王薇薇，羊杏平，范淑英，劉 廣,張 曼，徐錦華

(1 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蔬菜研究所,江蘇 南京 210014；2 江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，江西 南昌 330045)

甜瓜小孢子發(fā)育時(shí)期與花器形態(tài)的關(guān)系

王薇薇1,2，羊杏平1，范淑英2，劉 廣1,張 曼1，徐錦華1

(1 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蔬菜研究所,江蘇 南京 210014；2 江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，江西 南昌 330045)

【目的】 研究各發(fā)育時(shí)期甜瓜小孢子的細(xì)胞學(xué)特征及其與花器外觀形態(tài)的關(guān)系，以期能根據(jù)花器的外觀形態(tài)確定小孢子的發(fā)育階段，為花藥、小孢子培養(yǎng)研究提供細(xì)胞學(xué)依據(jù)?！痉椒ā?采集不同蕾長(zhǎng)的飽滿(mǎn)雄花花蕾，形態(tài)學(xué)觀察后分別進(jìn)行DAPI和醋酸洋紅染色，觀察小孢子發(fā)育的細(xì)胞學(xué)特征，以確定花粉的發(fā)育時(shí)期，分析各發(fā)育時(shí)期甜瓜小孢子的細(xì)胞學(xué)特征與花器外觀形態(tài)的關(guān)系?！窘Y(jié)果】 2種染色方法以醋酸洋紅染液染色效果較佳；甜瓜小孢子發(fā)育經(jīng)歷四分體時(shí)期、單核早中期、單核靠邊期和雙核期，每個(gè)時(shí)期形態(tài)特征明顯；甜瓜小孢子發(fā)育時(shí)期與花蕾的大小、花藥顏色密切相關(guān)。甜瓜花蕾縱徑在2.9～3.5 mm、橫徑在2.7～3.2 mm，且花瓣微露，花藥呈黃色時(shí)，絕大多數(shù)的小孢子發(fā)育至單核靠邊期?！窘Y(jié)論】 可以根據(jù)甜瓜花蕾的形態(tài)、大小和花藥發(fā)育情況判斷小孢子的發(fā)育時(shí)期，從而確定小孢子最佳培養(yǎng)時(shí)期對(duì)應(yīng)的選蕾標(biāo)準(zhǔn)。

甜瓜；小孢子；發(fā)育時(shí)期；花器形態(tài)

甜瓜(CucumismeloL.,2n=2x=24)別名香瓜、哈密瓜或果瓜，是葫蘆科甜瓜屬1年生蔓性草本植物[1]。甜瓜原產(chǎn)于非洲熱帶沙漠地區(qū)，大約在北魏時(shí)期隨著西瓜一同傳到中國(guó)，明朝開(kāi)始廣泛種植。甜瓜含糖量高(10%～18%，甚至高達(dá)20%)，果實(shí)香甜，富含礦物質(zhì)(鈣、磷、鐵等)和維生素，與西瓜一起成為人們喜愛(ài)的夏季水果。作為一種重要的瓜類(lèi)經(jīng)濟(jì)作物，甜瓜為世界十大重要水果之一[2]，栽培面積和產(chǎn)量較大。自20世紀(jì)80年代以來(lái)，我國(guó)甜瓜的栽培面積和產(chǎn)量一直居于世界第一[3]。由于甜瓜是異花授粉植物,天然雜交率高,因此采用常規(guī)育種手段獲得純系具有周期長(zhǎng)、難度大、遺傳性狀不穩(wěn)定等缺點(diǎn)，而利用單倍體技術(shù)育種就可以避免這些問(wèn)題，大大提高育種效率。

