杜 馳，張富春

（新疆大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆生物資源基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊830046）

植物生長過程中會(huì)因?yàn)闇囟?、紫外照射、高鹽等外界脅迫因素而產(chǎn)生DNA 損傷，并誘導(dǎo)許多DNA損傷修復(fù)基因表達(dá)［1］。DNA 損傷有多種形式，其中最嚴(yán)重的DNA 損傷形式是DNA 雙鏈斷裂（doublestand break，DSB），DSB損傷及時(shí)修復(fù)會(huì)導(dǎo)致染色體斷裂及細(xì)胞死亡［2］。DSB修復(fù)需要雙鏈斷裂修復(fù)基因的參與，而DNA 損傷修復(fù)基因Dmc1（disrupted meiotic cDNA）則發(fā)揮重要的作用。例如植物在外界脅迫下會(huì)出現(xiàn)減數(shù)分裂障礙，聯(lián)會(huì)復(fù)合體相關(guān)基因表達(dá)發(fā)生變化時(shí)，聯(lián)會(huì)復(fù)合體形成受阻［3］，這與DNA 損傷修復(fù)基因dmc1突變體的表型相似［4－5］。

研究發(fā)現(xiàn)，損傷修復(fù)蛋白Dmc1定位于第一次減數(shù)分裂前期Ⅰ的偶線期，是同源染色體配對(duì)和交叉重組所必需的［6］。Dmc1聚合到斷裂雙鏈中的單鏈DNA 3′末端尾巴上，結(jié)合非斷裂同源雙鏈DNA，通過同源重組幫助同源染色體聯(lián)會(huì)配對(duì)，參與雙鏈斷裂修復(fù)重組［7］。近年來，已從酵母、人、鼠、擬南芥等生物中克隆獲得Dmc1基因，人與酵母Dmc1基因功能相似［8］，Dmc1 缺失會(huì)阻止同系物之間的相互作用，dmc1突變體喪失重組功能；鼠Dmc1是減數(shù)分裂同源染色體聯(lián)會(huì)所必需的［9］；擬南芥dmc1突變體的同源染色體不能配對(duì)形成二價(jià)體［10］。這說明Dmc1是修復(fù)DNA 損傷斷裂，維持雙鏈正常復(fù)制、減數(shù)分裂的有序進(jìn)行，抵御外界逆境脅迫，維持植物正常生長的重要調(diào)控因子。

鹽穗木（Halostachyscaspica）隸屬于藜科（Chenopodiaceae）鹽穗木屬（Halostachys），生長于干旱荒漠鹽堿地，對(duì)鹽分適應(yīng)性極強(qiáng)，是新疆主要的鹽土荒漠植物之一，其莖、葉發(fā)育成肉質(zhì)化同化枝，以減少水分的散失，成為典型的耐鹽植物［11－12］。根據(jù)實(shí)驗(yàn)室以RNA－seq測(cè)序技術(shù)進(jìn)行的鹽穗木鹽脅迫響應(yīng)的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序［13］分析，發(fā)現(xiàn)在鹽脅迫條件下，鹽穗木同化枝和根中DNA 損傷應(yīng)激通路中相關(guān)基因表達(dá)差異明顯，提示DNA 損傷修復(fù)的相關(guān)基因可能與鹽脅迫具有密切相關(guān)性。本研究從鹽脅迫下轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中，篩選到了DNA 損傷修復(fù)基因HcDmc1，并對(duì)其進(jìn)行克隆和生物信息學(xué)分析，探討不同鹽濃度脅迫下鹽穗木DNA 損傷修復(fù)基因HcDmc1在不同時(shí)間點(diǎn)和不同組織的表達(dá)變化規(guī)律，為深入研究DNA 損傷修復(fù)基因HcDmc1在鹽穗木的耐鹽調(diào)控機(jī)理中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1．1 實(shí)驗(yàn)材料

鹽穗木種子采于五家渠103 團(tuán)野外鹽堿地（87．31°E，44．29°N）。播種于鋪有基質(zhì)（珍珠巖∶蛭石∶花土＝1∶1∶3，用雙子葉植物營養(yǎng)液拌濕）花盆中，在（24±2）℃，光照350μmol·m－2·s－1，晝／夜16h／8h，相對(duì)濕度為40%～60%條件下，并施以1／4 MS培養(yǎng)液培養(yǎng)120d左右。

