高紅林，韓京華，楊翠紅，劉雅潔，宋娜玲Δ，王燕銘Δ

(1.北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院&中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所，天津市放射醫(yī)學(xué)與分子核醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300192；2.南開大學(xué) 藥學(xué)院 藥物化學(xué)生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300071)

?

炔基化聚天冬酰胺開環(huán)衍生物的合成及生物相容性研究

高紅林1，韓京華2，楊翠紅1，劉雅潔2，宋娜玲1Δ，王燕銘2Δ

(1.北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院&中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所，天津市放射醫(yī)學(xué)與分子核醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300192；2.南開大學(xué) 藥學(xué)院 藥物化學(xué)生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300071)

目的 合成一種新的炔基化聚天冬酰胺-g-苯丙氨酸衍生物用作功能化藥物載體。方法 以L-苯丙氨酸為原料制備苯丙氨酸甲酯鹽酸鹽，對(duì)聚琥珀酰亞胺(polyasparamide, PSI)進(jìn)行開環(huán)反應(yīng)得到聚天冬酰胺-g-苯丙氨酸衍生物PSI-Phe-OMe，使用炔丙胺進(jìn)一步開環(huán)得到炔基化的聚天冬酰胺-g-苯丙氨酸衍生物PSI-Phe-OMe-PA；通過1HNMR進(jìn)行聚合物結(jié)構(gòu)確證；通過MTT法、顯微觀察法和碘化丙啶(PI)染色法等確定PSI-Phe-OMe-PA對(duì)細(xì)胞增殖、形態(tài)以及細(xì)胞周期的影響。結(jié)果1HNMR確證了PSI-Phe-OMe-PA的分子結(jié)構(gòu)，苯丙氨酸甲酯鹽酸鹽對(duì)PSI的開環(huán)率為40%，炔丙胺進(jìn)一步開環(huán)后可使開環(huán)率接近100%；MTT實(shí)驗(yàn)表明PSI-Phe-OMe-PA對(duì)NIH 3T3 和HepG2 2種細(xì)胞的毒性較小，在濃度為100 μg/mL時(shí)細(xì)胞存活率仍在80%左右，且對(duì)細(xì)胞形貌和細(xì)胞周期無顯著影響。結(jié)論 苯丙氨酸甲酯和炔丙胺可依次對(duì)聚琥珀酰亞胺進(jìn)行開環(huán)合成炔基化的聚天冬酰胺開環(huán)衍生物PSI-Phe-OMe-PA，且PSI-Phe-OMe-PA是一類安全的功能化藥物載體。

聚天冬酰胺衍生物；炔基化；藥物載體；生物相容性

聚天冬酰胺類材料因具有生物相容性好、可降解和易修飾等優(yōu)點(diǎn)被認(rèn)為是一種有應(yīng)用前景的藥物控釋材料[1-3]。理想的藥物載體需要具備高載藥量、可實(shí)現(xiàn)藥物靶向緩控釋等智能響應(yīng)的特性[4-6]。因此，對(duì)傳統(tǒng)天然類藥物載體材料的生物改性成為必然趨勢(shì)。采用不同的開環(huán)試劑對(duì)聚琥珀酰亞胺(polysuccinimide, PSI)進(jìn)行開環(huán)可以使其易于進(jìn)行功能化修飾，因此可賦予PSI衍生物更加廣闊的應(yīng)用前景。Zhao等[7]設(shè)計(jì)pH敏感聚天冬酰胺的肼解產(chǎn)物聚天冬酰肼(PAHy)作為阿霉素的載體用作抗腫瘤治療。Chen等[8]合成了星狀聚天冬氨酸-琥珀酰亞胺共聚物納米載體用于植物韌皮部藥物輸送。本文旨在利用L-苯丙氨酸甲酯上的氨基和炔丙胺對(duì)PSI依次進(jìn)行開環(huán)反應(yīng)從而構(gòu)建適于應(yīng)用的功能化藥物載體。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑：聚琥珀酰亞胺(PSI，實(shí)驗(yàn)室自制，粘均分子量為50kDa)；L-天冬氨酸、環(huán)丁砜、均三甲苯、L-苯丙氨酸和炔丙胺(Alfa Aesar，美國(guó))；細(xì)胞培養(yǎng)耗材(Corning，美國(guó))；胎牛血清、RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)基、胰蛋白酶和3-(4，5)-雙甲基-2-噻唑-(2，5)-二苯基溴化四氮唑藍(lán)(MTT，Gibco，美國(guó))；碘化丙啶(Propidium Iodide，PI，Sigma，美國(guó))；其他試劑均購(gòu)自天津試劑六廠。

