趙彥朋，劉 峰，李艷軍，朱華國，張新宇，孫 杰

（1 石河子大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，新疆石河子832000；2 中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，北京100193）

植物油是食用油的重要來源，其脂肪酸組分的營養(yǎng)功能一直受到人們的重視。飽和脂肪酸會增加人體心血管疾病的發(fā)病幾率［1－2］；多不飽和脂肪酸易氧化不穩(wěn)定，在一般貯藏條件下易酸敗產(chǎn)生異味，在加熱過程中易形成自由基加速細(xì)胞老化，還易通過氫化作用生成反式脂肪酸，增加人體心血管疾病發(fā)病率［3－4］。單不飽和脂肪酸的油酸穩(wěn)定性高，能降低有害膽固醇（LDL），維持有益膽固醇（HDL）的水平；此外，富含油酸的食用油可長時間保存和高溫烹調(diào)而不易氧化變質(zhì)［5－7］。因此，高油酸含量的植物油不僅有益于人們的身體健康，也可有效延長產(chǎn)品的保質(zhì)期和貨架期。提高油酸的相對含量，已成為目前油料作物品質(zhì)改良的重要內(nèi)容［8－12］。

在植物種子脂肪酸合成代謝過程中，油酸在Δ12－油酸去飽和酶（FAD2）的作用下生成亞油酸；同時棕櫚酸等飽和脂肪酸又可在脂肪酸轉(zhuǎn)運體的?；D(zhuǎn)移酶B（FatB）的作用下轉(zhuǎn)運到胞質(zhì)中。酰基轉(zhuǎn)移酶（FatB）和Δ12－油酸去飽和酶（FAD2）的活性高低對作物種子油中飽和與不飽和脂肪酸的含量起著重要作用［13－14］。在種子發(fā)育過程中，這些酶的編碼基因分別是種子中高效表達(dá)的FAD2 與FatB基因。目前FAD2與FatB基因已在大豆（G．max）、棉花（G．hirsutum）、玉米（Z．mays）、花生（A．hypogaea）、油葵（H．a(chǎn)nnuus）、油菜（B．napus）和橄欖（O．europaea）等多種植物中分離得到［15－19］。由于RNA 干擾（RNAi）技術(shù)的高效、特異性等，應(yīng)用RNAi技術(shù)對作物種子的FAD2基因進(jìn)行調(diào)控，已先后獲得多不飽和脂肪酸含量低，油酸含量高的轉(zhuǎn)基因大豆、花生、油菜等［20－22］。另外，抑制FatB基因的表達(dá)水平，也獲得低飽和脂肪酸含量的轉(zhuǎn)基因芥花油［23］。如果同時降低種子油中多不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸的含量，從而提高油酸組分的含量，具有重要的實用價值。然而，通過同時抑制多基因的表達(dá)來改良種子油品質(zhì)的研究目前還少有報道。

煙草（NicotianatabacumL．）是遺傳轉(zhuǎn)化的模式植物，其轉(zhuǎn)化再生體系較為成熟。為了研究同步抑制脂肪酸合成關(guān)鍵酶基因FAD2與FatB的表達(dá)對種子脂肪酸組分的影響，本實驗以煙草為轉(zhuǎn)化材料，利用前期構(gòu)建的能同步抑制種子中FAD2 與FatB表達(dá)的RNAi載體［24］，在農(nóng)桿菌介導(dǎo)下進(jìn)行煙草遺傳轉(zhuǎn)化，對轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行分子檢測，同時測定分析煙草種子中各脂肪酸組分的含量，為進(jìn)一步改良油料作物品質(zhì)奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1．1 植物材料

煙草品系NC89的無菌試管苗（新疆兵團綠洲生態(tài)農(nóng)業(yè)重點實驗室提供），以MS為基本培養(yǎng)基，附加3%葡萄糖，0．8%瓊脂，pH 5．8，于28℃光下培養(yǎng)。

1．2 農(nóng)桿菌菌株、質(zhì)粒和主要試劑

試驗用根癌農(nóng)桿菌菌株（AgrobacteriumtumefaciensLBA4404），其含有棉籽脂肪酸合成關(guān)鍵酶FAD2與FatB雙基因融合片段的干擾載體pBISPFAD2－FatB（圖1）［24］，為新疆兵團綠洲生態(tài)農(nóng)業(yè)重點實驗室保存。

TaqDNA 聚合酶、植物組織總RNA 提取試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit等均購于大連寶生物（Takara）工程有限公司。PCR 的引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)Marker購自東盛生物（DSBIO）科技有限公司；抗生素利福平（Rif）、卡那霉素（Kana）、鏈霉素（Str）和頭孢霉素（Cef）為Sigma公司產(chǎn)品，其它試劑為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純和色譜純。

