張 強，崔百明，鄭銀英，向本春

(石河子大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點實驗室，新疆 石河子 832003)

新疆加工番茄上南方番茄病毒外殼蛋白基因的克隆與原核表達

張 強，崔百明，鄭銀英，向本春

(石河子大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點實驗室，新疆 石河子 832003)

【目的】 克隆南方番茄病毒(STV)的外殼蛋白(CP)基因，構(gòu)建其原核表達載體并進行誘導(dǎo)表達，為制備檢測該病毒的高效價血清提供參考?！痉椒ā?利用一步法RT-PCR從新疆加工番茄上克隆STVCP基因，將其連接到原核表達載體pET-28a(+)上，獲得重組質(zhì)粒pET-28a-STV CP。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21后用IPTG進行誘導(dǎo)表達。【結(jié)果】 成功克隆了STVCP基因，其長度為1 134 bp。構(gòu)建了原核重組表達質(zhì)粒pET-28a-STV CP，其在1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)下，成功表達出分子質(zhì)量約47 ku的蛋白?！窘Y(jié)論】 成功克隆了STVCP基因，并誘導(dǎo)了pET-28a-STV CP重組蛋白的原核表達。

南方番茄病毒；外殼蛋白基因；原核表達

加工番茄屬于普通番茄的一種類型，在新疆有“紅色產(chǎn)業(yè)”之稱。近些年，隨著種植面積的逐年加大，加工番茄已成為新疆經(jīng)濟的支柱性產(chǎn)業(yè)之一，也是新疆經(jīng)濟增長速度最快的產(chǎn)業(yè)之一[1-2]。

加工番茄由于枝繁葉茂、種植密度大、品種抗病能力不一、栽培時間長、連作和重茬地增多等因素，導(dǎo)致其病毒病日趨嚴(yán)重。對加工番茄的病毒病進行調(diào)查發(fā)現(xiàn)，加工番茄病毒病類型主要有花葉型、蕨葉型、條斑型、巨芽型、卷葉型和黃頂型等。侵染加工番茄的主要病毒有黃瓜花葉病毒(Cucumbermosaicvirus，CMV)、番茄花葉病毒(Tomatomosaicvirus，ToMV)、馬鈴薯Y病毒(PotatovirusY,PVY)等。在2006-2010年，CMV在新疆北疆加工番茄上的檢出率為21.5%～83.2%；2009-2010年，ToMV、PVY在新疆北疆加工番茄上的檢出率分別為96.7%和24.8%，這些病毒對加工番茄品質(zhì)和產(chǎn)量產(chǎn)生了嚴(yán)重的影響，同時也造成了較大的經(jīng)濟損失[3-6]。

南方番茄病毒(Southerntomatovirus,STV)是最近報道的一種植物dsRNA病毒，其基因組全長為3 437 nt，在正義鏈上存在部分重疊的2個開放閱讀框(ORF)。雖然STV基因組結(jié)構(gòu)與整體病毒科(Totiviridae)病毒相同，但是兩者在氨基酸序列和二級結(jié)構(gòu)上存在很大差異。利用RNA依賴RNA聚合酶(RdRp)蛋白全序列及保守區(qū)進行聚類分析發(fā)現(xiàn)，STV與分體病毒科(Partitiviridae)病毒的親緣關(guān)系較整體病毒科病毒更近。因此，STV是一種與整體病毒科病毒和分體病毒科病毒均有親緣關(guān)系的植物病毒[7]。

2011年，新疆加工番茄出現(xiàn)STV感染植株。STV是嚴(yán)格種傳病毒，不能通過摩擦接種和嫁接等方式傳播，但可通過品種引進、品種培養(yǎng)和良種繁育等過程傳播[8]。因此，建立快速、準(zhǔn)確的病毒檢測方法是STV病害監(jiān)控和防治的關(guān)鍵。病毒特異性抗血清的制備和應(yīng)用是目前病毒檢測最有效的手段之一[9-11]。因此，本研究克隆了STV 外殼蛋白(Coat protein,CP)基因，構(gòu)建其原核表達載體，并進行誘導(dǎo)表達，以期為制備該病毒檢測所需高效價抗血清提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 加工番茄樣品 于2012-08，自新疆石河子蔬菜花卉研究所隨機采集加工番茄，樣品編號為S3-13。

