畢研飛，郭 靜，徐兵劃，張永兵，伊鴻平，錢春桃＊，陳勁楓

（1 南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京210095；2 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院 哈密瓜研究中心，烏魯木齊830000）

蔓枯?。╣ummy stem blight）又稱黑腐病，是影響瓜類蔬菜生產(chǎn)的重要病害之一，它可以危害甜瓜、黃瓜、西瓜、西葫蘆等作物，大田發(fā)病率可達(dá)20%～30%，在連作地或溫室高達(dá)80%，病害嚴(yán)重的年份常常會造成毀滅性減產(chǎn)［1－5］。目前，生產(chǎn)上防治蔓枯病的常用方法是化學(xué)防治，但化學(xué)防治效率低、易造成環(huán)境污染。另外，在公眾食品安全意識日益強(qiáng)化的社會背景下，使用化學(xué)農(nóng)藥防治蔓枯病的方法已經(jīng)越來越不適宜現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。因此，篩選抗病資源具有重要的生態(tài)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

國內(nèi)外針對瓜類蔓枯病抗病資源鑒定的研究較多，篩選獲得了多份抗病材料。戴富明等［6］對20份來自美國和中國的西瓜品種進(jìn)行人工接種抗病性鑒定，發(fā)現(xiàn)從美國引進(jìn)的AG、AS、AJ對蔓枯病的抗性較強(qiáng)。王曉東等［7］對新疆17個(gè)哈密瓜品種進(jìn)行抗蔓枯病鑒定，篩選到‘新蜜雜1號’和‘新蜜19號’2個(gè)抗蔓枯病品種。李英等［8］從26份黃瓜材料中篩選出4份（酸黃瓜、‘朝優(yōu)3號’以及2個(gè)酸黃瓜回交后代HH1－8－57和HH1－8－2）對蔓枯病有較高抗性的材料。Wehner等［9］對田間851個(gè)黃瓜品系進(jìn)行蔓枯病抗性鑒定，獲得PI200815、AR79－75 和Transamerica等9 個(gè)高抗品系。Molly Jahn 等［10］通過田間和溫室接種鑒定了798份甜瓜資源，并從中篩選出4 份高抗材料（PI157082、PI511890、PI482398、PI483399）。Gusmini等［11］通過接種鑒定篩選出了PI279461、PI482379和PI254744等10個(gè)抗病西瓜種質(zhì)。

蔓枯病病原菌［Didymellabryoniae（Auersw）］存在生理小種的分化，若品種僅攜帶單個(gè)抗病基因，則會導(dǎo)致其抗性降低甚至失去抗性［12－14］。相關(guān)研究表明，不同抗性基因的聚合有助于提高作物的抗性和抗譜［15－18］。因此選育聚合抗源是提高甜瓜抗蔓枯病的有效途徑之一。然而，有關(guān)甜瓜不同聚合抗源抗性的鑒定及篩選還鮮見報(bào)道?？孤莶』騊AL的表達(dá)與植物的抗病性密切相關(guān)，當(dāng)植物受到病原菌侵染時(shí)PAL被誘導(dǎo)表達(dá)，以提高植物的抗性，且其表達(dá)時(shí)間和表達(dá)量與植物抗性呈正相關(guān)［19－22］。但目前關(guān)于甜瓜PAL的研究較少，且主要集中從生理生化角度研究不同誘導(dǎo)條件下其酶活性變化，而從分子水平進(jìn)行甜瓜PAL基因在蔓枯病菌脅迫條件下表達(dá)特性的研究還未見報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)通過對5份單基因抗源和6份聚合抗源材料進(jìn)行甜瓜苗期蔓枯病菌的梯度接種鑒定，并利用RT－PCR技術(shù)對抗蔓枯病基因PAL在不同抗性材料中的差異表達(dá)進(jìn)行分析。旨在篩選抗性顯著提高的聚合抗源，揭示其抗性提高的相關(guān)分子機(jī)制，為甜瓜抗蔓枯病聚合育種提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1．1 甜瓜抗源材料和接種菌株