1．3 煙草的遺傳轉(zhuǎn)化

取－80℃冰箱內(nèi)保存的含有pBISP－FAD2－FatB質(zhì)粒的農(nóng)桿菌LBA4404菌液，在加入抗生素（50mg／L Kana，50mg／L Rif，50mg／L Str）的LB固體培養(yǎng)基上劃線，于28℃倒置暗培養(yǎng)2d，待平板上長出菌落后，挑取單菌落于20 mL LB 液體培養(yǎng)基中，于28℃、220r／min震蕩培養(yǎng)2d，離心，用40 mL MS 液體培養(yǎng)基中懸浮，加入終濃度為100 μmol／L乙酰丁香酮（AS），繼續(xù)培養(yǎng)2～3h，用于浸染。

圖1 植物表達(dá)載體pBISP－FAD 2－FatB 結(jié)構(gòu)示意圖Fig．1 Structure of plant expression vector pBISP－FAD 2－FatB

煙草轉(zhuǎn)化采用葉盤法［25］。將無菌煙草苗植株的葉片剔除葉脈和葉緣部分后剪成小方塊，大小為1．0cm×1．0cm 的小塊，浸入制備好的農(nóng)桿菌菌液中，浸染10min。取出葉盤后，用菌濾紙吸干菌液，將葉盤背光面朝下平放在墊有濾紙的MS共培養(yǎng)基上，置于20℃暗培養(yǎng)［26］。2d后轉(zhuǎn)移至選擇培養(yǎng)基（MS＋2mg／L 6－BA＋0．2mg／L IAA＋100mg／L Kana＋400 mg／L Cef），于25℃、14h 光照培養(yǎng)。約4周后，切下幼芽插入生根培養(yǎng)基（MS＋6mg／L 6－BA＋50mg／L Kana＋200mg／L Cef），于25℃、14h光照條件下誘導(dǎo)生根，獲得抗性煙草植株。洗凈根部培養(yǎng)基，清水煉苗后轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)土中種植。

1．4 轉(zhuǎn)基因煙草的PCR 檢測

使用大連寶生物（Takara）工程有限公司的植物基因組DNA 提取試劑盒，提取對照與轉(zhuǎn)化抗性煙草植株的基因組DNA；以特異性引物RNAi2－F（5′－AAATCCCAAATACCAGAG－3′）和RNAi2－R（5′－GAACAATCTTCCCTATGC－3′），PCR擴增FAD2－1與FatB雙基因融合片段的部分序列（701bp）；檢測轉(zhuǎn)基因植株。PCR 擴增體系為10×ExTaqPCR緩沖液2．5μL，dNTP混合物（2．5mmol／L）2μL，RNAi2－F（10μmol／L）與RNAi2－R（10μmol／L）各1μL，煙草基因組DNA 2μL，ExTaq（5U／μL），加雙蒸水至25μL。擴增條件為94℃預(yù)變性5min；然后94℃變性1min，56℃退火1min，72℃延伸1 min，共35個循環(huán)，72℃延伸10min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電泳，在紫外凝膠成像系統(tǒng)中觀測目的條帶。

1．5 煙草FAD 2與FatB 的表達(dá)水平分析

將PCR 驗證的陽性植株種植培養(yǎng)，收獲T0代煙草種子，用含有100mg／L Kana的MS培養(yǎng)基篩選獲得T1代轉(zhuǎn)化植株。將T1代轉(zhuǎn)基因植株種植到培養(yǎng)土中，在種子發(fā)育中后期，收獲T1代種子，采用植物組織總RNA 提取試劑盒（Takara），提取煙草種子總RNA。使用GeneQuantTM1300 分光光度計（Biochrom Ltd）對提取的總RNA 進(jìn)行定量；利用PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit（Takara）將1μg總RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板，qRT－PCR 分別檢測煙草種子FAD2與FatB基因的mRNA 表達(dá)水平。以煙草Ubiquitin基因做內(nèi)參，內(nèi)參引物為Ubi－F（5′－CCGTCTCCGTGGTGGTATG－3′）和Ubi－R（5′－GGCCGTCTTCAAGTTGCTT－3′）；煙草FAD2與FatB的檢測引物分別為FAD－F（5′－GGAGTTCTTGGAGCAGGTT－3′）和FAD－R（5′－CGTTCACGATTAGGAGGG－3′）；FatB－F（5′－GGGGCTCAATGCTAAGAAG－3′）和FatB－R（5′－CCATCCATAACGCCTACCT－3′）。反應(yīng)體系共10 μL，包含SYBRPremixExTaqTMⅡ（2×）5μL，上下游引物（10μmol／L）各0．5μL，模板1μL，無菌水3 μL。每個樣品設(shè)置3次重復(fù)。反應(yīng)條件95℃預(yù)變性5min，95℃變性15s，60℃退火15s，72℃延伸15s，45個循環(huán)。

