W)，之后3 000 r/min 離心10min，得上清液，即為類胡蘿卜素提取液。用相同體積的丙酮清洗沉淀2次，合并收集上清液，重復(fù)3次。

4) 微波提取法。稱取0.200g 蛹蟲(chóng)草粉末，加入15mL 丙酮和適量抗氧化劑，微波功率70 W 處理3min，室溫下浸提27min，3 000 r/min 離心10min，得上清液，即為類胡蘿卜素提取液。用相同體積的丙酮清洗沉淀2次，合并收集上清液，重復(fù)3次。

5) 酸熱微波提取法。稱取0.200g 蛹蟲(chóng)草粉末，加2 mol/L 鹽酸2mL，浸泡40min，沸水浴4min, 迅速冷卻，加入蒸餾水，3 000 r/min 離心10min，棄上清液，重復(fù)洗滌1次。加入15mL 丙酮和適量抗氧化劑，微波功率70 W 處理3min，室溫下浸提27min，3 000 r/min 離心10min，得上清液，即為類胡蘿卜素提取液。用相同體積丙酮清洗沉淀2次，合并收集上清液，重復(fù)3次。

6) 丙酮提取法。稱取0.200g 蛹蟲(chóng)草粉末，加入15mL 丙酮和適量抗氧化劑，研磨3min，室溫下浸提27min，3 000 r/min 離心10min，得上清液即為類胡蘿卜素提取液。用相同體積的丙酮清洗沉淀2次，合并收集上清液，重復(fù)3次。

分別取等量上述6 種方法提取得到的類胡蘿卜素丙酮溶液，并加等體積蒸餾水混勻，在酶標(biāo)儀上進(jìn)行光譜掃描，掃描波長(zhǎng)為400～600 nm，掃描間隔5 nm，得吸收光譜圖。

收集經(jīng)酸熱處理后的2次水洗液，在酶標(biāo)儀上進(jìn)行光譜掃描，掃描波長(zhǎng)范圍為400～600 nm，掃描間隔5 nm，得吸收光譜圖。

1.3.4 酸熱超聲提取法單因素試驗(yàn)

比較6 種不同提取方法的結(jié)果，得出酸熱超聲提取法為較好的提取方法。針對(duì)鹽酸濃度(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mol/L)，酸浸時(shí)間(20、30、40、50、60、70min)，沸水浴時(shí)間(3、5、7、9、11min)，超聲功率(250、300、350、400、450 W)，超聲溫度(10、20、30、40、50、60 )℃，超聲時(shí)間(10、20、30、40、50min)6個(gè)因素按1.3.3 中酸熱超聲提取法進(jìn)行單因素試驗(yàn)，以此來(lái)確定正交試驗(yàn)中因素的水平范圍。

1.3.5 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)方案并進(jìn)行正交試驗(yàn)，以確定最優(yōu)提取條件。

表1 正交試驗(yàn)因素及水平 Table 1 Orthogonal factor level table

1.3.6 驗(yàn)證性試驗(yàn)

分別以蛹蟲(chóng)草粉末和新鮮蛹蟲(chóng)草子實(shí)體為材料，按照正交試驗(yàn)結(jié)果中最佳提取工藝進(jìn)行試驗(yàn)，測(cè)定類胡蘿卜素的提取得率。

1.4 數(shù)據(jù)分析方法

采用Excel 2003進(jìn)行繪圖分析，利用SPSS16.0進(jìn)行一元線性相關(guān)分析及正交試驗(yàn)的方差分析和Duncan多重比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取方法提取蛹蟲(chóng)草類胡蘿卜素比較

酸熱提取法的平均得率為986.05μg/g，遠(yuǎn)沒(méi)有張志軍等以此法提取得到2 158μg/g的高。分析原因，可能是提取方法不適宜或者菌種及來(lái)源的不同所導(dǎo)致類胡蘿卜素提取得率的差別，因此，在提取本品種蛹蟲(chóng)草類胡蘿卜素時(shí)，有必要進(jìn)一步探究不同的處理方法并且優(yōu)化提取條件。