5份甜瓜單基因抗源材料PI140471、PI157082、PI511890、PI482398 和PI420145，分別含有抗病基因Gsb－1、Gsb－2、Gsb－3、Gsb－4［10］和Gsb－6［23］，其 中PI140471、PI157082、PI511890和PI482398由美國康乃爾大學(xué)Molly John教授提供，PI420145是由本課題組的Joseph 等篩選得到，并命名為Gsb－6。6份聚合基因材料分別由5份單基因抗源雜交并結(jié)合相關(guān)分子標(biāo)記篩選獲得：082－890（PI157082×PI511890）、082－398（PI157082×PI482398）、145－471（PI420145×PI140471）、145－082（PI420145×PI157082）、145－890（PI420145×PI511890）和890－398（PI511890×PI482398）。感病品種‘白皮脆’，由項(xiàng)目合作單位新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。

2013年春季（3月10號）、秋季（8月1號）在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)人工氣候室內(nèi)進(jìn)行育苗。將種子消毒、浸種后，28℃催芽，挑選飽滿、整齊一致的播種于72 孔穴盤中。育苗期間平均晝／夜溫度為24℃～28℃／17℃～19℃，光合有效輻射500μmol·m－2·s－1，相對濕度維持在60%～70%。待幼苗第一片真葉展平時(shí)，挑選長勢較好且一致的植株移栽至12cm×10cm×8cm（口徑／底徑／高）營養(yǎng)缽中，每缽1株?；|(zhì)由草炭、蛭石（V∶V＝1∶1）混合而成。

試驗(yàn)用蔓枯病菌為本實(shí)驗(yàn)室分離純化并保存的A 型菌株，參照李英等［24］的方法進(jìn)行產(chǎn)孢培養(yǎng)。用解剖針挑取菌絲接種于PDA培養(yǎng)基平板的中央，經(jīng)25℃黑暗培養(yǎng)7d后，再在40 W 紫外燈下30 cm 間歇照射4d（12h紫外／12h黑暗）產(chǎn)生孢子。在顯微鏡下利用血球計(jì)數(shù)板將分生孢子懸浮液配成5×105個(gè)／mL、5×107個(gè)／mL 和5×109個(gè)／mL備用。

表1 防衛(wèi)基因表達(dá)分析的引物序列及產(chǎn)物大小Table 1 Primer sequences and product sizes by expression analysis of defense genes

1．2 試驗(yàn)方法

1．2．1 苗期梯度接種鑒定 完全隨機(jī)設(shè)計(jì)，試驗(yàn)材料分為A、B、C 等3組，每組每份材料35株，均種植于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院牌樓試驗(yàn)基地溫室內(nèi)。參照Zhang等［12］的方法，待幼苗長到3～4片真葉時(shí)進(jìn)行人工噴霧接種，用微型噴霧器對3組分別噴灑濃度為5×105、5×107和5×109個(gè)／mL 的蔓枯病病菌孢子懸浮液。接種后覆蓋塑料棚膜遮光密閉，相對濕度保持92%～95%，溫度23℃～27℃，3d后揭開棚膜，于7和10d調(diào)查統(tǒng)計(jì)病情。

葉片侵染分級標(biāo)準(zhǔn)：0級．無可見侵染；1級．老葉上邊緣壞死或斑點(diǎn)＜10 mm，新葉無??；2 級．老葉同上，新葉邊緣壞死；3級．所有葉均有感染，葉壞死面積＜25%；4級．葉壞死面積＞25%，≤50%；5級．葉壞死面積＞50%。

根據(jù)平均病情級別數(shù)（RI）確定蔓枯病抗性級別：高抗（HR）．RI＜1．0；抗（R）．1．0≤RI＜2．0；中抗（MR）．2．0≤RI＜3．0；感（S）．3．0≤RI＜4．0；高感（HS）．RI≥4．0。平均病級計(jì)算公式：

RI＝∑（級值×株數(shù)）／總株數(shù)

根據(jù)接種鑒定結(jié)果，選取能準(zhǔn)確區(qū)分聚合基因材料和單基因抗源材料抗性差異的接種濃度進(jìn)行再次苗期接種，并于接種后0、12、24、48、72h，及5和7d取樣，樣品取后立即放入液氮速凍，置于－70℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆?。每一時(shí)間點(diǎn)的樣品進(jìn)行3次獨(dú)立生物學(xué)重復(fù)。