單倍體育種技術(shù)是指通過(guò)誘發(fā)單性生殖使某些品種的異質(zhì)配子發(fā)育成單倍體植株，再經(jīng)過(guò)染色體加倍獲得純系，之后進(jìn)行品種選育的一種育種方法[4-5]。這種技術(shù)能夠縮短育種年限、提高育種效率[6]。但自然界中，作物自發(fā)產(chǎn)生單倍體植株的幾率極低，不過(guò)通過(guò)一些人為手段可獲得單倍體，如花藥或游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)。迄今為止，甜瓜中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)自發(fā)產(chǎn)生的單倍體植株[7]，所以甜瓜花培技術(shù)就成為獲得甜瓜單倍體植株的重要途徑。在花藥或游離小孢子培養(yǎng)過(guò)程中,影響誘導(dǎo)的主要因素包括基因型、小孢子發(fā)育時(shí)期、培養(yǎng)基、培養(yǎng)方法等，其中小孢子發(fā)育時(shí)期是單倍體誘導(dǎo)至關(guān)重要的內(nèi)在因素[8]。不同植物種類(lèi)誘導(dǎo)愈傷組織形成或胚狀體發(fā)生的適宜小孢子發(fā)育時(shí)期是不同的，并不是任何發(fā)育時(shí)期的小孢子都可以培養(yǎng)形成愈傷組織或胚狀體，多數(shù)物種誘導(dǎo)胚胎發(fā)生的最佳小孢子發(fā)育時(shí)期是單核靠邊期[9-11]。董艷榮[12]指出，甜瓜花藥培養(yǎng)最佳時(shí)期是單核靠邊期至雙核期。因此小孢子最佳發(fā)育時(shí)期鑒定是花藥或小孢子培養(yǎng)成功的關(guān)鍵因素和必要條件。利用顯微鏡染色檢測(cè)的方法能夠直接觀察小孢子的發(fā)育時(shí)期，以往的很多研究表明，小孢子發(fā)育階段與花器形態(tài)密切相關(guān)[13-15]，可以通過(guò)花蕾的縱橫徑、花藥顏色、花瓣與萼片長(zhǎng)度比值等判斷小孢子的發(fā)育時(shí)期，但有關(guān)甜瓜花器外部形態(tài)與小孢子發(fā)育階段關(guān)系的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。為此，本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)甜瓜小孢子發(fā)育時(shí)期的細(xì)胞學(xué)觀察，研究甜瓜小孢子各發(fā)育時(shí)期的細(xì)胞學(xué)特征以及不同發(fā)育時(shí)期與花器外觀形態(tài)的相關(guān)性，以便能根據(jù)花器的外觀形態(tài)確定小孢子的發(fā)育階段，為甜瓜花藥或小孢子培養(yǎng)提供簡(jiǎn)單易行的小孢子發(fā)育時(shí)期鑒定方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試甜瓜品種為長(zhǎng)香玉、伊麗莎白、楚留香，3種供試材料均為厚皮甜瓜，其中長(zhǎng)香玉和楚留香購(gòu)于農(nóng)友種苗有限公司，伊麗莎白購(gòu)于上?；莺头N業(yè)有限公司。2013-03播種于江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所大棚，常規(guī)管理。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 花蕾的形態(tài)學(xué)觀察 當(dāng)甜瓜進(jìn)入初花期后，于晴朗天氣(08:00-10:00)摘取健壯植株上不同蕾長(zhǎng)的飽滿(mǎn)雄花花蕾，放于冰盒中帶回實(shí)驗(yàn)室鏡檢觀察。觀察前先測(cè)量花蕾的縱徑、橫徑長(zhǎng)度，觀察花蕾的外部形態(tài)并描繪相應(yīng)的特征。再用眼科鑷子剝?nèi)ポ嗥?，取出并觀察花藥特征。每個(gè)發(fā)育時(shí)期觀察15個(gè)花蕾，重復(fù)3次。

1.2.2 小孢子發(fā)育的細(xì)胞學(xué)觀察 進(jìn)行過(guò)形態(tài)學(xué)觀察的花蕾花藥用卡諾氏固定液(冰醋酸與無(wú)水乙醇的體積比為1∶3)固定12 h或過(guò)夜，然后用1 mol/L鹽酸浸泡1 h(存放在保溫箱，溫度40 ℃)，之后用蒸餾水浸洗2～3次，每次10～15 min，然后裝片、擠壓，輕輕掀動(dòng)蓋玻片，沿縫隙加1滴染液。將大小相同花蕾分為2組，一組用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)熒光染液染色，熒光鏡下觀察；另一組用醋酸洋紅染液染色，光學(xué)顯微鏡下觀察。每次觀察重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 2種染液染色效果的比較

