王會(huì)，吳漢東，劉政

(遼寧醫(yī)學(xué)院 食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧 錦州 121001)

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根皮素對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901凋亡的影響及可能機(jī)制

王會(huì)，吳漢東，劉政

(遼寧醫(yī)學(xué)院 食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧 錦州 121001)

目的 研究根皮素對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901凋亡的影響及可能機(jī)制。方法 以人胃癌細(xì)胞SGC-7901為研究對(duì)象，檢測(cè)不同濃度根皮素(40、80、160 mg/L)對(duì)細(xì)胞的影響，包括細(xì)胞形態(tài)學(xué)分析、細(xì)胞活力檢測(cè)、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率、細(xì)胞周期、線粒體膜電位、細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化。結(jié)果 不同濃度根皮素處理細(xì)胞24 h后，人胃癌細(xì)胞SGC-7901發(fā)生凋亡形態(tài)改變；不同濃度根皮素對(duì)SGC-7901細(xì)胞有抑制增殖作用和誘導(dǎo)凋亡作用；能將細(xì)胞周期阻滯于G1期；細(xì)胞線粒體膜電位降低；細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度增大，呈時(shí)間和濃度依賴性。結(jié)論 根皮素可通過阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程，降低線粒體膜電位，干擾胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)來誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞SGC-7901凋亡。

根皮素；胃癌細(xì)胞；細(xì)胞凋亡；細(xì)胞增殖

根皮素是存在于蘋果、梨等水果及多種蔬菜汁液中的天然活性物質(zhì)，具有抗氧化、抗腫瘤、抗糖尿病、抗菌以及雌激素樣作用等活性。根皮素能激活蜂窩蛋白激酶，能抑制細(xì)胞無序增殖，具有抗誘變功能，可用于多種腫瘤的治療[1-2]。根皮素可通過抑制糖的跨膜運(yùn)輸來促進(jìn)小鼠腫瘤B16-4A5細(xì)胞凋亡[3]。根皮素可以嵌入 DNA 分子中，干擾 B16 腫瘤細(xì)胞 DNA 復(fù)制，使細(xì)胞中蛋白激酶 C (protein kinase C，PKC)的活性受到抑制，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡[4]。胃癌是常見的消化道惡性腫瘤，具有發(fā)病隱匿、早期臨床癥狀不明顯，早期診斷率低等特點(diǎn), 絕大多數(shù)患者一經(jīng)發(fā)現(xiàn)已處于臨床晚期，嚴(yán)重威脅患者的生命和健康[5]。迄今為止，胃癌的發(fā)病機(jī)制并未完全闡明，不能滿足臨床對(duì)胃癌實(shí)施有效的預(yù)防及治療，因此，胃癌的預(yù)防及治療仍然是臨床上急需解決的問題。目前關(guān)于根皮素誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡的研究非常少。本實(shí)驗(yàn)旨在以人胃癌細(xì)胞 SGC-7901 為研究對(duì)象，探討根皮素對(duì)其增殖和凋亡的影響，為胃癌的預(yù)防及治療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 人胃癌細(xì)胞 SGC-7901 細(xì)胞株購(gòu)于中科院細(xì)胞庫(kù)提供；根皮素(純度：99.99%；批號(hào)：P7912-100MG)；甲基噻唑藍(lán)(MTT)、碘化丙啶(PI)、吖啶橙(AO)、溴乙錠(EB)、二甲基亞砜(DMSO)均購(gòu)自Sigma 公司；RPMI1640培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)于GIBCO公司；Annexin V-FITC Apoptosis Detection試劑盒購(gòu)于BD公司；Caspase酶活性試劑盒購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器 FC500流式細(xì)胞儀(BECKMAN)；TE2000-E激光共聚焦顯微鏡(Nikon)；IX-71倒置相差顯微鏡(Olympus)。