提取液掃描光譜如圖2所示，3條光譜曲線(E1、E2、E3)呈現(xiàn)明顯的三峰狀(三峰狀譜線為類胡蘿卜素特征譜線[14–16])，由此可知，酸熱提取法、酸熱超聲提取法以及酸熱微波提取法都能從蛹蟲(chóng)草中提取到類胡蘿卜素。蛹蟲(chóng)草類胡蘿卜素的最大吸收峰在450 nm處。E3(酸熱超聲提取法)所得蛹蟲(chóng)草類胡蘿卜素提取液的吸收值最大，所以酸熱超聲法是較好的提取方法。后3條譜線(E4、E5、E6)沒(méi)有明顯特征，這表明超聲提取法、微波提取法以及丙酮提取法不能明顯從蛹蟲(chóng)草中提取到類胡蘿卜素。

圖1 6 種不同方法所得丙酮提取液的光譜掃描圖譜 Fig.1 Spectrum chart of extracting solution from different extraction methods

收集酸熱處理后的水洗液在450 nm波長(zhǎng)下掃描，結(jié)果如圖2所示。2次水洗液的掃描曲線均未呈現(xiàn)特征圖譜，故認(rèn)為廢棄的水洗液中不含有類胡蘿卜素。

圖2 水洗液掃描光譜 Fig.2 Spectrum chart of water

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

從表2可以看出，隨著鹽酸濃度增加，蛹蟲(chóng)草類胡蘿卜素提取得率逐漸增加，當(dāng)鹽酸濃度為2.5 mol/L時(shí)，得率最高，為1 030.81μg/g，進(jìn)一步增加鹽酸濃度，得率迅速下降，確定較適宜的鹽酸濃度為2.5 mol/L。當(dāng)酸浸時(shí)間為30min時(shí)，蛹蟲(chóng)草類胡蘿卜素提取得率最高，為1 070.93μg/g，隨酸浸時(shí)間延長(zhǎng)，得率逐漸降低，確定較適宜的酸浸時(shí)間為30min。當(dāng)沸水浴時(shí)間為5min時(shí)，蛹蟲(chóng)草類胡蘿卜素提取得率達(dá)到最高，為1 090.12μg/g，水浴時(shí)間延長(zhǎng)，提取得率下降，確定較適宜的沸水浴時(shí)間為5min。超聲功率在250～350 W時(shí)，提取得率變化不大，當(dāng)功率達(dá)到400 W時(shí)，提取得率升至最高，為994.19μg/g，隨著超聲功率的增大，提取得率下降，確定較適宜的超聲功率為400 W。當(dāng)溫度為10℃時(shí)，由于溫度較低，類胡蘿卜素的溶解度不夠，所以得率較低。當(dāng)溫度提高到20℃時(shí)，提取得率最高，為1 161.63μg/g，之后隨超聲溫度升高，得率逐漸下降，當(dāng)溫度達(dá)到50℃時(shí)，得率下降明顯，確定較適宜的提取溫度為20℃。當(dāng)超聲時(shí)間為20min時(shí)，提取得率最高，為1 090.86μg/g，之后隨時(shí)間延長(zhǎng)，得率稍有降低，確定較適宜的超聲時(shí)間為20min。

表2 單因素試驗(yàn)結(jié)果 Table 2 Requirements and Results of Single Factor

表2 (續(xù))

綜上所述，確定鹽酸濃度梯度為2.25、2.50、2.75 mol/L，酸浸時(shí)間梯度為為25、30、35min，沸水浴時(shí)間梯度為4、5、6min，超聲功率梯度為350、400、450 W，超聲溫度梯度為15、20、25℃，超聲時(shí)間梯度為15、20、25min作為正交試驗(yàn)各因素的水平。