1．2．2 引物設(shè)計(jì)、RNA 提取和cDNA 合成 從GenBank中（http：／／www．ncbi．nlm．nih．gov／）搜索苯丙氨酸解氨酶基因［C．melo（cantaloupe）pal mRNA］的mRNA 序列，利用Primer 6．0軟件設(shè)計(jì)引物并由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成，內(nèi)參基因參照Islam El－Sharkawy［25］（表1）。利用RNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司）提取總RNA，并用DNaseⅠ除去基因組DNA。利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara公司）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA 用于基因的特異性表達(dá)分析，方法參照試劑盒說明書。

1．2．3 mRNA 的RT－PCR 擴(kuò)增利用SYBR Green試劑盒（Takara 公司）進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 分析。25μL 反應(yīng)體系為SYBR? Premix（2×）12．5μL，上下游引物（2．5μmol·L－1）各0．8 μL，cDNA 1．0μL，ddH2O 9．9μL，每個(gè)樣本進(jìn)行3次技術(shù)重復(fù)。RT－PCR反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5s，60℃退火20s，65℃延伸30s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，在65℃延伸步驟收集熒光信號。最后，采用2－ΔΔCT 法進(jìn)行相對定量數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2．1 不同抗性基因聚合后的抗病表現(xiàn)

不同抗性植株春、秋季的病級統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表2，當(dāng)接種濃度為5×105個(gè)／mL 時(shí)，只有感病品種‘白皮脆’出現(xiàn)病癥，單基因抗源和聚合抗源都無發(fā)病癥狀。當(dāng)接種濃度為5×107個(gè)／mL 時(shí)，PI157082 平均病級（RI）為2．0，表現(xiàn)為中抗，其他單基因抗源RI為1．3～1．6 之間，表現(xiàn)為抗，而聚合抗源145－471、082－890、890－398和082－398的平均病級RI＜1．0，表現(xiàn)為高抗。當(dāng)接種濃度為5×109個(gè)／mL時(shí)，不同抗源出現(xiàn)不同等級的病癥，其中單基因抗源PI420145與PI140471 的平均病級分別為3．0～3．6，表現(xiàn)為感病，而聚合抗源145－471（PI420145×PI140471）的平均病級為0．39～0．51，仍表現(xiàn)為高抗，抗性顯著高于單基因抗源親本。

2．2 防衛(wèi)基因的表達(dá)分析

選取抗病基因聚合后抗性顯著提高的聚合抗源145－471（PI420145× PI140471）、單 基 因 抗 源PI420145、PI140471和感病品種‘白皮脆’為材料，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real－time PCR）技術(shù)，以Cm－Actin為內(nèi)參基因，分析PAL基因在甜瓜幼苗根（圖1，A）、莖（圖1，B）、葉（圖1，C）中的表達(dá)情況。結(jié)果表明，PAL在根、莖、葉中均有表達(dá)，但表達(dá)存在一定差異，在葉中表達(dá)較高，根和莖中表達(dá)較低。

表2 接種鑒定結(jié)果統(tǒng)計(jì)（RI）Table 2 Estimation of disease rating（RI）

圖1 蔓枯病菌脅迫下PAL 在不同抗性甜瓜根（A）、莖（B）和葉（C）中的表達(dá)Fig．1 Expression of PALin root（A），stem（B）and leaf（C）under gummy stem blight stress

接種后，‘白皮脆’根中PAL的表達(dá)在12～48 h內(nèi)變化不大，72h時(shí)快速下降，5d時(shí)降至最低，但仍高于對照，為對照的1．1倍，7d時(shí)有所上調(diào)，但仍低于72 h 的表達(dá)量；單基因抗源PI420145、PI140471和聚合抗源145－471根中PAL表達(dá)的變化趨勢基本一致，都在48h時(shí)達(dá)到最高峰，但峰值卻不同，145－471分別為PI420145 和PI140471 的1．5倍和1．38倍。不同抗性材料莖中PAL表達(dá)變化趨勢基本一致，先上調(diào)，24h時(shí)達(dá)到最高峰，然后下調(diào)，但變化幅度具有明顯差異。莖中表達(dá)量達(dá)到最高峰時(shí)（24h），‘白皮脆’、PI420145、PI140471和145－471分別為對照的3倍、4．44倍、4．59倍和4．9倍。聚合抗源145－471葉片中PAL表達(dá)在12h時(shí)達(dá)到最高峰，為對照的9．3 倍，而‘白皮脆’、PI420145和PI140471在24h時(shí)達(dá)到最高峰，分別為對照的25倍、14．2 倍和12 倍。接種后，不同抗性甜瓜中PAL的表達(dá)量均高于對照，且與感病品種白皮脆相比，抗源中的表達(dá)量始終相對較高。

