夏敏媛，張瑜Δ，沈小林，秦軍，繆軼君，談獻(xiàn)和

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 南京 210023；2.江蘇蘇中藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，江蘇 姜堰 225500)

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黃蜀葵莖枯病病原菌的分離與鑒定

夏敏媛1，張瑜1Δ，沈小林2，秦軍2，繆軼君1，談獻(xiàn)和1

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 南京 210023；2.江蘇蘇中藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，江蘇 姜堰 225500)

目的 分離黃蜀葵莖枯病病原菌并鑒定其種類。方法 取江蘇省宜興市采集的黃蜀葵發(fā)病植株病灶處(J)和健康處(W)的莖段，培養(yǎng)并篩選新生菌絲體，將分離獲得的幾種待定病原菌分別接種至健康黃蜀葵幼苗莖部，進(jìn)行致病性檢測，隨后將獲得的有效致病菌株進(jìn)行病原菌形態(tài)學(xué)鑒定、PCR擴(kuò)增和rDNA-ITS檢測以確定菌種。結(jié)果 排除J與W中一致的菌種，分離得到3種真菌J2，J5和J6；致病性檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)J5為有效致病菌；根據(jù)病原菌形態(tài)特征觀察，初步鑒定J5為木賊鐮刀菌；J5病原菌基因組DNA擴(kuò)增后得到了長度為524 bp的條帶，與木賊鐮刀菌(Fusarium equiseti)的ITS序列同源性最高，達(dá)到了100%。結(jié)論 黃蜀葵莖枯病病原菌為木賊鐮刀菌F.equiseti。

黃蜀葵；莖枯病；致病菌；木賊鐮刀菌

黃蜀葵Abelmoschusmanihot(L.) Medic.的干燥花冠稱之為黃蜀葵花，性味甘寒，具有清熱解毒、消炎利尿的功效[1]，始見于《嘉祐本草》?，F(xiàn)代中藥藥理研究表明，黃蜀葵花具有明顯的消炎、抗菌、止痛等作用[2]。近年來，黃蜀葵花及其提取物制劑的代表藥物有黃葵膠囊、黃葵片等，其主要用于治療感染性疾病如慢性腎炎，尿路感染等[3-4]，由于其療效顯著，深受患者肯定，臨床需求量逐年增加。

目前，黃蜀葵花藥材主要來自于人工栽培，存在著嚴(yán)重的連作障礙，主要表現(xiàn)為大面積重茬種植導(dǎo)致黃蜀葵病害頻發(fā)且逐年加重。近年來，黃蜀葵莖枯病在全國各種植地時(shí)有發(fā)生，傳播速度快，擴(kuò)散面積大，嚴(yán)重影響了黃蜀葵花的產(chǎn)量和質(zhì)量，部分地區(qū)甚至大面積絕收。前人并未報(bào)道過黃蜀葵莖枯病的研究，因而，本研究對黃蜀葵莖枯病病原菌進(jìn)行了分離和鑒定，為今后開展黃蜀葵莖枯病防治工作提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物：黃蜀葵發(fā)病植株，健康黃蜀葵幼苗，均種植于江蘇省宜興市太華鎮(zhèn)，經(jīng)由南京中醫(yī)藥大學(xué)談獻(xiàn)和教授鑒定。

1.1.2 試劑：0.1%升汞溶液(姜堰市環(huán)球試劑廠)；PDA培養(yǎng)基(200 g切塊的馬鈴薯放入1000 mL蒸餾水中加熱，煮沸30 min后，過濾后加20 g瓊脂，15 g瓊脂制得)；1%瓊脂糖凝膠(Bio Basic Inc.)；Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒及SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒購于上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；