1.3 方法

1.3.1 藥物配制：根皮素用DMSO(終濃度小于0.5%)溶解，再用基礎(chǔ)培養(yǎng)基稀釋成濃度為8 mg/mL的母液，分裝，置-20 ℃冰箱避光保存?zhèn)溆谩Ｔ趯?shí)驗(yàn)中DMSO的終濃度要小于0.1%。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)：SGC-7901細(xì)胞用含10% 標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)液顏色變黃時(shí)換液，待細(xì)胞呈80%～90% 融合后，作傳代處理。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SGC-7901細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 Hoechst33258染色觀察凋亡細(xì)胞核：取滅菌的蓋玻片置于6孔板中，按1.0×106個(gè)/mL接種胃癌細(xì)胞1 mL。培養(yǎng)24 h后分別用含有40、80、160 mg/L的根皮素處理細(xì)胞，同時(shí)設(shè)立細(xì)胞對(duì)照組。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，輕輕移除上清，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞，加入5 mg/L的Hoechst33258染色液避光染色5 min，去染色液，滴抗熒光淬滅封片液于載玻片上，將6孔板內(nèi)玻片取出蓋在載玻片上，在激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.4 MTT檢測(cè)細(xì)胞活力：取180 μL對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，按1.0×105/mL接種于 96 孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h后分別加入40、80、160 mg/L根皮素進(jìn)行處理，同時(shí)設(shè)細(xì)胞對(duì)照組。每組設(shè) 8 個(gè)重復(fù)，繼續(xù)培養(yǎng)12、24、36、48 h后每孔加入 20 μL 5 mg/mL MTT(PBS溶解)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清，每孔加入 200 μL DMSO，搖勻，利用酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)量OD值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.5 Annexin V-FITC/PI雙染檢測(cè)細(xì)胞凋亡率：細(xì)胞培養(yǎng)和處理同1.3.4。收集各組培養(yǎng)12、24、36、48 h后的細(xì)胞，PBS洗滌3次，向沉淀的細(xì)胞樣品中加入100 μL PBS懸浮細(xì)胞，隨即加入5 μL AnnexinV-FITC和5 μL PI，混勻。避光常溫反應(yīng)10 min，400目篩網(wǎng)過濾，流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.6 細(xì)胞周期檢測(cè)：細(xì)胞培養(yǎng)和處理同1.3.4。收集各組培養(yǎng)12 h后的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1.0～5.0×105個(gè)/樣品，加入預(yù)冷的70% 無水乙醇，4 ℃ 放置12 h。離心棄乙醇，PBS漂洗1次。加入1 mL PI染液，4 ℃ 避光反應(yīng)20 min。400目篩網(wǎng)過濾，流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞周期分布情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.7 線粒體膜電位檢測(cè)：細(xì)胞培養(yǎng)和處理同1.3.4。收集各組培養(yǎng)12 h后的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1.0×106個(gè)/樣品，加入0.5 mL JC-1染色液，在CO2培養(yǎng)箱避光孵育20 min， PBS

洗滌1次，0.5 mL PBS重懸細(xì)胞。400目篩網(wǎng)過濾，流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組線粒體膜電位情況。

1.3.8 細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的測(cè)定：細(xì)胞培養(yǎng)和處理同1.3.4。收集各組培養(yǎng)12 h后的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至(1～2)×106個(gè)/mL。加入Fluo-3/Am至終濃度為8 μM，置5% CO2，37 ℃培養(yǎng)箱避光孵育30 min，期間振蕩3次，并設(shè)置陰性對(duì)照(不加Fluo-3/Am)。離心，去掉多余染料，用無鈣緩沖液PBS洗滌2次，無鈣PBS重懸至0.5 mL，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 Hoechst33258染色觀察凋亡細(xì)胞核 對(duì)照組細(xì)胞核呈卵圓形，染色質(zhì)均勻著色，分布于整個(gè)細(xì)胞核，熒光強(qiáng)度較強(qiáng)。根皮素各濃度處理組細(xì)胞染色質(zhì)凝聚、斷裂，呈點(diǎn)狀，著色不均勻呈亮點(diǎn)狀。見圖1。

圖1 各濃度根皮素處理SGC-7901 24 h后的Hoechst33258 染色結(jié)果(×100)Fig.1 Morphology of SGC-7901 cells after 24 h treatment by phloretin stained by Hoechst33258(×100)

2.2 細(xì)胞活力檢測(cè) MTT檢測(cè)結(jié)果顯示：根皮素處理 SGC-7901細(xì)胞 12、24、36、48 h后，隨著根皮素濃度的增大活細(xì)胞數(shù)量逐漸降低，呈現(xiàn)量效和時(shí)效關(guān)系。

