張 寧，張 顯＊，張 勇，馬建祥，楊小振，王永琦，2

（1 西北農(nóng)林科技大學(xué) 園藝學(xué)院／農(nóng)業(yè)部西北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西楊陵712100；2 漢中農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，陜西漢中723000）

甜瓜（CucumismeloL．）是黃瓜屬（Cucumis）作物，是廣泛種植的水果型蔬菜。隨著生活水平的不斷提高，消費(fèi)者對甜瓜果實(shí)品質(zhì)的要求也日益提高，因此改善甜瓜營養(yǎng)品質(zhì)是當(dāng)前甜瓜品質(zhì)育種的重要內(nèi)容。甜瓜果實(shí)中含糖量是影響其品質(zhì)成分的重要因子。甜瓜果實(shí)中可溶性糖主要包括葡萄糖、果糖和蔗糖［1］，已有研究表明糖類的甜度由高到低依次為果糖、蔗糖和葡萄糖［2］。因此開展甜瓜果實(shí)糖含量相關(guān)性狀的遺傳改良對改善果實(shí)營養(yǎng)品質(zhì)具有重要意義。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，遺傳連鎖圖譜的出現(xiàn)為瓜類作物果實(shí)糖含量相關(guān)性狀的遺傳改良研究提供了有力的工具。目前國內(nèi)外研究者已開展了瓜類作物果實(shí)糖含量QTL 定位研究。Burger等［3］對西瓜糖含量性狀的遺傳效應(yīng)研究結(jié)果表明高糖含量由單隱性基因控制。Paris等［4］對不同環(huán)境條件下甜瓜果實(shí)可溶性固形物含量進(jìn)行了QTL 定位，在2種環(huán)境中均檢測到與可溶性固形物含量相關(guān)的2 個QTL 位點(diǎn)，分別為Ssc7．4 和Ssc10．8；Monforte等［5］利用F2群體和DH 系群體對甜瓜果實(shí)糖分進(jìn)行了QTL 定位，檢測到與果實(shí)糖分相關(guān)的5個QTL位點(diǎn)。郭少貴等［6］對不同環(huán)境條件下西瓜果實(shí)可溶性固形物含量進(jìn)行QTL 定位，分析認(rèn)為位于第1連鎖群上的2個位點(diǎn)可能是控制西瓜可溶性固形物含量的主效基因位點(diǎn)。劉識等［7］通過構(gòu)建西瓜F2群體對果實(shí)中心糖和邊糖含量進(jìn)行QTL定位，檢測到與中心糖含量相關(guān)的QTL 為Tmsc3．1，貢獻(xiàn)率為6．56%；邊糖含量相關(guān)的QTL為Tesc12．1，貢獻(xiàn)率為7．90。然而有關(guān)利用甜瓜遠(yuǎn)緣群體構(gòu)建的遺傳圖譜對果實(shí)糖含量相關(guān)性狀進(jìn)行QTL定位方面的研究尚未見報道。本研究以糖含量差異較大的甜瓜品系0246與野生種質(zhì)Y101雜交獲得的F2代群體為試驗(yàn)材料，基于SSR 標(biāo)記技術(shù)構(gòu)建甜瓜遺傳連鎖圖譜，分析與果實(shí)糖含量相關(guān)性狀緊密連鎖的QTL 位點(diǎn)，以期為甜瓜果實(shí)糖含量相關(guān)基因的精細(xì)定位及克隆奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1．1 試驗(yàn)材料

親本材料為栽培厚皮甜瓜0246（P1）和野生薄皮甜瓜Y101（P2），雙親糖含量相關(guān)性狀差異顯著，其中P1和P2都是經(jīng)過多代自交選育的自交系。以雙親配制的包含135個單株的F2代群體為試驗(yàn)材料。試驗(yàn)材料由西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院西瓜甜瓜課題組提供。