1．2 鹽穗木的鹽脅迫處理

選取生長4個(gè)月左右的鹽穗木幼苗，置于100、300、500和700mmol／L NaCl溶液進(jìn)行處理，處理前48～72h在托盤中加自來水去除干旱脅迫因素。待托盤中自來水吸凈無多余水分，將不同濃度NaCl溶液分別淋澆在基質(zhì)上，直至溶液充滿基質(zhì)淋出于托盤。將花盆置于處理前的培養(yǎng)環(huán)境，分別于各處理濃度下0、24和72h，以及7 和14d采樣。

1．3 總RNA 提取和cDNA 合成

稱量NaCl各脅迫處理后的鹽穗木根和同化枝各200 mg，分別用百泰克總RNA 提取試劑盒（RP3402，北京）提取總RNA，方法參照試劑盒說明書。用ND－2000 和15%變性PAGE 膠檢測(cè)RNA濃度和質(zhì)量，每份3個(gè)重復(fù)。以1μg總RNA 為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄（20μL 反應(yīng)體系），以Takara Oligo（dT）作為引物用M－MLV 反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA。反應(yīng)程序：反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液30℃靜置10min；移至42℃水浴鍋孵育60 min；70℃熱擊15 min；冰浴2 min。以此cDNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。

1．4 HcDmc 1擴(kuò)增

根據(jù)本課題組前期對(duì)鹽穗木轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的鹽穗木EST 序列，克隆并分析DNA 損傷修復(fù)基因（HcDmc1）開放閱讀框。設(shè)計(jì)上游引物（5′－CTCGTGGAATTCTCTCTCT TTCTCTATCTC－3′）和下游引物（5′－CCAGTAACTAGCTACATAATGCACGGTACTC－3′），以無脅迫處理狀態(tài)下的鹽穗木cDNA 為模板，擴(kuò)增HcDmc1開放閱讀框。PCR 反應(yīng)擴(kuò)增參數(shù)為94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，58℃退火30s；72℃延伸90s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

按PCR 產(chǎn)物純化試劑盒（Omega）說明書進(jìn)行PCR 產(chǎn)物回收。回收的片段與pEASY－T5載體（北京全式金公司）連接，操作按試劑盒說明書進(jìn)行。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E．coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞（北京全式金公司），酶切鑒定出陽性克隆后，送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

1．5 序列分析

利用DNASTAR 軟件對(duì)已獲得的HcDmc1的核酸序列進(jìn)行分析并推導(dǎo)其氨基酸序列；利用Prot－Param（http：／／web．expasy．org／protparam／）分析氨基酸序列的理化性；利用TMHMM（http：／／www．cbs．dtu．dk／services／TMHMM／）分析蛋白質(zhì)的跨膜結(jié)構(gòu)；利用Protscale（http：／／web．expasy．org／protscale／）分析蛋白質(zhì)親疏水性；利用NCBI的保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫CDD（http：／／www．ncbi．nlm．nih．gov／Structure／cdd／wrpsb．cgi？RID＝1K7GNVX3015＆mode＝all）分析預(yù)測(cè)氨基酸序列的保守結(jié)構(gòu)域；利用PSORT ⅡPrediction（http：／／psort．hgc．jp／form2．html）和WoLF PSORT（http：／／wolfpsort．org／）預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位；利用TargetP（http：／／www．cbs．dtu．dk／services／TargetP／）分析蛋白潛在信號(hào)肽；利用NetPhos（http：／／www．cbs．dtu．dk／services／NetPhos／）分析蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)；利用MEGA 6．0 和DNAman軟件分析其同源性及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1．6 鹽脅迫下HcDmc 1基因表達(dá)

根據(jù)HcDmc1的cDNA 序列設(shè)計(jì)qRT－PCR上游引物（5′－ACTCCTCGGCAATCTTCATCAAA－3′）和下游引物（5′－GAACGGTTTGGGATGGATGCT－3′），以Hcβ－Actin基因作為內(nèi)參基因，設(shè)計(jì)上游引物（5′－CCAAAGGCCAACAGAGAGAAGA－3′）和下游引物（5′－TGAGACACACC ATCACCAGA－3′）。以NaCl各脅迫后鹽穗木的根和同化枝的cDNA為模板，取1．0μL cDNA，參照QIAGEN（Invitrogen公司）試劑盒說明書進(jìn)行qRT－PCR，反應(yīng)參數(shù)為：95℃預(yù)變性30s；95℃變性15s；58℃退火30s；72℃延伸40s（實(shí)時(shí)熒光信號(hào)采集）；40個(gè)循環(huán)。采用ABI PRISM 7500實(shí)時(shí)定量PCR 儀進(jìn)行檢測(cè)，數(shù)據(jù)采用2－ΔΔCT法進(jìn)行分析［14］。