1.1.2 細(xì)胞株：NIH 3T3(小鼠胚胎成纖維細(xì)胞系)和HepG2(人肝癌細(xì)胞系)細(xì)胞，為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.3 儀器：電子分析天平(BT124S，Sartorius)；集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(DF-101S，予華儀器)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(SB-1000，東京理化器械)；核磁共振儀(1H NMR，Bruker ARX 400，瑞士)；倒置熒光顯微鏡(DMI 3000B，Leica，德國(guó))；全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀(Varioskan Flash，THERMO，美國(guó))；流式細(xì)胞儀(Accuri C6，Accuri Cytometers，美國(guó))。

1.2 方法

1.2.1 化學(xué)合成及結(jié)構(gòu)表征

① 苯丙氨酸甲酯鹽酸鹽(Phe-OMe·HCl)的合成：在0 ℃條件下向40 mL無水甲醇中逐滴加入8.8 mL氯化亞砜，滴加完畢后溫度上升至室溫，繼續(xù)攪拌0.5 h，然后緩慢加入L-苯丙氨酸，溫度上升至80 ℃，回流反應(yīng)10 h。反應(yīng)液冷卻后滴入乙醚中得到白色沉淀苯丙氨酸甲酯鹽酸鹽備用。

② PSI-Phe-OMe的合成：Phe-OMe·HCl的氨基可以對(duì)PSI進(jìn)行開環(huán)反應(yīng)，同時(shí)使開環(huán)聚合物帶有甲酯側(cè)鏈。取PSI 500 mg溶于5 mL DMF中，加入3.69 g Phe-OMe·HCl，三乙胺2.8 mL，于60 ℃下反應(yīng)24 h，將反應(yīng)液冷卻后滴入無水乙醚中沉淀，得到淡黃色固體粉末即為聚合物PSI-Phe-OMe。

③ PSI-Phe-OMe-PA的合成：炔基是點(diǎn)擊化學(xué)的一個(gè)重要反應(yīng)基團(tuán)，可以與疊氮形成三唑環(huán)，該反應(yīng)易于進(jìn)行且專屬性強(qiáng)，可以在聚合物主鏈上引入更豐富的基團(tuán)或側(cè)鏈。使用炔丙胺與剩余的琥珀酰亞胺單元反應(yīng)，使炔基連接到聚合物鏈上。取PSI-Phe-OMe 500 mg溶于5 mL DMF中，緩慢加入炔丙胺 0.13 mL，

40 ℃下攪拌反應(yīng)96 h。將反應(yīng)液用5 mL蒸餾水稀釋，轉(zhuǎn)入截留分子量為8 kDa的透析帶中透析48 h，透析液為蒸餾水。將透析袋中溶液置于冷凍干燥機(jī)中凍干，得到淡黃色固體即為目標(biāo)聚合物PSI-Phe-OMe-PA。聚合物結(jié)構(gòu)表征通過核磁共振氫譜進(jìn)行測(cè)定。

1.2.2 細(xì)胞毒性檢測(cè)：采用MTT法和細(xì)胞微觀形態(tài)觀察研究聚合物PSI-Phe-OMe-PA的細(xì)胞毒性。NIH 3T3和HepG2細(xì)胞，用RPMI 1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清，100 U/mL的青霉素和100 μg/mL的鏈霉素)在37 ℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。MTT實(shí)驗(yàn)中按1×104細(xì)胞/孔接種96孔板，培養(yǎng)24 h。用含不同濃度聚合物(0、1、2、5、10、100 μg/mL，0 μg/mL為對(duì)照組，其余為實(shí)驗(yàn)組)的RPMI 1640培養(yǎng)基置換細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h。按照20 μL/孔向培養(yǎng)液中加入MTT(5 mg/mL)繼續(xù)培養(yǎng)4 h，加入二甲基亞砜，室溫避光震蕩裂解10 min后用全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀測(cè)定OD 490，按照以下公式計(jì)算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率(%)= 實(shí)驗(yàn)組OD490/對(duì)照組OD490×100。

細(xì)胞微觀形態(tài)觀察實(shí)驗(yàn)中按5×104HepG2細(xì)胞/孔接種24孔板，培養(yǎng)24 h。用含聚合物濃度為50 μg/mL的RPMI 1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h后于倒置顯微鏡下觀察。