1.1.3 引物：真菌rDNA-ITS區(qū)段通用引物ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)及ITS4(5’-TCCTCCGCTTA-TTGATATGC-3’)購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.1.4 儀器：BA300型生物顯微鏡(美國Motic公司)；2720 Thermal Cycler擴(kuò)增儀(美國Applied Biosystems公司)；3730XL測序儀(美國Applied Biosystems公司)；FR980凝膠成像儀(上海復(fù)日科技儀器有限公司)；DHP-9162恒溫培養(yǎng)箱(太倉市科技器械廠)。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分離與培養(yǎng)：黃蜀葵發(fā)病植株2013年采自于江蘇省宜興市黃蜀葵栽培基地。用無菌刀片分別從病灶處(J)和健康處(W)切取1～1.5cm莖段，用0.1%升汞溶液消毒20 s后，再用75%乙醇消毒1 min，再次用無菌水沖洗，在PDA培養(yǎng)基上恒溫(25 ℃)培養(yǎng)3 d。從培養(yǎng)的莖段組織挑取少量新生菌絲體，將初步篩選的病原菌接至PDA培養(yǎng)基，純化后裝入斜面培養(yǎng)基4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 致病性測定：經(jīng)過初步篩選，將分離獲得的幾種備用病原菌分別接種至PDA培養(yǎng)基上，恒溫(25 ℃)暗培養(yǎng)3 d后，接種至田間生長的健康黃蜀葵幼苗莖部，接種位置距離地面 10～15 cm。接種時(shí)先用無菌接種針順著垂直地面方向劃出傷口，挑去少量備用病原菌菌絲接種至傷口部位，噴灑適量無菌水進(jìn)行潤濕，平行3組實(shí)驗(yàn)。田間種植的黃蜀葵接種病原菌，自然發(fā)病。接種5d后觀察發(fā)病情況。

1.2.3 病原菌形態(tài)學(xué)觀察：將致病性測定結(jié)果中的有效致病菌株在PDA培養(yǎng)基上恒溫(25 ℃)培養(yǎng)7 d，觀察菌落顏色、形態(tài)，測量菌落直徑大小變化；14 d后用顯微鏡觀察真菌分生孢子的大小，形態(tài)，隔膜數(shù)目以及產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)。

1.2.4 病原菌rDNA-ITS序列分析

① 基因組DNA提?。航?jīng)過致病性測定，將黃蜀葵致病菌于25 ℃在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d后，取0.1 g菌絲體，于液氮中研磨成粉末，用Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒提取DNA，DNA提取液直接用于PCR擴(kuò)增。

② rDNA-ITS區(qū)段擴(kuò)增：用真菌rDNA-ITS區(qū)段通用引物ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)和ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)擴(kuò)增病原菌基因組DNA。PCR反應(yīng)體系為25 μL，包括：Template(基因組DNA20～50ng/ μL)0.5 μL，10×Buffer(with Mg2+)2.5 μL，dNTP(各2.5 mM)1 μL，Taq DNA聚合酶(2.5U/ μL)0.2 μL，F(xiàn)(10 μM)0.5 μL，R(10 μM)0.5 μL，加雙蒸水至25 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)；72 ℃修復(fù)延伸10 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測，同時(shí)Bio-Rad 凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行觀察、照相。

③ 純化及測序：在紫外等照射下切取的目的條帶，經(jīng)SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒純化后，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。

④ 同源性比較：測得序列經(jīng)BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)與NCBI數(shù)據(jù)庫中的已知序列進(jìn)行同源性比較。鑒定黃蜀葵莖枯病病原菌歸屬。

2 結(jié)果

2.1 病害癥狀描述 黃蜀葵莖枯病發(fā)病部位在其莖部。通常最先危害其莖上部，隨后向兩側(cè)擴(kuò)散蔓延。發(fā)病部位莖稈干枯呈深褐至黑色，該部位及其以上部分逐漸壞死(見圖1)。發(fā)病初期：黃蜀葵莖部出現(xiàn)多個紫色斑點(diǎn)，植株直立正常；發(fā)病中期：病斑發(fā)黑擴(kuò)散，發(fā)病部位皺縮，植株萎蔫、葉片呈干枯狀卷曲垂下；發(fā)病后期：植株死亡。