2 結(jié)果與分析

2．1 鹽穗木Dmc 1基因的克隆及序列分析

圖1 HcDmc 1核酸序列及其氨基酸序列Fig．1 HcDmc 1nucleotide acid sequence and amino acid sequence

利用PCR 擴(kuò)增獲得鹽穗木DNA 雙鏈斷裂鉸鏈蛋白基因HcDmc1，開放閱讀框?yàn)? 035bp，編碼344個(gè)氨基酸（圖1）。通過NCBI保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫，分析HcDmc1的保守結(jié)構(gòu)域，結(jié)果顯示該蛋白含有2個(gè)超家族，H3TH（helix－3－turn－h(huán)elix）和ABC－ATPase超家族。H 3TH超家族是一個(gè)帶正電的DNA 活性位點(diǎn)，結(jié)合5′核酸酶，主要包含了FEN1（Flap Endonuclease－1）、EXO1（Exonuclease－1）、Mkt1、GEN1（Gap Endonuclease 1）、XPG（Xeroderma pigmentosum complementation group G）等核酸內(nèi)切酶，參與DNA 復(fù)制、修復(fù)、重組。而ABC－ATPase超家族，有ATP 運(yùn)輸核苷酸的結(jié)合位點(diǎn)和核苷酸水解酶ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，包含2 個(gè)DNA結(jié)合域loop1 和loop2，2 個(gè)嘌呤核苷酸結(jié)合位點(diǎn)（motif A and B），說明HcDmc1可能具有通過這2個(gè)結(jié)構(gòu)域發(fā)揮運(yùn)輸核苷酸參與DNA 損傷修復(fù)的功能。

圖2顯示，鹽穗木Dmc1氨基酸序列與馬鈴薯、番茄、山柳菊、黃瓜等的氨基酸序列相似性較高。運(yùn)用MEGA 6．0軟件對(duì)18種植物的Dmc1氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖2），結(jié)果表明鹽穗木Dmc1為獨(dú)立的一枝。

2．2 HcDmc1蛋白的結(jié)構(gòu)特征、功能分析

通 過ExPASy ProtParam 預(yù)測(cè)HcDmc1基因編碼的氨基酸序列的組成和理化性質(zhì)。該基因編碼344個(gè)氨基酸，其編碼蛋白相對(duì)分子量為37 694．2 Da，理論等電點(diǎn)為5．46，酸性氨基酸殘基總數(shù)（Asp＋Glu）為40個(gè)，堿性氨基酸殘基總數(shù)（Arg＋Lys）為47個(gè)，原子總數(shù)是5 339，分子式為C1669H2693N455O509S13，疏水性平均值GRAVY（（Grand average of hydropathicity）為－0．125，表明其為親水性蛋白。該蛋白質(zhì)不穩(wěn)定指數(shù)是31．72，為穩(wěn)定的蛋白。應(yīng)用Psort、WoLF PSORT 兩種工具預(yù)測(cè)該蛋白的亞細(xì)胞定位，該蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、線粒體、葉綠體、細(xì)胞骨架和過氧化物酶體。兩種預(yù)測(cè)軟件結(jié)果一致，推測(cè)該蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)的概率較高，同時(shí)線粒體、葉綠體中也有所分布。結(jié)合Signal P 4．0 Server軟件對(duì)信號(hào)肽的預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，HcDmc1的N 端至第70位氨基酸之間信號(hào)肽分值和綜合剪切分值D＝0．101＜D－cutoff＝0．450，沒有明顯峰值，推測(cè)HcDmc1編碼的蛋白不存在信號(hào)肽。通過Expasy軟件中的TMHMM Server v．2．0工具預(yù)測(cè)，HcDmc1氨基酸序列中不存在跨膜螺旋區(qū)，344 個(gè)氨基酸殘基全部在膜外，為非跨膜蛋白。