1.2.3 細(xì)胞周期檢測(cè)：為考察PSI-Phe-OMe-PA對(duì)細(xì)胞周期的影響，利用碘化丙啶(PI)染色法通過流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期的變化。細(xì)胞培養(yǎng)方法同1.2.2中細(xì)胞微觀形態(tài)觀察法。聚合物(濃度為50 μg/mL,為實(shí)驗(yàn)組，以不加聚合物為對(duì)照組)孵育24 h后，消化、離心收集細(xì)胞后加入500 μL 碘化丙啶染液(PI，50 μg/mL，含100 μg/mL RNase A和0.2%Triton X-100)，4 ℃避光孵育0.5 h，流式細(xì)胞儀收集2×104細(xì)胞檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，2組間比較進(jìn)行t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PSI-Phe-OMe-PA合成及結(jié)構(gòu)表征 利用L-苯丙氨酸甲酯上的氨基對(duì)PSI進(jìn)行開環(huán)得到聚合物PSI-Phe-OMe，使PSI在開環(huán)后帶有苯丙氨酸甲酯側(cè)枝，然后使用炔丙胺進(jìn)行進(jìn)一步開環(huán)反應(yīng)得到終產(chǎn)物PSI-Phe-OMe-PA。見圖1。

圖1 苯丙氨酸甲酯(a)和聚合物PSI-Phe-OMe-PA(b)的合成路徑Fig.1 Synthetic routes of L-phenylalanine methyl ester hydrochloride (a) and target compound PSI-Phe-OMe-PA (b)

核磁共振氫譜顯示聚合物PSI-Phe-OMe-PA的結(jié)構(gòu)是正確的。見圖2。4.44 ppm和3.82 ppm處的信號(hào)峰為炔丙胺特征峰，同時(shí)5.29 ppm處環(huán)上亞甲基特征峰僅有少量殘留，說明反應(yīng)接近完全，即炔丙胺使剩余的琥珀酰亞胺環(huán)完全打開。7.20 ppm處苯環(huán)峰和3.82 ppm處甲基峰顯示苯丙氨酸甲酯結(jié)構(gòu)完好。采用內(nèi)標(biāo)法磁氫譜計(jì)算其開環(huán)率約為40%。

圖2 PSI-Phe-OMe-PA的1H核磁表征Fig.2 1H NMR spectrum of PSI-Phe-OMe-PA

2.2 細(xì)胞相容性分析 目標(biāo)聚合物PSI-Phe-OMe-PA用作藥物載體對(duì)細(xì)胞毒性以及對(duì)細(xì)胞周期的影響結(jié)果顯示：隨著聚合物濃度的增加，細(xì)胞存活率有一定的下降，但在聚合物濃度<100 μg/mL時(shí)2種細(xì)胞的存活率仍在80%左右。見圖3。與對(duì)照組相比，50 μg/mL的聚合物處理24 h對(duì)HepG2細(xì)胞的微觀形貌沒有產(chǎn)生明顯影響。見圖4。50 μg/mL聚合物對(duì)于NIH 3T3細(xì)胞和HepG2細(xì)胞的細(xì)胞周期分布無顯著影響。見圖5。

圖3 PSI-Phe-OMe-PA處理24 h對(duì)NIH 3T3細(xì)胞和HepG2細(xì)胞的毒性Fig.3 Toxicity of PSI-Phe-OMe-PA on NIH 3T3 celland HepG2 cell for 24 hours

圖4 HepG2細(xì)胞的形貌觀察A:HepG2對(duì)照細(xì)胞；B:PSI-Phe-OMe-PA (50 μg/mL)處理24 h的HepG2細(xì)胞標(biāo)尺均為50 μmFig.4 Morphology of HepG2 cell treated with PSI-Phe-OMe-PA for 24 hoursA:control(0 μg/mL);B:treated with PSI-Phe-OMe-PA(50 μg/mL)All scale bars were 50 μm

圖5 PSI-Phe-OMe-PA(50 μg/mL)處理24 h對(duì)NIH 3T3細(xì)胞(A)和HepG2細(xì)胞(B)細(xì)胞周期的影響Fig.5 Effect of PSI-Phe-OMe-PA (50 μg/mL) on cell cycles of NIH 3T3 cell(A) and HepG2 cell(B) for 24 hours