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

從表3和表4可知，6個(gè)試驗(yàn)因素中，鹽酸濃度、酸浸時(shí)間和超聲功率對(duì)提取得率的影響達(dá)到顯著水平，而沸水浴時(shí)間、超聲溫度和超聲時(shí)間對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；對(duì)提取得率大小的影響因素順序?yàn)槌暪β?、酸浸時(shí)間、鹽酸濃度、沸水浴時(shí)間、超聲溫度、超聲時(shí)間。Duncan多重比較分析結(jié)果表明，鹽酸濃度2.25 mol/L提取效果較好，酸浸時(shí)間30min和超聲功率400 W提取效果較好，沸水浴時(shí)間、超聲溫度和超聲時(shí)間的3個(gè)水平間無(wú)顯著差異，沸水浴時(shí)間6min和超聲時(shí)間25min提取效果較好，超聲溫度選擇25℃更利于試驗(yàn)操作，所以最優(yōu)水平組合為鹽酸濃度2.25 mol/L，酸浸時(shí)間30min，沸水浴時(shí)間6min，超聲功率400 W，超聲溫度25℃，超聲時(shí)間25min。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果 Table 3 The project of orthogonal test and the results of extraction

表3 (續(xù))

表4 方差分析結(jié)果 Table 4 The table of variance analysis

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

按照優(yōu)化后的提取條件，得到蛹蟲(chóng)草類胡蘿卜素的平均提取得率為1 105.53μg/g，新鮮子實(shí)體類胡蘿卜素平均提取得率為1 134.88μg/g。

3 討論與結(jié)論

蛹蟲(chóng)草屬于寄生真菌，表面覆蓋有堅(jiān)實(shí)細(xì)胞壁，用鹽酸處理可以使細(xì)胞壁中原來(lái)結(jié)構(gòu)緊密的某些成分(多糖和蛋白質(zhì)等)變得疏松，同時(shí)配合沸水浴處理以及快速冷卻處理，使細(xì)胞壁得以破壞，胞內(nèi)類胡蘿卜素才更容易釋放出來(lái)[17]。另外，在酸熱處理基礎(chǔ)上，利用超聲波產(chǎn)生的空化效應(yīng)使細(xì)胞內(nèi)形成空腔，使類胡蘿卜素更容易從細(xì)胞中釋放出來(lái)，而利用微波處理雖然也有利于胞內(nèi)類胡蘿卜素釋放，但提取效果不及超聲波處理的效果好。

提取過(guò)程中涉及到的各因素都會(huì)對(duì)類胡蘿卜素的提取得率產(chǎn)生影響。鹽酸浸泡配合沸水浴快速冷處理可以疏松蛹蟲(chóng)草子實(shí)體的細(xì)胞壁，便于類胡蘿卜素從胞內(nèi)釋放，但鹽酸濃度、酸浸時(shí)間以及沸水浴時(shí)間都需取值適當(dāng)，不可過(guò)長(zhǎng)，否則類胡蘿卜素一旦釋放出來(lái)后很快會(huì)被酸和熱破壞，導(dǎo)致提取得率下降。用超聲波處理酸浸后的蟲(chóng)草粉末將更有利于類胡蘿卜素的釋放，但同時(shí)也需要控制好超聲處理的功率、時(shí)間和水溫，恰當(dāng)?shù)乃釤崽幚砗统暡ㄕ袷幠茏畲蟪潭壬媳ＷC類胡蘿卜素在提取過(guò)程中的穩(wěn)定性。

蛹蟲(chóng)草收獲后，保藏條件如光照、濕度以及溫度等對(duì)類胡蘿卜素的穩(wěn)定性有一定影響，采用新鮮的蛹蟲(chóng)草子實(shí)體進(jìn)行試驗(yàn)?zāi)茏畲蟪潭壬咸崛〉礁嗟念惡}卜素。本試驗(yàn)中新鮮子實(shí)體的提取得率為1 134.88μg/g，低于張志軍、王陶[18]報(bào)道的蛹蟲(chóng)草類胡蘿卜素提取得率，原因可能是所使用的蛹蟲(chóng)草品種不同所致。針對(duì)這一問(wèn)題，未來(lái)可以通過(guò)菌種篩選以及采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)等手段選育蛹蟲(chóng)草品種，以提高蛹蟲(chóng)草類胡蘿卜素提取得率。