2．3 HcDmc1的磷酸化位點(diǎn)和活性位點(diǎn)的分析

磷酸化是生物體內(nèi)一種普遍的調(diào)節(jié)方式，在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和蛋白調(diào)控過程中起著重要的作用。磷酸化位點(diǎn)分析表明，HcDmc1有5個(gè)絲氨酸、3個(gè)蘇氨酸、3個(gè)酪氨酸磷酸化位點(diǎn)。利用NPS（Network Protein Sequence Analysis）的Prosite Scan對(duì)Hc－Dmc1進(jìn)行活性位點(diǎn)分析，結(jié)果（表1）顯示，HcDmc1 有7 類活性位點(diǎn)，分別是N－糖基化位點(diǎn)、cAMP－和cGMP－依賴性蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)、蛋白酶C磷酸化位點(diǎn)、酪蛋白酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)、酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)、N－十四?；稽c(diǎn)、酰胺化位點(diǎn)、ATP／GTP－結(jié)合位點(diǎn)。這是HcDmc 1發(fā)揮其催化作用所必須的。

圖2 不同植物基于Dmc1氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig．2 Phylogenetic tree of different plants based on amino acid of Dmc1

2．4 鹽脅迫下HcDmc 1基因的表達(dá)分析

采用qRT－PCR方法，以β－actin作為內(nèi)參，分別檢測(cè)不同濃度鹽脅迫下鹽穗木根和同化枝HcDmc1轉(zhuǎn)錄水平變化（圖3）。首先以HcDmc1和Hcβ－Actin實(shí)時(shí)定量引物建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，HcDmc1熔解曲線所得的TM 值為（82．77±0．1）℃，峰值單一，沒有引物二聚體和非特異性條帶。在8個(gè)10n倍系列稀釋條件下得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y＝－3．295x＋29．772，相關(guān)系數(shù)（R2）為0．995，擴(kuò)增效率（Efficiency）為101．132。經(jīng)過擴(kuò)增條件、程序的優(yōu)化，HcDmc1擴(kuò)增效率達(dá)到了相對(duì)定量公式2－△△CT 的使用標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)而繼續(xù)進(jìn)行相對(duì)定量實(shí)驗(yàn)。

表1 HcDmc1在NPS中的活性位點(diǎn)預(yù)測(cè)分析Table 1 Scanning of HcDmc1for site／signatures against proscan database in NPS

圖3 鹽穗木根（A）和同化枝（B）中HcDmc1相對(duì)表達(dá)Fig．3 Relative expression of HcDmc1response to salt－stress in root（A）and branch（B）

相對(duì)定量計(jì)算結(jié)果表明，300mmol／L NaCl脅迫處理后，HcDmc1 在根中的表達(dá)明顯上調(diào)。在100mmol／L NaCl脅迫下，根中HcDmc1表達(dá)無明顯變化，但在300mmol／L NaCl脅迫24h后表達(dá)顯著上升，約為處理0h的鹽穗木組織的1．66倍，在500和700mmol／L NaCl脅迫下，均為脅迫14d達(dá)到最高，約為0h的1．63和1．79倍（圖3，A）。

而同化枝中HcDmc1的表達(dá)量在100mmol／L NaCl脅迫24h后開始劇增，在脅迫7d時(shí)達(dá)到最高，約為0h 的6．58 倍（圖3，B）。在500 和700 mmol／L NaCl脅迫下，表達(dá)略有下降，但仍然維持在較高水平。

3 討 論

減數(shù)分裂是植物有性生殖的重要過程，也是遺傳信息傳遞的基本方式。正常狀況下，第一次減數(shù)分裂前期的粗線期的染色體是二價(jià)體形態(tài)，然而擬南芥dmc1突變體中染色體以單體狀態(tài)存在，說明AtDmc1基因?qū)p數(shù)分裂交叉結(jié)的形成是必需的，維持染色體正常配對(duì)和聯(lián)會(huì)［15］。此外，Dmc1蛋白作為大腸桿菌RecA 蛋白的同源蛋白［16］，能夠聚合到斷裂的單鏈DNA 上，形成核蛋白纖維［17］，通過非同源末端連接途徑參與聯(lián)會(huì)復(fù)合體配對(duì)，重組修復(fù)斷裂的雙鏈［18］。