3 討論

聚琥珀酰亞胺(PSI)是通過L-天冬氨酸熱縮聚合而成，易在堿性條件下水解成天冬氨酸聚合物或水凝膠，或通過親水性氨基等功能基團(tuán)修飾形成水溶性好、生物相容性高的聚天冬氨酸衍生物。PSI及其衍生物的這種堿性響應(yīng)性、生物可降解性以及易于進(jìn)行功能化修飾的特性使其在藥物控釋領(lǐng)域顯示出廣闊的應(yīng)用前景[9-10]。本文采用L-苯丙氨酸甲酯對(duì)PSI進(jìn)行開環(huán)，一方面L-苯丙氨酸甲酯的氨基可以打開一部分PSI的琥珀酰亞胺單元，另一方面，L-苯丙氨酸結(jié)構(gòu)的苯環(huán)可與含苯環(huán)的藥物分子如布洛芬、環(huán)丙沙星等形成π-π共軛作用[11]，從而增大聚合物的載藥能力。磁共振氫譜結(jié)果顯示L-苯丙氨酸甲酯對(duì)PSI的開環(huán)率約為40%，為后續(xù)作為藥物載體應(yīng)用奠定了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

點(diǎn)擊化學(xué)(Click chemistry)已經(jīng)成為目前最吸引人的合成理念之一，因點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)專一性強(qiáng)、可調(diào)控強(qiáng)，已廣泛用于生物醫(yī)用材料和藥物研發(fā)等領(lǐng)域[12-13]。本文利用炔丙胺對(duì)PSI進(jìn)行進(jìn)一步開環(huán)反應(yīng)，在苯丙氨酸甲酯結(jié)構(gòu)完整的前提下可基本完全打開PSI-Phe-OMe中的琥珀酰亞胺環(huán)得到炔基化的聚天冬酰胺-g-苯丙氨酸衍生物。炔基化可賦予聚合物載體通過點(diǎn)擊化學(xué)連接其他功能基團(tuán)的特性，如可連接親水基團(tuán)聚乙二醇(PEG)，使聚合物具有兩親性，能夠更好地形成載藥納米顆粒并在水相中維持穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)等[14]。

藥物載體的生物性能對(duì)于其能否用于體內(nèi)藥物輸送具有重要的意義[15]。細(xì)胞毒性和細(xì)胞周期評(píng)價(jià)顯示通過L-苯丙氨酸甲酯和炔丙胺兩步開環(huán)反應(yīng)得到的炔基化聚天冬酰胺開環(huán)衍生物PSI-Phe-OMe-PA具有良好的細(xì)胞相容性，是一種潛在的功能化藥物載體。

[1] Gyarmati B,Mészár EZ,Kiss L,et al.Supermacroporous chemically cross-linked poly(aspartic acid) hydrogels [J].Acta Biomater,2015,22:32-38.

[2] Zhao D,Li B,Han J,et al.PH responsive polypeptide based polymeric micelles for anticancer drug delivery [J].J Biomed Mater Res A,2015,103(9):3045-5303.

[3] 趙彥生，袁廣薇，馬興吉，等.聚天冬氨酸的改性及其應(yīng)用研究進(jìn)展[J].化學(xué)與生物工程，2009，26(6)：15-18.

[4] Liu J,Liu J,Chu L,et al.Self-assembling peptide of D-amino acids boosts selectivity and antitumor efficacy of 10-hydroxycamptothecin[J].ACS Appl Mater Interfaces,2014,6(8):5558-5565.

[5] 林瀟，唐明燈.靶向表皮生長(zhǎng)因子受體分子探針研究進(jìn)展[J].國(guó)際放射醫(yī)學(xué)核醫(yī)學(xué)雜志，2015，39(1)：85-90.

[6] 楊翠紅，張玉民，劉金劍，等.RGD 功能化多肽納米纖維的制備及其體內(nèi)腫瘤靶向性研究[J].中國(guó)生化藥物雜志，2014，34(5)：5-8.

[7] Zhao D,Li B,Han J,et al.PH responsive polypeptide based polymeric micelles for anticancer drug delivery [J].J Biomed Mater Res A,2015,103(9):3045-3053.

[8] Chen M,Jensen SP,Hill MR,et al.Synthesis of amphiphilic polysuccinimide star copolymers for responsive delivery in plants[J].Chem Commun (Camb),2015,51(47):9694-9697.