1．2 試驗(yàn)方法

1．2．1 群體構(gòu)建及田間試驗(yàn)設(shè)計(jì) 2011年春季雙親雜交獲得F1代種子。2012年春季將F1代自交，獲得F2代種子。2013年春季將試驗(yàn)材料種植于大棚內(nèi)，其中P1、P2、F1代各種植30株，每個小區(qū)種植10株，3 次重復(fù)；隨機(jī)種植F2代135 株。株距35 cm，行距75cm，吊蔓栽培，單蔓整枝，第13～15節(jié)子蔓留單果，按常規(guī)栽培管理進(jìn)行。

1．2．2 糖含量的測定 果實(shí)收獲后，取每個果實(shí)的邊部直到中心的果肉混合，稱取每份5g，重復(fù)3次，放于－80℃冰箱中保存。果實(shí)糖含量待測液提取參照萬學(xué)閃等［8］的方法，略有改動：取5g凍樣加入6mL 80%乙醇溶液，混勻后放于80℃水浴鍋中浸提40min，10 000r／min離心20min，吸取上清液，并將殘?jiān)貜?fù)上述操作合并上清液，定容至25mL待用。果糖和蔗糖含量采用蒽酮比色法測定［9］，還原糖含量采用3，5－二硝基水楊酸比色法測定［10］，測定的還原糖含量數(shù)值減去果糖含量數(shù)值即為葡萄糖含量數(shù)值，果糖、葡萄糖和蔗糖含量數(shù)據(jù)的和即為總糖含量［11］，重復(fù)3次，取平均值。

果糖含量（g／kg）＝（0．178A＋0．00018）×f

還原糖含量（g／kg）＝（0．6A＋0．0078）×f

蔗糖含量（g／kg）＝（0．04A－0．0004）×f

式中，A為吸光值；f為稀釋倍數(shù)，以鮮重計(jì)。

1．2．3 SSR 引物來源 2013年春季，苗期采集母本、父本、F1、F2單株莖間嫩葉2g，采用改良CTAB法提取甜瓜基因組DNA［12］。試驗(yàn)用的SSR 引物序列來自已公開發(fā)表文獻(xiàn)［13－25］及互聯(lián)網(wǎng)葫蘆科作物EST 數(shù) 據(jù) 庫（http：／／www．ncbi．nlm．nih．gov／dbEST；http：／／www．icugi．org／），共計(jì)506 對，所有引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。甜瓜SSR－PCR反應(yīng)體系及程序參照喬軍等［26］方法，略有改動。SSR 擴(kuò)增產(chǎn)物用9%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，對結(jié)果進(jìn)行記錄。

1．2．4 QTL分析 利用Microsoft Excel 2010軟件對分子試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。將符合分離比（1∶2∶1）的標(biāo)記利用Joinmap 4．0軟件構(gòu)建遺傳連鎖圖譜。選擇QTL IciMapping V3．2軟件進(jìn)行QTL分析。采用完備區(qū)間作圖（ICIM）法對果實(shí)糖含量相關(guān)性狀進(jìn)行QTL 定位，LOD 閾值設(shè)定為3．0，以1cM 為步進(jìn)區(qū)間對全基因組進(jìn)行QTL 掃描，并進(jìn)行1 000次置換檢測。

2 結(jié)果與分析

2．1 糖含量相關(guān)性狀遺傳分析

由表1 可知，母本與父本果糖含量分別為16．326和3．559g／kg，葡萄糖含量分別為12．462和2．420g／kg，蔗糖含量分別為50．045 和2．538 g／kg，總糖含量分別為78．770 和8．517g／kg。利用DPS V7．05軟件對親本間糖含量性狀進(jìn)行顯著性分析，表明雙親糖含量性狀差異極顯著，數(shù)據(jù)可用于QTL分析。F2代群體果糖、葡萄糖、蔗糖和總糖含量性狀多數(shù)均介于雙親之間且分離明顯，表現(xiàn)多峰分布，峰度及偏度均小于1，由此可知屬于典型的數(shù)量性狀遺傳。