伊麗莎白小孢子各發(fā)育階段的細(xì)胞學(xué)特征見(jiàn)圖1。圖1表明，當(dāng)甜瓜花粉母細(xì)胞經(jīng)減數(shù)分裂形成四分體時(shí)，用DAPI熒光染液染色效果最佳，此時(shí)細(xì)胞核在熒光下清晰可見(jiàn)，但不能看出細(xì)胞輪廓；單核期時(shí)，小孢子的輪廓明顯，但細(xì)胞核清晰度下降；雙核期時(shí)，基本看不出細(xì)胞核；隨著細(xì)胞的不斷發(fā)育，DAPI熒光染液的染核效果明顯下降，這可能是由于隨著小孢子的進(jìn)一步發(fā)育，花粉壁上的孢粉素增加，折光力太強(qiáng)，導(dǎo)致整個(gè)細(xì)胞呈藍(lán)色。相比而言，醋酸洋紅染液的染色效果較DAPI熒光染液染色效果好，能將細(xì)胞質(zhì)染成紅色，細(xì)胞核染成深紅色，細(xì)胞輪廓、細(xì)胞核清晰。另外2個(gè)甜瓜品種小孢子各發(fā)育階段的細(xì)胞學(xué)特征與伊麗莎白一致。

圖1 甜瓜(伊麗莎白)小孢子各發(fā)育階段的細(xì)胞學(xué)特征(×400)
Ⅰ～Ⅳ．DAPI染色; Ⅴ～Ⅷ．醋酸洋紅染色;Ⅰ,Ⅴ.四分體時(shí)期;Ⅱ,Ⅵ．單核早中期;Ⅲ,Ⅶ．單核靠邊期;Ⅳ,Ⅷ．雙核期
Fig.1 Morphological characteristics of Elizabeth flower buds at various stages of microspore development(×400)
Ⅰ-Ⅳ.Stained using DAPI;Ⅴ-Ⅷ．Stained using carmine acetate;Ⅰ,Ⅴ．Tetrad; Ⅱ,Ⅶ．Early-or mid-uninucleate;Ⅲ,Ⅶ．Late-uninucleate; Ⅳ,Ⅷ．Binucleate

2.2 甜瓜小孢子各發(fā)育階段的細(xì)胞學(xué)特征

根據(jù)對(duì)3個(gè)甜瓜品種、不同大小花蕾小孢子發(fā)育時(shí)期的觀察發(fā)現(xiàn)，隨著花藥的發(fā)育，甜瓜花粉母細(xì)胞經(jīng)過(guò)減數(shù)分裂形成的四分體小孢子被一層厚的胼胝質(zhì)包圍著，由于胼胝質(zhì)壁不易染色而成為透明壁，易于分辨(圖1-Ⅴ)。隨后，包裹在四分體周?chē)碾蓦召|(zhì)溶解消失，小孢子從中游離出來(lái)，成為單核花粉粒，此時(shí)細(xì)胞體積小，花粉絨氈層無(wú)退化現(xiàn)象，也無(wú)明顯液泡，而后單核花粉粒的細(xì)胞核居于細(xì)胞正中位置，即為單核早中期(圖1-Ⅵ)。 隨著小孢子不斷從絨氈層細(xì)胞中吸取營(yíng)養(yǎng)，細(xì)胞體積逐漸增大，花粉絨氈層開(kāi)始退化，中央大液泡逐漸形成，將細(xì)胞核從中心擠壓到細(xì)胞壁一側(cè)，細(xì)胞壁上出現(xiàn)3條明顯的萌發(fā)溝，花粉外壁已經(jīng)形成(圖1-Ⅶ)?；ǚ奂?xì)胞在進(jìn)行第1次有絲分裂后，形成具有1個(gè)營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞和1個(gè)生殖細(xì)胞的二核花粉。營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞的體積大，靠近大液泡；生殖細(xì)胞體積小，貼近花粉壁。成熟的花粉粒近圓形，萌發(fā)溝外凸，但不明顯(圖1-Ⅷ)。

