彭冉,李廷武
(河南省南陽醫(yī)學(xué)高等??茖W(xué)校第一附屬醫(yī)院 心臟外科,河南 南陽 473000)
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干細胞移植對缺血性二尖瓣關(guān)閉不全模型犬心肌組織SMA、bFGF、VEGF表達的影響
彭冉,李廷武
(河南省南陽醫(yī)學(xué)高等??茖W(xué)校第一附屬醫(yī)院 心臟外科,河南 南陽 473000)
目的 探討干細胞移植對缺血性二尖瓣關(guān)閉不全模型犬心肌組織中平滑肌肌動蛋白(smooth muscle actin,SMA)、堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表達的影響。方法 24只健康的雄性實驗犬,隨機選取6只為正常組,余18只建立二尖瓣關(guān)閉不全模型,模型成功后分為模型組5只、實驗組6只和對照組6只。實驗組向缺血心肌灌注2 mL干細胞懸液,對照組灌注等量不含干細胞的DMEM培養(yǎng)基。檢測各組犬的心功能、心肌組織SMA、bFGF、VEGF表達水平并進行分析。結(jié)果 與對照組及模型組相比較,實驗組心功能改善更為明顯,表現(xiàn)為心輸出量(cardiac output,CO)以及每搏輸出量(stroke volume,SV)顯著升高(P<0.05);心肌組織α-SMA含量明顯降低(P<0.05);心肌組織bFGF含量明顯升高(P<0.05);心肌組織VEGF含量明顯升高(P<0.05)。結(jié)論 干細胞移植能夠抑制缺血性二尖瓣關(guān)閉不全模型犬心肌組織中SMA表達,促進bFGF和VEGF表達,對心功能有改善作用。
干細胞移植;缺血性二尖瓣關(guān)閉不全;平滑肌肌動蛋白;堿性成纖維細胞生長因子;血管內(nèi)皮生長因子
缺血性二尖瓣關(guān)閉不全(mitral regurgitation,MR)是由于冠狀動脈硬化閉塞導(dǎo)致局部心肌缺血壞死,乳頭肌纖維化,彈性降低,左心室室壁運動異常而引起的,常繼發(fā)于冠心病、心肌梗死之后,缺血性二尖瓣關(guān)閉不全形成的病理生理機制較為復(fù)雜,與心室大小、形態(tài)、局部心肌/乳頭肌運動不協(xié)調(diào)、乳頭肌延長或斷裂等多種因素有關(guān)[1]。隨著社會老年齡化的加重,二尖瓣關(guān)閉不全(MR)的發(fā)病率逐漸上升。有報道顯示,65歲和75歲人群的MR發(fā)病率分別為6.4%和9.3%[2],嚴(yán)重威脅人們生命健康。目前MR的主要治療方式是外科手術(shù)[3],但是由于適應(yīng)癥少、死亡率高、術(shù)后易復(fù)發(fā)等原因,臨床效果并不理想,因此探索新的治療方式是醫(yī)學(xué)界研究的重點。干細胞移植是隨著細胞技術(shù)的不斷成熟出現(xiàn)的治療手段,研究顯示[4],體外誘導(dǎo)可向心肌樣細胞分化使人們看到了修復(fù)和再生受損心肌細胞的希望。干細胞可以被誘導(dǎo)分化成心肌細胞,修復(fù)受損的心肌組織,還能夠釋放相關(guān)細胞因子,抑制移植炎癥反應(yīng),促進血管形成,對于缺血性心肌病有療效。但是,關(guān)于干細胞移植治療MR的研究較少。因此,本研究旨在通過建立缺血性二尖瓣關(guān)閉不全犬模型,觀察干細胞移植對于其心功能、心肌組織中SMA、bFGF、VEGF的表達水平,研究干細胞移植對缺血性二尖瓣關(guān)閉不全的治療效果及作用機制。
1.1 實驗動物 24只健康雄性實驗犬[由鄭州大學(xué)實驗動物中心提供,許可證號:SCXK(豫)2005-0001],犬齡(8.2±1.6)月,體質(zhì)量(10.6±1.4)kg。犬均投喂以標(biāo)準(zhǔn)飼料,自由進食,室溫控制在15 ℃~24 ℃,濕度控制在55%~60%。
1.2 主要試劑和儀器 注射用硫噴妥鈉(上海新亞藥業(yè)有限公司,國藥準(zhǔn)字H31021847);DMEM培養(yǎng)基、蛋白裂解液、10%胎牛血清(北京諾亞杰生物科技有限公司);犬血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、犬堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、犬α平滑肌肌動蛋白(α-SMA) ELISA檢測試劑盒(上海彩佑實業(yè)有限公司);WA-820數(shù)字無創(chuàng)心功能檢測儀(天津萬安康泰醫(yī)療科技有限公司)。
1.3 造模及實驗方法 隨機選取6只犬作為正常組,給予正常喂養(yǎng);剩余18只犬,采用硫噴妥鈉進行全身麻醉,開胸,對左冠狀動脈前降支夾閉5 min,之后開放5 min,再關(guān)閉5 min,反復(fù)進行3次后將前降支結(jié)扎,閉合傷口。繼續(xù)正常飼養(yǎng)8周,通過超聲心動掃描儀觀察犬的心臟結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)二尖瓣中重度返流即為造模成功[5],本實驗僅1只犬在實驗過程中死亡,其余17只均造模成功。
在造模過程中,無菌條件下抽取實驗犬的骨髓液10 mL,離心,棄上清,在沉淀的骨髓細胞中加入2 mL DMEM培養(yǎng)基,加入分離液,離心后將細胞接種在含10%胎牛血清的培養(yǎng)基上進行傳代、培養(yǎng),并用10 μmol/L的5-溴脫氧尿嘧啶核苷(BrdU)標(biāo)記。