綜合整個(gè)試驗(yàn)結(jié)果，得出以下結(jié)論：

1) 酸熱超聲提取法為本品種蛹蟲(chóng)草類胡蘿卜素提取的較好方法。

2) 酸熱超聲提取法中對(duì)提取得率影響從大到小的因素依次為超聲功率、酸浸時(shí)間、鹽酸濃度、沸水浴時(shí)間、超聲溫度、超聲時(shí)間。

3) 優(yōu)化后的提取工藝為鹽酸濃度2.25 mol/L，酸浸時(shí)間30min，超聲功率400 W，沸水浴時(shí)間6min，超聲溫度25℃，超聲時(shí)間25min，新鮮蛹蟲(chóng)草類胡蘿卜素的提取得率達(dá)1 134.88μg/g。

[1] Zheng Peng，Xia Yongliang，Xiao Guohua，et al．Genome sequence of the insect pathogenic fungus Cordyceps militaris，a valued traditional Chinese medicine[EB/OL]. [2011–12–11]．http://genomebiology．com/2011/12/11/R116．

[2] Dong J Z，Ding J，Yu P Z，et al．Composition and distribution of the main active components in selenium-enriched fruit bodies of Cordyceps militaris link[J]．Food Chemistry，2013，137(1)：164–167．

[3] Dong J Z，Lei C，Ai X R，et al．Selenium enrichment on Cordyceps militaris link and analysis on its main active components[J]．Applied Biochemistry and Biotechnology, 2012，166(5)：1215–1224．

[4] 高峰，于亞莉，劉靜波，等．超聲波提取北冬蟲(chóng)夏草多糖的工藝[J]．食品研究與開(kāi)發(fā)，2010，31(6)：107–110．

[5] 郭濤，張龍，王兵，等．不同培養(yǎng)基培育蛹蟲(chóng)草中的蟲(chóng)草素和腺苷含量測(cè)定[J]．蠶業(yè)科學(xué)，2011，37(6)：1117–1122．

[6] 鄧?yán)?，韓濤，王曉虹，等．響應(yīng)面法優(yōu)化人工蛹蟲(chóng)草子實(shí)體中蟲(chóng)草酸微波提取工藝[J]．天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)，2013，25(9)：1249–1254．

[7] 姜建國(guó)，王飛，陳倩．類胡蘿卜素功效與生物技術(shù)[M]．北京．化學(xué)工業(yè)出版社，2008：3–5．

[8] 張曉斌，高仰哲．β–胡蘿卜素的應(yīng)用及研究進(jìn)展[J]．中國(guó)畜禽種業(yè)，2003(3)：22–24．

[9] Rock C L．Carotenoids：Biology and treatment[J]. Pharmacology & Therapeutics，1997，75(3)：185–197．

[10] Lu S，Li L．Carotenoid metabolism：Biosynthesis，regulation and beyond[J]．Journal of Integrative Plant Biology，2008，50(7)：778–785．

[11] Boeira S P，Del’Fabbro L，Roman S S，et al．Lycopene treatment prevents hematological，reproductive and histopathological damage induced by acute zearalenone administration in male swiss mice[J]．Experimental and Toxicologic Pathology，2014，66(4)：179–185．

[12] Dong J Z，Wang S H，Ai X R，et al．Composition and characterization of cordyxanthins from Cordyceps militaris fruit bodies[J]．Journal of Functional Foods，2013，5(3)：1450–1455．

[13] 姬小明，邵惠芳，劉金霞，等．類胡蘿卜素的提取及分離方法研究進(jìn)展[J]．河南科學(xué)，2008，26(11)：1337–1339．

[14] 張志軍，江曉路，牟海津，等．蛹蟲(chóng)草類胡蘿卜素提取工藝的研究[J]．食品科技，2007，32(4)：99–103．

[15] 孫軍德，曹婧．不同北蟲(chóng)草菌株產(chǎn)類胡蘿卜素分析[J]．微生物學(xué)雜志，2012，32(3)：95–97．

[16] 付鳴佳．蛹蟲(chóng)草產(chǎn)類胡蘿卜素的研究[J]．食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2005(5)：107–110．

[17] 王歲樓．紅酵母類胡蘿卜素高產(chǎn)菌株的篩選及其發(fā)酵生理學(xué)條件研究[J]．工業(yè)微生物，2001，31(1)：19–22．

[18] 王陶，李文，楊克．蛹蟲(chóng)草類胡蘿卜素的熱酸–超聲復(fù)合提取工藝的研究[J]．食品工業(yè)，2011(9)：54–58．