圖1 致病菌侵染植株3 d后發(fā)病情況Fig.1 Symptom of diseased Abelmoschus manihot (L.) after inoculation with pathogen for three days

2.2 病原菌分離情況 從發(fā)病的黃蜀葵病灶處(J)與健康處(W)分離得到的真菌中，排除J中與W一致的菌種，初步確定3種真菌J2，J5和J6為黃蜀葵莖枯病病原菌。

2.3 致病性測定 為了驗(yàn)證候選病原菌的致病性，對田間種植的黃蜀葵進(jìn)行接種實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，J5病原菌接種3 d后，接種部位長出紫色病斑，并迅速向周圍蔓延，病株葉片呈失水狀下垂、皺縮，癥狀與田間莖枯病發(fā)病植株相同；J2、J6病原菌接種3 d后，出現(xiàn)紫斑，7 d后仍健康生長；對照組植株健康生長。從病灶處重新提取病原微生物，結(jié)合顯微觀察發(fā)現(xiàn)，此次分離獲得的菌種與原接種菌在各項(xiàng)形態(tài)特征上完全一致。

2.4 顯微鑒定 黃蜀葵病灶處分離得到的有效真菌J5，在PDA培養(yǎng)基上生長率為5.8 cm，從平板底部觀察其顏色變化，先為桃紅，后變?yōu)闇\黃褐色，最后變成深棕色。具有絮狀氣生菌絲，產(chǎn)孢。從培養(yǎng)基上挑取少量菌絲，鏡檢發(fā)現(xiàn)大量分生孢子和分生孢子梗。大分生孢子鐮刀形，具有一個逐漸變窄的頂細(xì)胞和小梗樣的足細(xì)胞，略微向內(nèi)彎曲，4～7個薄而清晰的分隔(5～7個占多數(shù))；厚垣孢子成鏈或成結(jié)。根據(jù)病原菌形態(tài)特征觀察，參考Booth[5]的《鐮刀菌屬》一書，初步鑒定黃蜀葵病原菌為木賊鐮刀菌(Fusariumequiseti)。

2.5 病原菌分子鑒定 J5病原菌基因組DNA經(jīng)通用引物ITS1-ITS4擴(kuò)增，得到長度為524 bp的擴(kuò)增條帶(見圖2、圖3)。通過與已知序列同源性比較發(fā)現(xiàn)，擴(kuò)增條帶的核苷酸序列與GenBank中Fusariumequiseti的ITS序列(登錄號：KJ412501、JQ690085、AB425996、KM246255和KM111481)同源性最高，達(dá)到了100%。綜合致病性測定、形態(tài)學(xué)特征觀察以及ITS結(jié)果分析，最終確認(rèn)本研究分離的黃蜀葵莖枯病病原菌為木賊鐮刀菌(Fusariumequiseti)。

圖2 引物ITS1和ITS4擴(kuò)增的凝膠電泳條帶Fig.2 Agarose gel electrophoresis of ITS region amplified by primers ITS1 and ITS4

圖3 ITS1和ITS4擴(kuò)增的核苷序列表達(dá)Fig.3 Presentation of ITS sequences that amplified by ITS1 and ITS4

3 討論

本文描述的黃蜀葵莖部病害癥狀與易茜茜等[6]對荊芥莖枯病的發(fā)病癥狀的描述基本一致。本課題組在進(jìn)一步研究及查閱文獻(xiàn)后[7-8]認(rèn)為，黃蜀葵的該發(fā)病現(xiàn)象應(yīng)稱之為“莖枯病”。