將造模成功的17只犬分為模型組5只、對照組6只和實驗組6只。模型組不予處置,對照組和實驗組實驗犬全身麻醉,暴露心臟,從左冠狀動脈前降支結(jié)扎點進針,實驗組向缺血心肌灌注2 mL干細胞懸液,對照組灌注等量不含干細胞的DMEM培養(yǎng)基懸液,觀察30 min后,逐層關(guān)閉傷口。術(shù)后給予各組實驗犬必要的抗感染措施,繼續(xù)飼養(yǎng)8周。
1.4 觀察指標(biāo)及檢測方法
1.4.1 心功能測定:移植完成8周后,采用心功能檢測儀測定各組實驗犬的心功能,包括心輸出量(CO)及每搏輸出量(SV)。
1.4.2 組織相關(guān)指標(biāo)檢測:全身麻醉后大動脈放血處死實驗犬,取心肌組織,將組織標(biāo)本剪碎,加入裂解液,放入勻漿器中進行反復(fù)勻漿,裂解30 min,隨后將勻漿液移入離心管,4 ℃12000 r/min離心5 min,取上清液,置于-20 ℃保存?zhèn)溆?。采用犬VEGF、bFGF、α-SMA ELISA檢測試劑盒(購于武漢博士的生物技術(shù)有限公司)測定各組犬組織中VEGF、bFGF、α-SMA的表達情況。
2.1 各組犬心功能比較 模型組、實驗組、對照組實驗犬的CO、SV均明顯低于正常組(P<0.05);對照組的CO、SV與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義;實驗組犬的CO、SV明顯高于對照組(P<0.05)。見表1。
表1 各組心功能比較±s)Tab.1 Comparison of the cardiac function of each ±s)
*P<0.05,與正常組相比,compared with normal group;#P<0.05,與對照組相比,compared with control group
2.2 各組犬心肌組織中α-SMA、bFGF、VEGF含量比較 模型組、實驗組、對照組犬心肌組織中α-SMA、bFGF、VEGF含量均明顯高于正常組(P<0.05);對照組犬心肌組織中α-SMA、bFGF、VEGF含量與模型組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義;實驗組犬心肌組織中α-SMA、bFGF含量明顯低于對照組(P<0.05),VEGF含量明顯高于對照組(P<0.05)。見表2。
表2 各組心肌組織中α-SMA、bFGF、VEGF含量比較Tab.2 Comparison of the content of α-SMA, bFGF and VEGF of each ±s)
*P<0.05,與正常組相比,compared with normal group;#P<0.05,與對照組相比,compared with control group
近年來,隨著我國冠心病的發(fā)病率不斷升高,缺血性心肌病作為冠心病的晚期階段,發(fā)病人數(shù)逐年增多,嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量,給患者帶來較大的痛苦。缺血性二尖瓣關(guān)閉不全(MR)是缺血性心肌病常見的類型,對于MR的治療,目前臨床上多采用瓣膜成形、瓣膜置換等外科手段,但由于缺血已經(jīng)引起心肌壞死,容易復(fù)發(fā),成功率并不高。因此,醫(yī)學(xué)界試圖尋找治療方式來修復(fù)受損心肌細胞,以防止心肌組織纖維化及心室重塑。干細胞移植是最有前景的研究方向,其能夠分化為心肌細胞,修復(fù)受損的心肌組織,還具有旁分泌作用,促進各類生長因子分泌,同時其免疫調(diào)節(jié)及抗炎作用也不容忽視[6]。有研究顯示[7],注射自體心臟干細胞能夠使心肌梗死后心力衰竭患者的左心室射血分?jǐn)?shù)增加,心室收縮功能提高,而且梗死面積亦相應(yīng)減少。但是,關(guān)于骨髓干細胞對MR的作用及機制的研究較少,因此,本研究試圖通過觀察干細胞移植對MR模型犬的作用,來觀察干細胞移植對MR的治療效果和作用機制。
本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),模型組、實驗組、對照組實驗犬的CO、SV 均明顯低于正常組(P<0.05),表明心肌梗死后二尖瓣關(guān)閉不全模型犬的心功能受損;實驗組犬的CO、SV 明顯高于對照組(P<0.05),表明干細胞移植能夠明顯改善模型犬的心功能。王祥森[9]報道,給豬心肌梗死模型注射單個骨髓干細胞,3周后左室射血分?jǐn)?shù)比原來高46%,血流速度也明顯增加,與本研究的結(jié)果一致。
α-SMA來自于心肌成纖維細胞,具有連接外纖維黏連蛋白的作用,引起組織的成纖維化,資料顯示,在正常心肌組織中,α-SMA表達較低,而在心肌受損時,分泌的細胞因子能夠促進α-SMA的分泌與表達[10],所以模型組犬心肌組織中α-SMA含量明顯高于正常組。本研究結(jié)果顯示,實驗組犬心肌組織中α-SMA含量明顯低于對照組[9],提示干細胞移植能夠抑制α-SMA的表達,阻止心肌纖維化過程,這可能與干細胞分化形成新的心肌細胞,修復(fù)受損組織,抑制細胞因子異常分泌有關(guān)。
bFGF是堿性成纖維生長因子,具有促進細胞分裂、趨化,以及促進微血管形成的作用,能夠促進修復(fù),心肌受損后,機體會通過提高bFGF的表達量進行修復(fù)。研究發(fā)現(xiàn),bFGF在心肌梗死后的心肌中表達增強[11],與本研究結(jié)果顯示的模型組犬心肌組織中bFGF含量明顯高于正常組相一致;通過干細胞移植后,實驗組犬心肌組織中bFGF含量明顯高于對照組(P<0.05),提示干細胞移植能夠進一步刺激bFGF的表達,促進心肌細胞增殖修復(fù),恢復(fù)心肌組織功能。