1.1.2 菌株與質(zhì)粒 大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α、BL21及表達載體pET-28a(+)，由石河子大學(xué)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點實驗室319室保存?？寺≥d體pGEM-T Easy Vector，購于Promega公司。

1.1.3 酶與試劑 限制性內(nèi)切酶NcoⅠ、BamHⅠ，購自Fermentas公司；TaqDNA Polymer-ase，購自Roche公司；T4 DNA連接酶、PCR產(chǎn)物凝膠回收試劑盒，購自Promega公司；質(zhì)粒提取試劑盒，購自GENOMED公司；胰蛋白胨、酵母提取物等，購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；Agarose-Molecular Biology Grade，購自Invitrogen公司。

1.2 方 法

1.2.1 引物的設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank上的STV全序列(GenBank登錄號：EF442780)設(shè)計引物，上游引物5′-CATGCCATGGCTGGTGTCGGAGGTT-3′(下劃線部分為NcoⅠ酶切位點)；下游引物5′-CGCGGATCCACCTCTATCCTTGCGTTGGG-3′(下劃線部分為BamHⅠ酶切位點)。引物預(yù)期擴增片段長度為1 134 bp，由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。

1.2.2 總RNA的提取 使用Invitrogen公司TRIZOL Reagent提取加工番茄葉片的總RNA。取適量新鮮葉片于1.5 mL離心管中，加入400 μL TRIZOL，用研磨棒充分研磨，室溫放置5 min，加入80 μL氯仿，振蕩20 s，靜置2～3 min，4 ℃、12 000 r/min離心15 min。取100 μL上清，加入等體積異丙醇，混勻，靜置10 min，4 ℃、12 000 r/min離心10 min。棄上清，加入500 μL 體積分?jǐn)?shù)75%的無水乙醇，混勻，4 ℃、12 000 r/min離心5 min，棄上清并收集沉淀，加入20 μL DEPC水，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3CP基因的克隆 使用Invitrogen公司SuperScript?Ⅲ One-Step RT-PCR System with Platinum?TaqDNA Polymerase進行一步法RT-PCR擴增。反應(yīng)體系如下：總RNA 1 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，5 mmol/L MgSO40.8 μL，2×Reaction Mix 5 μL，SuperScript?Ⅲ RT/PlatinumTaqMix 0.2 μL，用ddH2O補充至10 μL。試驗同時設(shè)立陰性對照，以ddH2O代替模板進行擴增。反應(yīng)條件為：55 ℃ 15 min，94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s， 59 ℃ 30 s，68 ℃ 90 s，40個循環(huán)；68 ℃ 5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳和EB染色后在凝膠成像儀上觀察結(jié)果。使用PCR產(chǎn)物凝膠回收試劑盒回收純化PCR產(chǎn)物，與pGEM-T Easy Vector載體相連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEM-T Easy-STV CP并轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，利用藍白斑試驗篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒，經(jīng)NcoⅠ和BamHⅠ雙酶切鑒定后，送北京六合華大基因科技股份有限公司測序。質(zhì)粒測序后，將本研究的CP與NCBI上已公布的STV相關(guān)序列進行BLAST比對分析。

1.2.4 原核表達載體的構(gòu)建 用限制性內(nèi)切酶NcoⅠ和BamHⅠ雙酶切陽性重組質(zhì)粒pGEM-T Easy-STV CP，與經(jīng)同樣雙酶切的原核表達載體pET-28a(+)連接，獲得重組質(zhì)粒pET-28a-STV CP，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，利用藍白斑試驗篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒，進行NcoⅠ和BamH Ⅰ雙酶切鑒定。

1.2.5CP基因的誘導(dǎo)表達 將重組質(zhì)粒pET-28a-STV CP轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，挑取陽性克隆接種于含50 μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃過夜活化，1∶100(體積比)稀釋到5 mL含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、250 r/min培養(yǎng)3 h，加IPTG至終濃度為1 mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)6 h，分別于2，4，6 h取樣并離心收集菌體，加適量的PBS裂解液振蕩懸浮，再加等體積5×SDS上樣緩沖液，100 ℃煮沸8 min，SDS-PAGE電泳檢測CP的表達情況。試驗同時設(shè)未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的pET-28a(+)載體、經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的pET-28a(+)載體、未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的pET-28a-STV CP重組質(zhì)粒為對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 STV CP基因的克隆與序列分析