2.3 甜瓜小孢子發(fā)育時(shí)期與花蕾外部形態(tài)的關(guān)系

通過(guò)觀察甜瓜花蕾外部形態(tài)特征可知，在剛可見(jiàn)花蕾時(shí)，花蕾緊貼葉腋處，整個(gè)花蕾由萼片包被，花萼未張開(kāi)，萼片上著生濃密的白色絨毛，此時(shí)的花蕾干癟。當(dāng)小孢子處于四分體時(shí)期，花蕾稍增大些，相對(duì)飽滿(mǎn)，但花蕾仍完全被萼片緊包，此時(shí)花蕾呈淺綠色，有白色絨毛；當(dāng)小孢子發(fā)育至單核早中期時(shí)，花蕾中部已明顯膨大，萼片張開(kāi)，花萼綠色，花萼上的絨毛變稀疏，單核靠邊期時(shí)，花瓣微露；當(dāng)小孢子發(fā)育至雙核期，花蕾充分膨大，萼片完全張開(kāi)，花瓣外露，呈黃色，花瓣長(zhǎng)于花萼，花蕾似鐘形。

2.4 甜瓜小孢子發(fā)育時(shí)期與花蕾大小的關(guān)系

甜瓜小孢子的發(fā)育時(shí)期與其花蕾大小有密切關(guān)系。隨著花蕾縱徑、橫徑的增長(zhǎng)，小孢子由四分體時(shí)期向單核期、雙核期發(fā)育(圖2)。由表1可見(jiàn)，花粉母細(xì)胞處于四分體時(shí)期，花蕾的縱徑在1.4～2.0 mm，橫徑在1.6～2.2 mm；發(fā)育到單核早中期時(shí)，花蕾縱徑在2.0～2.4 mm，橫徑在2.1～2.5 mm；單核靠邊期，縱徑在2.9～3.5 mm，橫徑在2.7～3.2 mm；雙核期時(shí)，縱徑在3.8～4.3 mm，橫徑在3.5～3.9 mm。

2.5 甜瓜小孢子發(fā)育時(shí)期與花藥發(fā)育特征的關(guān)系

小孢子的發(fā)育時(shí)期與花藥發(fā)育有密切關(guān)系。甜瓜雄蕊共5枚，其中4枚兩兩合生，另1枚單生。四分體時(shí)期，花藥呈黃綠色，此時(shí)花藥不飽滿(mǎn)，難以剝開(kāi)；單核早中期，花藥顏色略深，較之前四分體時(shí)期飽滿(mǎn)；單核靠邊期，花藥顏色變黃，比較飽滿(mǎn)，苞片易剝除；雙核期，花藥顏色深黃，飽滿(mǎn)。

圖2 甜瓜花蕾的大小Fig.2 Sizes of buds of melon

2.6 甜瓜小孢子發(fā)育時(shí)期的不同步性

李丹等[16]認(rèn)為，百日草同一花蕾小孢子發(fā)育也存在不同步性。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，同一花蕾的甜瓜小孢子發(fā)育存在一定程度的漸續(xù)性(即不同步性)，相同的花藥內(nèi)往往包含著幾個(gè)發(fā)育時(shí)期的小孢子，如伊麗莎白的同一花蕾中約有90%的小孢子發(fā)育至單核靠邊期，10%的小孢子處于單核早中期、雙核期或是發(fā)育成熟(圖3)。

圖3 甜瓜(伊麗莎白)小孢子發(fā)育時(shí)期的不同步性(×400)
A．單核早中期小孢子;B．單核靠邊期小孢子;C．雙核期小孢子；D.成熟小孢子
Fig.3 Asynchronism of microspore development in Elizabeth (×400)
A．Early-or mid-uninucleate microspore;B．Late-uninucleate microspore;C．Binucleate microspore;D.Mature microspore

3 討論與結(jié)論

選擇最佳的花粉發(fā)育時(shí)期對(duì)花藥和小孢子培養(yǎng)至關(guān)重要。本試驗(yàn)對(duì)不同發(fā)育時(shí)期甜瓜小孢子進(jìn)行染色鑒定，觀察分析了不同發(fā)育時(shí)期甜瓜小孢子的細(xì)胞學(xué)形態(tài)特征及其與花蕾外觀形態(tài)的關(guān)系。本試驗(yàn)分別采用醋酸洋紅染料和DAPI熒光染色液進(jìn)行染色,觀察甜瓜小孢子的發(fā)育時(shí)期，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2種染液的染色效果都不是很好，DAPI染液在四分體時(shí)期和單核早中期染色效果很好，細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)區(qū)分明顯，但是隨著小孢子進(jìn)一步發(fā)育增大，小孢子壁逐漸變厚，小孢子外壁致密的孢粉素折光力增強(qiáng)，導(dǎo)致熒光下整個(gè)細(xì)胞都呈亮藍(lán)色，很難明顯觀察到細(xì)胞核，從而影響DAPI熒光染液的染色效果。而經(jīng)醋酸洋紅染液染色后，小孢子各發(fā)育時(shí)期的染色效果并沒(méi)有隨著小孢子的發(fā)育增大而變差，可以使細(xì)胞核染色較深，細(xì)胞質(zhì)染色較淺，易于區(qū)分。