3 討 論

傳統(tǒng)的甜瓜抗蔓枯病苗期接種鑒定孢子液濃度為5×105個(gè)／mL，可以有效區(qū)分出抗、感材料的差異，但不能準(zhǔn)確區(qū)分抗性材料之間的差異［12，26］。本研究利用3個(gè)蔓枯病病菌濃度（5×105、5×107和5×109個(gè)／mL）進(jìn)行梯度接種鑒定實(shí)驗(yàn)，以準(zhǔn)確鑒定單基因抗源與聚合抗源以及不同聚合抗源之間的抗性能力的差異。結(jié)果表明，單基因抗源對不同蔓枯病菌表現(xiàn)出一定程度的選擇性抗性，而聚合抗源卻一直表現(xiàn)為抗病，說明聚合基因可以提高甜瓜的抗性與抗譜，這與Matsumoto等［16］在黃瓜方面以及朱明濤等［17］在番茄方面的研究結(jié)果相一致。另外，不同聚合抗源之間的抗性表現(xiàn)也存在一定差異，145－471對不同濃度病原菌抗性表現(xiàn)基本一致，均為 高 抗。145－082、145－890、082－890、082－398 和890－398對不同濃度表現(xiàn)選擇性抗性，當(dāng)接種濃度為5×105個(gè)／mL 時(shí)均表現(xiàn)為高抗，5×107個(gè)／mL時(shí)，082－890、082－398和890－398表現(xiàn)高抗，145－082和145－890表現(xiàn)為抗；5×109個(gè)／mL 時(shí)，聚合抗源082－890、082－398 和890－398 表現(xiàn)為抗，而145－082和145－890表現(xiàn)為中抗。本研究篩選到的聚合抗源145－471可作為甜瓜優(yōu)質(zhì)、抗病和高產(chǎn)育種重要的中間材料，為獲得新的高抗甜瓜品種（系）奠定了基礎(chǔ)。

基因表達(dá)分析表明，防衛(wèi)基因PAL在甜瓜不同組織均有表達(dá)，葉片的表達(dá)量最高，其次是莖，而根中的表達(dá)量比較低。接種蔓枯病菌后，不同抗性甜瓜及不同組織中PAL表達(dá)量變化存在明顯差異。聚合抗源145－471葉片中PAL基因表達(dá)量在12h 時(shí)達(dá)到最高峰，而單基因抗源PI420145 和PI140471葉片中PAL基因表達(dá)的最高峰在24h。不同抗性甜瓜莖中PAL基因的表達(dá)在24h時(shí)均達(dá)到最高峰，而根PAL基因在12～24h表達(dá)變化幅度較小。由此可知，甜瓜幼苗對蔓枯病菌侵染的時(shí)空響應(yīng)或適應(yīng)性存在一定差異。防衛(wèi)基因PAL表達(dá)量在接種后呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，且后期有所波動。這可以有效避免基因表達(dá)產(chǎn)物的過度積累而對植株自身造成損害，同時(shí)還可降低病原菌的適應(yīng)性，與王紅英等［27］在甜瓜和繆衛(wèi)國等［28］在棉花上從生理生化方面研究酶活性變化的趨勢基本一致。

本研究首次在轉(zhuǎn)錄水平上研究PAL與甜瓜蔓枯病抗性的關(guān)系，聚合抗源145－471中PAL基因的表達(dá)量高于或表達(dá)時(shí)間早于單基因抗源PI420145和PI140471，在一定程度上揭示了甜瓜聚合抗源抗性提高的原因。RT－PCR 方法分析PAL轉(zhuǎn)錄水平與研究PAL酶活性相比，方法簡單、快捷、準(zhǔn)確，為進(jìn)一步研究PAL與甜瓜抗病性的關(guān)系提供了技術(shù)和理論支持。另外，與感病品種‘白皮脆’相比，抗病材料中PAL基因的表達(dá)量始終相對較高，表明PAL與甜瓜蔓枯病抗性有密切關(guān)系，其表達(dá)量可作為甜瓜前期蔓枯病抗性鑒定的重要參考指標(biāo)。

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