表1 根皮素對(duì)SGC-7901細(xì)胞生長(zhǎng)的影響Tab.1 Inhibition effect of phloretin on SGC-7901 ±s, n=8)

*P<0.05，**P<0.01，與對(duì)照組比較，compared with control group

2.3 各組細(xì)胞凋亡率測(cè)定結(jié)果 流式檢測(cè)結(jié)果顯示：隨著根皮素作用時(shí)間的延長(zhǎng)和濃度的增大，細(xì)胞凋亡逐漸增多，且呈時(shí)間依賴性和濃度依賴性。見表2、圖2。

組別細(xì)胞凋亡率(%)12h24h36h48h對(duì)照組3.20±0.885.71±1.258.11±1.579.56±1.49根皮素40mg/L4.23±1.38*9.30±1.39**20.15±1.46**27.00±1.43**根皮素80mg/L6.49±1.53**21.66±2.24**31.20±2.49**30.38±3.59**根皮素160mg/L11.53±1.67**27.33±3.42**35.99±3.29**41.23±3.19**

*P<0.05，**P<0.01，與對(duì)照組比較， compared with control group

圖2 根皮素SGC-7901細(xì)胞凋亡的影響(n=3) Fig.2 Apoptosis rate of SGC-7901 after treatment by phloretin(n=3)

2.4 各組細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果 根皮素處理細(xì)胞24 h后，隨著根皮素濃度的增大，G1期細(xì)胞數(shù)百分比增大，S期細(xì)胞百分比下降，G2期細(xì)胞百分比下降，表明細(xì)胞經(jīng)根皮素處理后增殖停滯在G1期，細(xì)胞的DNA合成受到阻滯，且隨著根皮素劑量的增加而愈加明顯，呈現(xiàn)劑量依賴性。見表3。

表3 根皮素對(duì)SGC-7901細(xì)胞周期的影響Tab.1 Cell cycle of SGC-7901 cells treatment by phloretin ±s，%, n=3)

*P<0.05，**P<0.01，與對(duì)照組比較， compared with control group

2.5 細(xì)胞線粒體膜電位的檢測(cè) 采用JC-1標(biāo)記流式細(xì)胞儀檢測(cè)線粒體膜電位變化，結(jié)果表明經(jīng)不同濃度根皮素作用24 h后的SGC-7901細(xì)胞的線粒體膜電位下降，與對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖3。

圖3 根皮素對(duì)SGC-7901細(xì)胞線粒體膜電位變化情況**P<0.01，與對(duì)照組比較Fig.3 Mitochondrial membrane potential of SGC-7901 cells after 24 h treatment by phloretin**P<0.01,compared with control group

2.6 細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的測(cè)定 由結(jié)果可知：隨根皮素濃度增大，細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度逐漸升高，與對(duì)照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖4。

圖4 根皮素對(duì)SGC-7901細(xì)胞胞內(nèi)Ca 2+濃度的影響*P<0.05，**P<0.01，與對(duì)照組比較Fig.4 Concentrations of intracellular calcium of SGC-7901 cells after 24 htreatment by phloretin*P<0.05,**P<0.01,compared with control group

3 討論

根皮素是一種具有治療腫瘤功能的多酚類天然化合物，可抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng), 誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[6]。根皮素能夠通過抑制Ⅱ型葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白來誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡[7]。根皮素能通過線粒體途徑誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞 BEL-7402凋亡，還可通過干預(yù)與肝癌細(xì)胞侵襲力密切相關(guān)的細(xì)胞粘附、運(yùn)動(dòng)及侵襲等作用抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移潛能[8-9]。

研究認(rèn)為腫瘤是一種細(xì)胞周期性疾病，細(xì)胞無限增殖，周期失控導(dǎo)致細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化和腫瘤形成[10]。根皮素分子結(jié)構(gòu)中具有 4 個(gè)羥基，與葡萄糖結(jié)構(gòu)相似，與葡萄糖運(yùn)輸形成非競(jìng)爭(zhēng)性抑制，抑制能量來源，促使細(xì)胞發(fā)生凋亡。根皮素為芳香環(huán)結(jié)構(gòu)，可插入到 DNA雙螺旋分子中，從而阻止 DNA 合成，影響細(xì)胞周期的分布，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。