2．2 多態(tài)性引物的篩選

利用1%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)對提取的雙親、F1及F2基因組DNA 進(jìn)行檢測，結(jié)果表明其濃度和質(zhì)量均適用于SSR 擴(kuò)增。選擇506對SSR 引物對雙親進(jìn)行多態(tài)性擴(kuò)增，共篩選出具有多態(tài)性且穩(wěn)定遺傳的SSR 引物67 對，多態(tài)率為13．24%。

2．3 遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建

利用篩選出具有多態(tài)性的SSR 引物67對，并對F2遠(yuǎn)緣群體135個單株DNA 進(jìn)行多態(tài)性擴(kuò)增，然后再進(jìn)行卡方檢測。結(jié)果表明在67個標(biāo)記中有58個標(biāo)記符合理論分離比（1∶2∶1），其余9個標(biāo)記表現(xiàn)出不同程度的偏分離現(xiàn)象。SSR 標(biāo)記在F2群體部分單株中的擴(kuò)增帶型如圖1。

采用Joinmap 4．0 軟件對篩選出的58 個標(biāo)記進(jìn)行遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建，得到一張包含有14個連鎖群的遺傳連鎖圖譜。58個標(biāo)記分屬于14個連鎖群，覆蓋基因組長度為726．30cM，相鄰標(biāo)記間距離為12．74cM，各連鎖群的標(biāo)記數(shù)為2～10，長度為18．1～118．0cM。標(biāo)記最多的第8連鎖群，分布10個標(biāo)記，標(biāo)記間平均距離為13．10cM，標(biāo)記最少的分別為第7、10、14連鎖群，只分布了2個標(biāo)記。平均遺傳距離最大的為第13連鎖群，平均遺傳距離為30．70cM，平均遺傳距離最小的連鎖群為第13 連鎖群，平均遺傳距離為9．00cM（表2）。

表1 親本及F2 群體果實(shí)糖含量相關(guān)性狀遺傳分析Table 1 Genetic analysis of fruit sugar content correlated traits in two parents and F2population

2．4 糖含量相關(guān)性狀的QTL分析

依據(jù)得到的甜瓜遺傳連鎖圖譜和果實(shí)糖含量相關(guān)性狀的表型數(shù)據(jù)，運(yùn)用QTL IciMapping V3．2軟件對果實(shí)糖含量相關(guān)性狀進(jìn)行QTL 掃描分析。結(jié)果表明，在第3和第4連鎖群（LG3、LG4）上檢測到2個分別與總糖含量和果糖含量相關(guān)的QTL（圖2）。QTL的命名是以性狀的英文縮寫、連鎖群號以及QTL編號為依據(jù)。

將與果糖含量和總糖含量相關(guān)的QTL 位點(diǎn)分別命名為Fru4．1和Ts3．1。由表3中可知，F(xiàn)ru4．1位點(diǎn)位于第4連鎖群CMAGN73－CMTC168標(biāo)記區(qū)間，與標(biāo)記CMAGN73的遺傳距離為16．0cM。該位點(diǎn)加性效應(yīng)值為0．40，加性效應(yīng)為正值，對增加果糖含量表現(xiàn)為增效累加效應(yīng)。可解釋表型變異的13．02%。Ts3．1 位點(diǎn)位于第3 連鎖群CMCTN5－TJ10標(biāo)記區(qū)間，與標(biāo)記TJ10 的遺傳距離為12．6 cM。該位點(diǎn)加性效應(yīng)值為9．26，加性效應(yīng)為正值，對增加總糖含量表現(xiàn)為增效累加效應(yīng)?？山忉尡硇妥儺惖?4．89%。

表2 甜瓜連鎖遺傳圖譜的基本參數(shù)Table 2 Description of the linkage groups in melon

圖1 SSR 標(biāo)記在F2 群體中PCR 擴(kuò)增的部分帶型Fig．1 PCR profiles generated by SSR in part of F2population

圖2 甜瓜遺傳連鎖圖譜構(gòu)建及果糖和總糖含量相關(guān)QTL分析Fig．2 The construction of genetic linkage map and analysis of QTLs associated with fructose and total sugar contents in melon

表3 甜瓜果糖和總糖含量相關(guān)的QTLTable 3 QTLs associated with fructose and total sugar contents in melon