1．6 種子總油脂提取和脂肪酸組分測定

用液氮將種子研磨成粉，取20mg裝入10mL離心管中，在冰浴中用超聲波細(xì)胞破裂儀破裂細(xì)胞30min；在離心管中加入6 mL 氯仿－甲醇（體積比2∶1）混合溶劑，在40℃、200r／min搖床上處理4 h后，6 000r／min離心10min，然后吸取下層油脂相層于恒重的醫(yī)用玻璃瓶中，在32℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干。25℃真空干燥箱中干燥2h（至恒重），稱重，計算油脂含量。將提取的總油脂置于10mL具塞試管中，加入2mL 1mol／L KOH－甲醇溶液，60℃水浴皂化30min，加入4mL 1mol／L鹽酸－甲醇溶液，60℃水浴甲酯化30min，取出至室溫。加入2mL 正己烷，充分振搖，靜置，吸取上層正己烷甲酯相至2mL小離心管，用少量無水Na2SO4脫水后，用氣相色譜（GC－MS）測定樣品中主要脂肪酸組分的相對含量。GC－MS 分析條件為：色譜柱HP－5MS 19091S－436（60m×250μm×0．25μm）；進(jìn)樣量1μL，分流進(jìn)樣方式，分流比50∶1；進(jìn)樣口溫度250℃；載氣Ne，50mL／min。程序升溫：150℃下保持1min；然后以10℃／min的速率升至180℃，保持5min；以3℃／min 的速率升至230℃，保持15min；再以3℃／min的速率升至270℃，保持20 min。

2 結(jié)果與分析

2．1 煙草的遺傳轉(zhuǎn)化與植株的PCR檢測

采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草遺傳轉(zhuǎn)化，在選擇培養(yǎng)1周左右，葉片周圍開始膨脹，2周左右開始出現(xiàn)胚芽，4周左右開始長出幼芽。將幼芽轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上進(jìn)行誘導(dǎo)生根培養(yǎng)，2周左右出現(xiàn)較豐富的根系。清水洗凈根部培養(yǎng)基，在水中煉苗2d，然后移栽至培養(yǎng)土中種植培養(yǎng)（圖2）。

經(jīng)過Kana抗性篩選，共獲得9 株抗性煙草植株，提取煙草植株基因組DNA，以特異性引物進(jìn)行PCR 擴增，檢測獲得5株陽性轉(zhuǎn)基因植株（圖4）。

圖2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草遺傳轉(zhuǎn)化Fig．2 Genetic transformation of tobacco mediated by Agrobacterium tumefaciens

圖3 T0 代煙草種子的Kana篩選結(jié)果Fig．3 Screening results of T0seed

圖4 煙草植株葉片PCR 檢測雙基因靶標(biāo)片段Fig．4 Detection of target gene in control and transgenic tobacco leaves by PCR

圖5 T1 代煙草基因組DNA 的PCR 驗證結(jié)果Fig．5 PCR validation of T1transgenic tobacco genomic DNA

2．2 轉(zhuǎn)基因煙草種子qRT－PCR分析

收獲PCR 檢測陽性的轉(zhuǎn)基因煙草T0代種子，用20%次氯酸鈉消毒10min，在100mg／L Kana選擇培養(yǎng)基上篩選得到抗性幼苗（圖3）。將抗性苗移至培養(yǎng)土中種植，正常生長18株，提取所有T1代煙草植株的基因組DNA 進(jìn)行PCR 驗證，結(jié)果顯示均為陽性轉(zhuǎn)基因植株（圖5）。

轉(zhuǎn)基因煙草T1代植株及對照在開花后25d左右，即煙草種子形成中后期，按照試劑盒說明書隨機提取2株煙草種子總RNA（圖6），反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并進(jìn)行qRT－PCR 分析。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因植株種子中2個基因表達(dá)水平均受到一定程度抑制。與對照相比，轉(zhuǎn)基因煙草種子中FAD2和FatB的表達(dá)水平分別降低了23%和11%（圖7）。

2．3 煙草種子脂肪酸組分及含量檢測

圖6 T1 代煙草種子總RNAFig．6 RNA extraction of T1generation seeds

圖7 煙草種子中FAD 2與FatB 的qRT－PCRFig．7 qRT－PCR analysis of FAD 2and FatB in tobacco seeds

圖8 煙草種子脂肪酸甲酯的氣相色譜圖Fig．8 GC／MS analysis of fatty acid methyl ester of tobacco seeds