VEGF能特異性作用于血管內(nèi)皮,促進血管內(nèi)皮細胞分裂、增殖,有助于新生血管形成。資料顯示,與bFGF相似,心肌組織受損的缺血缺氧狀態(tài)亦可上調(diào)VEGF的表達[12],使得模型組犬心肌組織中VEGF含量明顯高于正常組(P<0.05);經(jīng)過干細胞移植治療,實驗組犬心肌組織中VEGF含量明顯高于對照組(P<0.05),表明干細胞能夠增強VEGF的表達,促進新生血管的形成,建立側(cè)支循環(huán),改善心肌梗死部位的缺血缺氧狀態(tài),滋養(yǎng)新生的心肌細胞,有助于心肌組織及心功能的恢復(fù)。
本實驗通過對缺血性二尖瓣關(guān)閉不全犬模型的建立,以及干預(yù)后心功能、心肌組織中SMA、bFGF、VEGF表達的分析,證實了干細胞移植能夠抑制缺血性二尖瓣關(guān)閉不全模型犬心肌組織中SMA表達,促進bFGF和VEGF表達,對心功能有改善作用。下一步將進行分子機制方面研究,進一步論證和分析本研究結(jié)論。
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(編校:譚玲)
Effect of stem cell transplantation on expression of SMA, bFGF and VEGF in myocardium of dogs with ischemic mitral regurgitation
PENG Ran, LI Ting-wu
(Department of Cardiac Surgery, The First Affiliated Hospital of Nanyang Medical College, Nanyang 473000, China)
ObjectiveTo analyze effect of stem cell transplantation on the expression of smooth muscle actin (SMA), basic fibroblast growth factor (bFGF) and vascular endothelial growth factor (VEGF) in the myocardium of dogs with ischemic mitral regurgitation.Methods24 healthy male experiment dogs were selected, 6 were collected randondy as normal group, the others were used to construct mitral regurgitation model. After that, the modelized dogs were divided into three groups, 5 dogs in model group, 6 dogs in experiment group and 6 in control group. The experimental group were given 2 mL stem cells suspension to ischemic myocardial, control group was infused without stem cells in DMEM medium, and then the SMA, bFGF and VEGF expression levels of myocardial tissues in each groups were detected and analyzed.ResultsCompared with control group and model group, the heart function of experiment group were improved more obviously, such as cardiac output (CO) and stroke volume (SV) increased significantly (P< 0.05). Myocardial α-SMA were significantly lower (P<0.05). bFGF contents in myocardial tissue increased significantly (P< 0.05). The content of VEGF in myocardial tissue significantly increased (P<0.05).ConclusionsStem cell transplantation can inhibit the expression of SMA in myocardium of ischemic mitral regurgitation, and promote the expression of bFGF and VEGF, has a better effect on heart function.
stem cell transplantation; ischemic mitral regurgitation; smooth muscle actin; basic fibroblast growth factor; vascular endothelial growth factor
彭冉,男,主治醫(yī)師, 研究方向:心臟外科及重癥監(jiān)護,E-mail:pengjiazidi@163.com。
R542.51
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1005-1678(2015)08-0055-03