[9] Hill MR,MacKrell EJ,Forsthoefel CP,et al.Biodegradable and pH-responsive nanoparticles designed for site-specific delivery in agriculture[J].Biomacromolecules,2015,16(4):1276-8122.

[10] Yang HM,Park CW,Woo MA,et al.HER2/neu antibody conjugated poly(amino acid)-coated iron oxide nanoparticles for breast cancer MR imaging [J].Biomacromolecules,2010,11(11):2866-2872.

[11] Janiak C.A critical account on π-π stacking in metal complexes with aromatic nitrogen-containing ligands [J].J Chen Soc, Dalton Trans,2000(21):3885-3896.

[12] Musumeci F,Schenone S1,Desogus A,et al.Click chemistry, a potent tool in medicinal sciences[J].Curr Med Chem,2015,22(17):2022-2050.

[13] 王紅梅，王藺，王曉川.點(diǎn)擊反應(yīng)在功能材料中的應(yīng)用[J].材料導(dǎo)報(bào)A，2014，28(8)：130-135.

[14] Lv S,Song W,Tang Z,et al.Charge-conversional PEG-polypeptide polyionic complex nanoparticles from simple blending of a pair of oppositely charged block copolymers as an intelligent vehicle for efficient antitumor drug delivery [J].mol Pharm,2014,11(5):1562-1574.

[15] 楊翠紅，韓京華，劉金劍，等.聚天冬酰胺衍生物的合成及細(xì)胞毒性研究[J].天津醫(yī)藥，2015，43(6)：582-586.

(編校：吳茜)

Synthesis and biocompatibility of ethynylated open ring derivatives of polyasparamide

GAO Hong-lin1, HAN Jing-hua2, YANG Cui-hong1, LIU Ya-jie2, SONG Na-ling1Δ, WANG Yan-ming2Δ

(1.Tianjin Key laboratory of Radiation Medicine and Molecular Nuclear Medicine, Institute of Radiation Medicine, Chinese Academy of Medical Science & Peking Union Medical College, Tianjin 300192, China; 2.State Key Laboratory of Medicinal Chemical Biology, College of Pharmacy, Nankai University, Tianjin 300071, China)

ObjectiveTo synthesize a new ethynylated open ring derivatives of polyasparamide as functional drug carrier.MethodsL-phenylalanine methyl ester hydrochloride was prepared using L-phenylalanine and then was used for ring opening reaction of polysuccinimide.To synthesize the target product of PSI-Phe-OMe-PA, the obtained polyasparamide-g-phenylalanine derivatives (PSI-Phe-OMe) was further ring opened by propargylamine.The structure of PSI-Phe-OMe-PA was confirmed by1H NMR.The biocompatibility of PSI-Phe-OMe-PA was evaluated by MTT method, inverted microscope observation and cell cycles analysis (propidium iodide staining).ResultsThe ring-opening rate of polyasparamide by L-phenylalanine methyl ester and propargylamine was 40%and 100%, respectively.All results of biocompatibility studies indicated that PSI-Phe-OMe-PA may be a good candidate for functional drug carrier.Conclusion Based on the ring-opening capability of amino-group and the specificity of click reaction, L-phenylalanine methyl ester hydrochloride and propargylamine were used successively to react with polyasparamide.PSI-Phe-OMe-PA is a biocompatible functional drug carrier.

derivatives of polyasparamide; ethynylation; drug carrier; biocompatibility

國(guó)家自然科學(xué)(51473080)；天津市應(yīng)用基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計(jì)劃(14JCZDJC33300)；北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院“協(xié)和青年基金”(3332015100)；國(guó)家自然科學(xué)基金 青年科學(xué)基金(51303213)；中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所基金(所探1550)

高紅林，女，碩士，研究方向：藥物載體材料的設(shè)計(jì)及生物性能研究，E-mail:mwtghl@163.com；宋娜玲，通訊作者，女，副研究員，碩士生導(dǎo)師，研究方向：蛋白質(zhì)分析和核酸分析的新技術(shù)、新方法和新試劑的研究以及生物醫(yī)用材料的設(shè)計(jì)等，E-mail：nalingsong@sina.com；王燕銘，共同通訊作者，男，博士，副教授，研究方向：功能性高分子材料和雜化材料的化學(xué)生物學(xué)性質(zhì)以及藥物和基因控釋研究，E-mail：wangyanming@nankai.edu.cn。

R914.5

A

1005-1678(2015)09-0001-04