圖9 轉(zhuǎn)基因與野生煙草種子油酸含量對比Fig．9 The content of oleic acids of transgenic compared with the wild tobacco seeds

分別提取對照和進(jìn)行qRT－PCR檢測的2株轉(zhuǎn)基因煙草種子的脂肪酸，進(jìn)行甲酯化處理并用氣相色譜測定煙草種子脂肪酸組分和含量，重復(fù)3 次。結(jié)果顯示（圖8），煙草種子中主要含有4種脂肪酸，分別為棕櫚酸（C16∶0）、硬脂酸（C18∶0）、油酸（C18∶1）和亞油酸（C18∶2）。

氣相色譜測定表明，在轉(zhuǎn)基因植株種子的脂肪酸組分中，飽和脂肪酸棕櫚酸（C16∶0）和硬脂酸（C18∶0）含量分別為8．02%和4．45%，多不飽和脂肪酸亞油酸（C18∶2）含量為76．82%，而對照種子的C16∶0、C18∶0和C18∶2的平均含量分別為8．26%、4．94%和79．58%，與對照相比都存在不同程度的降低。轉(zhuǎn)基因植株中油酸（C18∶1）組分的含量最高達(dá)7．48%，而對照種子種油酸含量為5．11%，比對照提高46．38%（圖9）。

3 討 論

隨著社會的發(fā)展，人們的生活水平有了很大提高，也越來越提高了對健康的需求。棉籽油是中國第四大植物食用油。棉籽油中飽和脂肪酸與多不飽和脂肪酸含量偏高，因此改良棉籽油的營養(yǎng)品質(zhì)，具有重要的實用價值。在植物種子脂肪酸合成代謝過程中，Δ12－油酸去飽和酶基因（FAD2）是控制油酸向亞油酸轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵酶基因，直接決定了植物中多不飽和脂肪酸的含量與比例。另外，植物脂肪酸合成途徑中，飽和脂肪酸又可在脂肪酸轉(zhuǎn)運體酰基轉(zhuǎn)移酶B（FatB）的作用下轉(zhuǎn)運到胞質(zhì)中。抑制FatB基因的表達(dá)，在一定程度上可以降低飽和脂肪酸的含量，從而也有利于油酸的合成。然而，同時降低油料作物種子中多不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸的含量，進(jìn)而提高油酸的含量的研究目前仍然報道較少。

多元載體構(gòu)建及其遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)是保證多個基因代謝途徑協(xié)調(diào)表達(dá)有效技術(shù)方案［27－28］。在先前的研究中，成功地構(gòu)建了針對棉花2 個靶標(biāo)基因FAD2與FatB的RNAi載體［24］，為了研究同步抑制FAD2與FatB基因?qū)γ拮延椭兄舅岣鹘M分的影響，本研究首先對模式植物煙草進(jìn)行了遺傳轉(zhuǎn)化，并對轉(zhuǎn)基因煙草種子的脂肪酸組分進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因煙草種子中飽和脂肪酸以及多不飽和脂肪酸含量都有所降低，油酸含量有極顯著的提高（提高了46．38%）。說明同步抑制FAD2 和FatB基因表達(dá)對煙草種子的脂肪酸組分的含量有較大影響，這也為進(jìn)一步研究同步抑制FAD2 和FatB基因的表達(dá)改良棉籽油的品質(zhì)提供了理論和實踐基礎(chǔ)。

本研究結(jié)果也顯示，在同步抑制了脂肪酸合成關(guān)鍵酶基因表達(dá)后，煙草種子的脂肪酸各組分含量出現(xiàn)不同程度的變化，但是與油菜等作物上的研究報道相比［23－25］，油酸含量并沒有出現(xiàn)倍數(shù)性的提高。而且多不飽和脂肪酸C18∶2的含量還處于較高水平。推測可能是由于棉花的FAD2與FatB基因與煙草的FAD2與FatB基因的同源性所引起的。在本研究中，2個靶標(biāo)基因片段均來自棉花，與煙草的一致性低于50%，較低的同源性降低了RNAi的效果。然而，本研究從另一方面也表明了RNAi技術(shù)改良作物油份品質(zhì)的可行性，說明通過調(diào)控植物中脂肪酸的代謝途徑來同時降低飽和脂肪酸與多不飽和脂肪酸，進(jìn)而提高油酸在種子中的含量具有很大的發(fā)展前景。本研究驗證了同步抑制雙基因表達(dá)對煙草種子脂肪酸油分含量的影響，但對同步抑制FAD2與FatB基因表達(dá)改良棉籽油等油料作物品質(zhì)還需要進(jìn)一步研究。

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