提取的總RNA經(jīng)電泳檢測，出現(xiàn)3條帶，其中28S和18S條帶較亮，5S條帶較弱，但可以用來進行后續(xù)試驗。一步法RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示，樣品在1 134 bp處擴增出明顯條帶(圖1)，長度與預(yù)期擴增結(jié)果相符，而去離子水陰性對照沒有擴增出相應(yīng)的片段。

圖1 STVCP基因的一步法RT-PCR擴增
M.DNA Marker DL2000；1.陰性對照；2.CP基因一步法RT-PCR擴增產(chǎn)物
Fig.1 One-Step RT-PCR amplification of STVCP
M.DNA Marker DL2000；1.Negative control；2.Product of STVCPgene

將回收后的STVCP與pGEM-T Easy Vector連接，轉(zhuǎn)化篩選獲得陽性克隆pGEM-T Easy-STV CP。本研究的CP與NCBI上已公布的STV相關(guān)序列分析結(jié)果顯示，序列同源性均在99%以上。

2.2 STV CP基因表達載體的鑒定

重組質(zhì)粒pGEM-T Easy-STV CP用NcoⅠ/BamHⅠ雙酶切，回收目的片段，定向插入到NcoⅠ/BamHⅠ雙酶切的pET-28a(+)中，轉(zhuǎn)化篩選獲得重組質(zhì)粒pET-28a-STV CP。對重組質(zhì)粒pET-28a-STV CP進行NcoⅠ/BamHⅠ雙酶切鑒定，結(jié)果酶切出現(xiàn)約1 134 bp的目的片段(圖2)，表明STVCP基因已連接至pET-28a(+)原核表達載體上。

圖2 重組質(zhì)粒pET-28a-STV CP的酶切鑒定
M.DNA MarkerⅢ；1.pET-28a-STV CP重組質(zhì)粒；2.pET-28a-STV CP重組質(zhì)粒的NcoⅠ和BamHⅠ雙酶切產(chǎn)物
Fig.2 Enzyme digestion of pET-28a-STV CP withNcoⅠ/BamHⅠ
M.DNA MarkerⅢ；1.pET-28a-STV CP；2.Digestion of pET-28a-STV CP withNcoⅠ/BamHⅠ

2.3 pET-28a-STV CP在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達

取表達產(chǎn)物進行SDS-PAGE電泳分析，發(fā)現(xiàn)IPTG誘導(dǎo)后泳道中出現(xiàn)1條非常明顯的蛋白帶，其分子質(zhì)量約為47 ku，與預(yù)期融合蛋白大小相符，且隨著誘導(dǎo)時間的延長，蛋白表達量逐漸增加(圖3)。

3 討 論

在我國，加工番茄的栽培主要集中在新疆，并逐漸發(fā)展到內(nèi)蒙古、甘肅、寧夏等地區(qū)，推動了這些地區(qū)的經(jīng)濟發(fā)展。由于病毒病的普遍發(fā)生，加工番茄的品質(zhì)和產(chǎn)量受到了嚴(yán)重影響。因此，病毒病的檢測對于預(yù)防和控制病毒病具有非常重要的意義。目前，植物病毒的檢測主要有生物學(xué)、血清學(xué)和分子生物學(xué)等方法。其中，血清學(xué)方法因具有快速簡便、靈敏度高、檢測樣品多等優(yōu)點，而成為應(yīng)用最為廣泛的植物病毒檢測技術(shù)之一[12-14]。

圖3 pET-28a-STV CP表達產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳
M.低分子質(zhì)量蛋白Marker；1.未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的pET-28a(+)載體；2.經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的pET-28a(+)載體；3.未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的pET-28a-STV CP重組質(zhì)粒；4～6.分別為1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)2，4，6 h的 pET-28a-STV CP 重組質(zhì)粒
Fig.3 SDS-PAGE analysis of expression products
M.Low molecular protein Marker；1.pET-28a(+), uninduced；2.Induced pET-28a(+)；3.pET-28a-STV CP, uninduced；4-6.Proteins of pET-28a-STV CP induced by IPTG at 2,4 and 6 h,respectively