迄今，并未有關(guān)于黃蜀葵莖枯病的文獻(xiàn)報(bào)道。僅僅通過形態(tài)觀察將鐮刀菌菌株鑒別到種，對于非微生物學(xué)、非分類學(xué)專業(yè)的初學(xué)者來說存在很大的難度[9]。近年來，利用特異性PCR、特征DNA序列等分子技術(shù)輔助鑒定鐮刀菌的方法已經(jīng)被廣泛應(yīng)用[10]。本研究根據(jù)病原菌形態(tài)學(xué)特征初步鑒定到種，按照同源性比較結(jié)果，及致病性測定結(jié)果最終確定了黃蜀葵莖枯病病原菌為木賊鐮刀菌Fusariumequiseti。

本研究所采集的病樣中分離后進(jìn)行反接種，同時(shí)有3種菌種使健康植株發(fā)生變化。其中分離的J5木賊鐮刀菌Fusariumequiseti接種到健康的黃蜀葵植株7 d后發(fā)黑萎蔫枯死，這與黃蜀葵莖枯病田間自然發(fā)病現(xiàn)象相同；同時(shí)分離得到的J2曲霉菌Aspergillus以及J6煙管菌Bjerkandera(同樣通過rDNA-ITS測序方式確定的種類)雖然能引起健康植株的葉片出現(xiàn)紫紅色斑紋，但發(fā)病現(xiàn)象緩慢，未能致死健康植株，這與黃蜀葵田間發(fā)病規(guī)律不符。綜上，可推斷出曲霉菌以及煙管菌并非黃蜀葵莖枯病的病原菌，而是其發(fā)病部位滋長的腐生真菌。但具體侵染過程及相對病害的影響有待進(jìn)一步研究。

本研究初步確定了江蘇省宜興市黃蜀葵莖枯病的致病菌，對于研究莖枯病相關(guān)病害的流行規(guī)律及治理方法具有重要意義，同時(shí)為鐮刀菌引起的相關(guān)病害的防止奠定了一定的基礎(chǔ)。進(jìn)一步的研究將致力于木賊鐮刀菌Fusariumequiseti的生理活性、致病力及殺菌劑敏感性等方面，為相關(guān)病害的綜合治理提供依據(jù)。

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(編校：王儼儼)

Isolation and identification of pathogen causing stem blight disease onAbelmoschusmanihot(L.) Medic

XIA Min-yuan1, ZHANG Yu1Δ, SHEN Xiao-lin2, QIN Jun2, MIAO Yi-jun1, TAN Xian-he1

(1.School of Pharmacy, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China; 2.SZYY Group Pharmaceutical Limited, Jiangyan 225500, China)

ObjectiveTo isolation and identify the pathogen of stem blight of Malvaceae.MethodsThe stems were collected from stem blight-diseased plants (J) and healthy ones (W) ofAbelmoschusmanihot(L.) Medic.in Yixing City of Jiangsu Province then cultured to isolate newborn mycelium.The pathogen isolated but unidentified were inoculated in stems of healthy plants ofAbelmoschusmanihot(L.) Medic.and pathogenicity was verified.Finally, the pathogenic specie(s) was or were identified by morphological characteristic, rDNA-ITS analysis and polymerase chain reaction (PCR) method.ResultsThe same fungus were excluded which were the same species in J and W, the three fungus of J2, J5 and J6 were acquired.J5 was preliminarily identified to have pathogenicity and it wasFusariumequisetiunder the microscope.The genome DNA of J5 was amplified to a length of 524bp, and homology highly withFusariumequiseti(100%).ConclusionThe pathogen was identified asFusariumequiseti.

Abelmoschusmanihot(L.) Medic.; stem blight; pathogen;Fusariumequiseti

江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科南京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)學(xué)科開放研究課題(2011ZYX6-014)

夏敏媛，女，碩士在讀，研究方向：中藥資源生產(chǎn)研究，E-mail：xia2299@qq.com；張瑜，通訊作者，女，研究員，碩士生導(dǎo)師，副教授，研究方向：中藥資源生產(chǎn)研究，E-mail：catyuer@163.com。

S435.67

A

1005-1678(2015)09-0012-03