本研究結(jié)果表明，經(jīng)根皮素作用的SGC-7901細(xì)胞發(fā)生了G1期阻滯，且細(xì)胞增殖被抑制。隨著根皮素濃度的增加，G1期細(xì)胞增加，S期細(xì)胞減少，呈現(xiàn)濃度依賴性關(guān)系。推測(cè)根皮素通過影響細(xì)胞周期的分布促凋亡作用，這為開展根皮素誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡機(jī)理的研究提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

細(xì)胞凋亡與線粒體密切相關(guān)，線粒體在細(xì)胞凋亡的過程中起著重要作用，多種細(xì)胞凋亡因素可誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡，在受到凋亡誘導(dǎo)后膜通透性增大，跨膜電位下降，這些是細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)過程中最早發(fā)生的事件，它發(fā)生在細(xì)胞核凋亡特征出現(xiàn)之前。利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)線粒體膜電位的變化，其機(jī)制為線粒體存在內(nèi)負(fù)外正膜電位。根皮素是一種解偶聯(lián)試劑，可以抑制線粒體的氧化磷酸化作用[11]，ATP合成受阻，能量缺乏，促使細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)采用 JC-1標(biāo)記結(jié)合流式細(xì)胞儀檢測(cè)線粒體膜電位變化，發(fā)現(xiàn)經(jīng)根皮素作用后的 SGC-7901細(xì)胞，線粒體膜電位降低。推測(cè)根皮素誘導(dǎo)SGC-7901凋亡與細(xì)胞凋亡線粒體途徑有關(guān)。

在正常細(xì)胞中，Ca2+主要與蛋白質(zhì)結(jié)合封存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體中，游離的 Ca2+很少，只是在收到外界刺激時(shí)才被釋放出來充當(dāng)信號(hào)分子。游離 Ca2+在細(xì)胞內(nèi)的過度積累可以直接導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生[12]。當(dāng)根皮素誘導(dǎo)SGC-7901細(xì)胞凋亡時(shí)，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)游離鈣離子濃度升高，Ca2+穩(wěn)態(tài)發(fā)生變化。結(jié)合線粒體膜電位降低的結(jié)果推測(cè)與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上鈣離子的釋放有關(guān)，但其具體的機(jī)制有待進(jìn)一步的研究。

根皮素通過抑制細(xì)胞DNA合成，降低線粒體膜和干擾鈣離子穩(wěn)態(tài)來誘導(dǎo) 胃癌細(xì)胞SGC-7901細(xì)胞凋亡。根皮素誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡及其機(jī)制有待進(jìn)一步探討。

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(編校：譚玲)

Effects of proliferation and apoptosis of phloretin on human gastric cancer cells SGC-7901

WANG Hui, WU Han-dong, LIU Zheng

(College of Food Science and Engineering, Liaoning Medical University, Jinzhou 121001, China)

ObjectiveTo investigate the proliferative and apoptotic effects of phloretin on gastric cancer cell andthe possible mechanisms.MethodsSGC-7901 were treated with different concentrations of phloretin(40,80,160 mg/L), and the cell morphological alterations were detected by using Hoechst33258 staining, cell activity were detected by MTT assay, cell apoptosis, cell cycle progression, mitochondrial trans-membrane potential and intracellular calcium homeostasis were detected by flow cytometry.ResultsAfter treated with different concentrations of phloretin at different times, SGC-7901 cell showed morphological alterations. Phloretin could inhibite the proliferation of SGC-7901 cell line, and induced its apoptosis in a dosage and duration dependent manner. Cell cycle was arrested at G1 phase, mitochondrial trans-membrane potential dropped, intracellular free Ca2+increased.Conclusionphloretin can induce apoptosis of SGC-7901 via arresting cell cycle progression, reducing mitochondrial trans-membrane potential and disturbing intracellular calcium homeostasis.

phloretin; gastric cancer cell; apoptosis; proliferation

王會(huì)，男，博士，講師，研究方向：細(xì)胞凋亡，E-mail: yxlwhx077@163.com。

R735.7

A

1005-1678(2015)08-0034-04