STV作為一種新近發(fā)現(xiàn)的植物病毒，其在番茄上的致病癥狀尚不明確。盡管有STV與番茄的退綠、黃化、衰退、果實小等癥狀相關(guān)的報道[15]，但是還未證實其直接相關(guān)性。因此，目前對STV的檢測主要依賴于分子生物學(xué)方法。另外，由于現(xiàn)在尚未分離觀察到STV病毒粒子，所以不能采用以純化病毒粒子或病毒粗提液作為抗原免疫動物的傳統(tǒng)方法來制備其血清學(xué)檢測所需的抗體[16]。

相比之下，克隆病毒的一段基因并進行表達，以表達產(chǎn)物作為抗原制備抗體，克服了傳統(tǒng)方法的各種困難，其表現(xiàn)出的特有優(yōu)勢也極大地促進了以免疫學(xué)為基礎(chǔ)的病毒檢測技術(shù)在病毒監(jiān)控和防治中的應(yīng)用。大腸桿菌表達體系是植物病毒界表達蛋白最常用的表達系統(tǒng)，它具有成本低、周期短、產(chǎn)量高、表達穩(wěn)定等特點。因此，本研究采用在大腸桿菌中克隆表達重組蛋白功能最強大的pET系統(tǒng)來進行STVCP基因的原核表達，這可使外源蛋白C端與載體上的6個組氨酸相融合，以方便、快捷地通過His Bind柱提取獲得融合蛋白。與切膠回收獲得目的蛋白的方法相比，該方法所獲目的蛋白可縮短后續(xù)試驗抗血清制備過程，且減少了反復(fù)SDS-PAGE電泳對蛋白空間結(jié)構(gòu)的破壞[17-18]。

本研究克隆了南方番茄病毒的CP基因，構(gòu)建了其原核表達載體，并成功地進行了誘導(dǎo)表達，這為進一步制備STV特異性抗血清和建立間接ELISA檢測方法提供了材料，為快速、準(zhǔn)確調(diào)查STV在新疆等地區(qū)的分布、危害情況及加工番茄產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展具有積極的促進作用。

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Cloning and prokaryotic expression of coat protein gene of Southern tomato virus from processing tomato in Xinjiang

ZHANG Qiang,CUI Bai-ming,ZHENG Yin-ying,XIANG Ben-chun

(CollegeofLifeScience,KeyLaboratoryofAgricultureBiotechnology,ShiheziUniversity,Shihezi,Xinjiang832003,China)

【Objective】 This paper aimed to clone the coat protein (CP) gene ofSoutherntomatovirus(STV),and construct and express its prokaryotic expression vector,providing reference for preparation and detection of high titer serum of the virus.【Method】 The STVCPgene was cloned by One-Step RT-PCR and connected with pET-28a(+) to obtain pET-28a-STV CP.Then the recombinant plasmid was transformed intoE.coliBL21 and induced by IPTG.【Result】 The STVCPgene was cloned successfully with the size of 1 134 bp and prokaryotic expression vector pET-28a-STV CP was also constructed.TheCPprotein with molecular weight of 47 ku was highly expressed after being induced by 1 mmol/L IPTG.【Conclusion】 STVCPgene was successfully cloned,and the expression of recombinant protein was induced successfully.

Southern tomato virus;coat protein gene;prokaryotic expression

2013-11-28

國家自然科學(xué)基金項目(31260420)；國際科技合作與交流專項(20072072)

張 強(1985-)，男，陜西蒲城人，在讀碩士，主要從事植物病毒學(xué)研究。E-mail：zhangqiang1047@126.com

鄭銀英(1975-)，女，吉林延邊人，副教授，主要從事植物病毒學(xué)研究。E-mail：zyycbm@sina.cn

時間:2015-03-12 14:17

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.04.001

S432.41

A

1671-9387(2015)04-0118-05

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150312.1417.001.html