本研究觀察到甜瓜花粉小孢子發(fā)育經(jīng)歷四分體時(shí)期、單核期、雙核期，各個(gè)時(shí)期都有明顯特征，并且小孢子各發(fā)育時(shí)期與花蕾的外部形態(tài)、花藥外觀關(guān)系密切。因此可以根據(jù)花蕾的形態(tài)、大小和花藥的發(fā)育情況來(lái)判斷甜瓜小孢子的發(fā)育時(shí)期。甜瓜最適花藥培養(yǎng)的時(shí)期是單核靠邊期至雙核期[12]，但是成功誘導(dǎo)甜瓜小孢子的例子國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道，甜瓜小孢子培養(yǎng)時(shí)花粉小孢子最易誘導(dǎo)胚狀體發(fā)生的最佳時(shí)期尚不明確。根據(jù)前人在其他物種上的研究可知，處于單核靠邊期的花粉小孢子易于誘導(dǎo)胚狀體發(fā)生[11]。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)3個(gè)不同甜瓜品種進(jìn)行比較觀察，得出甜瓜品種的花蕾縱徑為2.9～3.5 mm，橫徑為2.7～3.2 mm，花蕾膨大,萼片張開(kāi),花瓣微露,花藥飽滿(mǎn)呈黃色，此時(shí)絕大多數(shù)的小孢子發(fā)育至單核靠邊期。依據(jù)該試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行甜瓜花藥或小孢子培養(yǎng)，可以直接根據(jù)花蕾的形態(tài)、大小和花藥的發(fā)育情況來(lái)判斷甜瓜小孢子的發(fā)育時(shí)期，從而在實(shí)際操作中可以實(shí)現(xiàn)在田間直接取材，免去制片觀察等一系列繁瑣工作。

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Correlation between microspore development period and floral organ morphology ofCucumismeloL.

WANG Wei-wei1,2,YANG Xing-ping1,FAN Shu-ying2,LIU Guang1,ZHANG Man1,XU Jin-hua1

(1InstituteofVegetableCrops,JiangsuAcademyofAgriculturalSciences,Nanjing,Jiangsu210014,China;2CollegeofAgriculture,JiangxiAgriculturalUniversity,Nanchang,Jiangxi330045,China)

【Objective】 The cytology characteristics of melon microspore and morphology of flower organ were observed in different development periods for determining the relationship between microspore development and buds morphology,which would provide evidence for culturing of anther and microspore.【Method】 Full male flower buds with different lengths were collected and DAPI and carmine acetate staining methods were used in cytological observation of melon microspore development to confirm the pollen development periods after morphological observation.The relationship between cytological characteristics of different development periods of melon microspore and morphology of flower organ was also analyzed.【Result】 Carmine acetate dyeing had better dyeing effects.The development of melon microspore was divided to four stages:tetrad,early-or mid-uninucleate,late-uninucleate,and binucleate,and each stage had obvious characteristics.The microspore development period of melon was closely related with bud size and anther color.The buds were 2.9-3.5 mm in height and 2.7-3.2 mm in diameter.The petals were calyx slightly and the anthers were yellow.Most microspores could develop to the stage of late-uninucleate.【Conclusion】 The development period of melon microspore could be determined by the form,size and anther development condition of buds,and it is helpful to obtain the standard of bud selection at the best development stage of microspore.

melon;microspore;development stage;floral organ morphology

2013-11-11

國(guó)家西甜瓜產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目(CARS-NO.8)

王薇薇(1988-)，女，江蘇阜寧人，在讀碩士，主要從事蔬菜育種工作。E-mail:biluoweiwei@163.com

羊杏平(1963-)，男，江蘇泰興人，研究員，博士，主要從事西瓜甜瓜育種研究。

時(shí)間:2015-03-12 14:17

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.04.027

S652

A

1671-9387(2015)04-0108-05

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150312.1417.027.html