對(duì)Dmc1基因編碼氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)其在植物中具有較高的相似性（80% 以上），說明植物Dmc1的氨基酸序列在進(jìn)化上是高度保守的，其編碼的氨基酸序列長度和順序變異較小，其特定基序?qū)τ贒mc1蛋白發(fā)揮活性結(jié)合雙鏈、單鏈DNA 具有重要作用，尤其是基序GEFRSGKT 是ATPbinding結(jié)合位點(diǎn)，廣泛存在于Dmc1及其同源蛋白R(shí)ad51和DNA 重組修復(fù)蛋白R(shí)ecA、RadA 中［19］。對(duì)HcDmc1 磷酸化位點(diǎn)和活性位點(diǎn)的分析可知蛋白激酶可能參與了HcDmc1活性功能調(diào)節(jié)，而蛋白激酶是植物抵御逆境脅迫信號(hào)傳導(dǎo)鏈的重要組分，HcDmc1在減數(shù)分裂中的作用可能受到了特定信號(hào)調(diào)節(jié)，并參與到植物抗逆途徑中。對(duì)HcDmc1蛋白進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)、跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)、疏水性／親水性分析和亞細(xì)胞定位都顯示該蛋白主要存在于細(xì)胞質(zhì)，不與細(xì)胞膜結(jié)合，是穩(wěn)定的親水性蛋白，這與動(dòng)物中Dmc1基因序列的分析結(jié)果相同［20］。

已有研究表明，植物在外界非生物脅迫下，DNA 會(huì)造成不同程度損傷變異，甚至斷裂，同源重組和聯(lián)會(huì)復(fù)合體是影響減數(shù)分裂的發(fā)生和配子的形成的主要因素［21－23］。Deng［24］對(duì)水稻的Dmc1基因進(jìn)行RNAi干擾之后發(fā)現(xiàn)其具有同源配對(duì)缺陷，不能形成二價(jià)體，同時(shí)出現(xiàn)花粉不育現(xiàn)象，McHale等［25］研究發(fā)現(xiàn)，在兩種顯著不同溫度環(huán)境中，相同基因型的馬鈴薯（Solanumtuberosum）產(chǎn)生未減數(shù)配子的頻率相差很大。這說明，DNA 損傷修復(fù)基因Dmc1在逆境下具有保持染色體完整，減數(shù)分裂中染色體正常配對(duì)，同時(shí)修復(fù)斷裂的雙鏈的功能。本研究發(fā)現(xiàn)，鹽穗木減數(shù)分裂同源重組蛋白基因Hc Dmc1受鹽脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，尤其是在其繁殖器官同化枝中表達(dá)量顯著升高，推測(cè)其可能是鹽穗木通過高表達(dá)HcDmc1蛋白，對(duì)高鹽脅迫造成的斷裂缺口的DNA 單鏈進(jìn)行同源依賴性修復(fù)，以緩沖重組而導(dǎo)致的新型遺傳表現(xiàn)，提高鹽穗木鹽脅迫環(huán)境適應(yīng)性和生殖生長能力。

目前關(guān)于Dmc1基因表達(dá)模式研究的較少，本研究與擬南芥Dmc1和水稻Dmc1基因的表達(dá)分析結(jié)果相似，表現(xiàn)為在生殖器官中表達(dá)活性最高，在葉和根中表達(dá)量略低［26］。通過對(duì)HcDmc1在鹽穗木鹽脅迫下不同組織表達(dá)定量分析，發(fā)現(xiàn)隨著鹽濃度和脅迫時(shí)間的增加，鹽穗木根中表達(dá)量升高，暗示HcDmc1在根中可能后期響應(yīng)鹽脅迫。而在同化枝中的響應(yīng)明顯提前于根，說明鹽穗木同化枝中Hc－Dmc1對(duì)鹽脅迫更為敏感，并在長時(shí)間高鹽脅迫下維持較高的表達(dá)水平，以保證繁殖器官減數(shù)分裂、復(fù)制等生命周期的正確性，進(jìn)而確保鹽脅迫下物種的穩(wěn)定遺傳。

本研究對(duì)從鹽穗木中克隆獲得的HcDmc1 基因進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，探討了HcDmc1響應(yīng)鹽脅迫基因的表達(dá)變化規(guī)律，證明了HcDmc1能夠參與鹽穗木鹽脅迫應(yīng)答過程。而HcDmc1 在鹽穗木緩解鹽脅迫過程中如何形成聯(lián)會(huì)復(fù)合體和參與減數(shù)分裂重組，有待深入研究。鹽穗木HcDmc1基因的克隆和鹽脅迫下不同組織的表達(dá)分析，有助于闡明DNA 損傷修復(fù)在鹽穗木耐鹽調(diào)控機(jī)理中的作用。

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