3 討 論

偏分離是植物構(gòu)建遺傳連鎖圖譜研究中的一種非常普遍的現(xiàn)象，能夠提高群體內(nèi)雜合基因型的頻率。研究者普遍關(guān)注偏分離現(xiàn)象的原因，主要是因?yàn)槠渚哂幸环N非常重要的進(jìn)化原動力［27］。劉莉等［28］采用西瓜F2群體，基于AFLP 標(biāo)記構(gòu)建遺傳連鎖圖譜，偏分離率為27%；朱子成等［29］采用甜瓜重組自交系，基于SSR 標(biāo)記構(gòu)建遺傳連鎖圖譜，偏分離率為7．98%；張雪嬌等［30］采用甜瓜重組自交系，基于SSR 標(biāo)記構(gòu)建遺傳連鎖圖譜，偏分離率為9．33%；王兆吉等［31］采用西瓜F2群體，基于SSR 標(biāo)記構(gòu)建遺傳連鎖圖譜，偏分離率為18．18%。本研究采用甜瓜F2群體，基于SSR 標(biāo)記構(gòu)建遺傳連鎖圖譜，偏分離率為13．43%。由此可見，不同的試驗(yàn)材料及構(gòu)圖群體可能會導(dǎo)致不同程度的偏分離現(xiàn)象。本研究偏分離率較高，可能是由于所選用的作圖群體較小，導(dǎo)致標(biāo)記表現(xiàn)出偏分離現(xiàn)象。

SSR 標(biāo)記具有覆蓋基因組范圍廣、共顯性和可重復(fù)性好等特點(diǎn)而不僅被廣泛應(yīng)用于瓜類遺傳連圖譜的構(gòu)建工作中，還被應(yīng)用于構(gòu)建高密度遺傳連鎖圖譜。譚行之等［32］利用SSR 和AFLP標(biāo)記構(gòu)建了一張包括12個連鎖群和84個標(biāo)記位點(diǎn)的南瓜遺傳連鎖圖譜。本研究利用SSR 標(biāo)記構(gòu)建了一張包括14個連鎖群和58個標(biāo)記的遺傳連鎖圖譜。覆蓋基因組長度為726．30cM，標(biāo)記間平均圖距為12．74 cM。此外，在LG2、LG3、LG4、LG5、LG11、LG12連鎖群上標(biāo)記間遺傳距離較大，表明這些部位的標(biāo)記空缺較多，可能是由于作圖群體數(shù)量較小，導(dǎo)致了標(biāo)記間交換值估計(jì)的偏差。在以后的研究中，需增加作圖群體數(shù)量來獲得標(biāo)記間遺傳距離較小的遺傳圖譜。

Harel－Beja等［22］對甜瓜果實(shí)糖含量性狀進(jìn)行QTL定位發(fā)現(xiàn)了與蔗糖含量相關(guān)的6 個QTL 位點(diǎn)，遺傳效應(yīng)以加性為主，同時還將與果糖含量相關(guān)的1個QTL 位點(diǎn)定位到第4 連鎖群。Soon等［33］對甜瓜果實(shí)糖含量性狀進(jìn)行QTL 定位，結(jié)果表明與蔗糖含量相關(guān)的6個QTL 位點(diǎn)遺傳效應(yīng)以加性為主。這與本試驗(yàn)的結(jié)果一致。本研究共檢測到與果糖和總糖含量相關(guān)的2 個QTL 位點(diǎn)，且均為加性遺傳效應(yīng)，分別對增加果糖和總糖含量效應(yīng)表現(xiàn)出增效累加性。其中將與果糖含量相關(guān)的1個位點(diǎn)定位于第4連鎖群，可解釋表型變異的13．02%；將與總糖含量相關(guān)的1個位點(diǎn)定位于第3連鎖群，可解釋表型變異的14．89%。已有研究表明貢獻(xiàn)率低于5%可視為微效QTL，貢獻(xiàn)率高于15%可視為主效QTL［34］。本研究中與總糖含量相關(guān)的QTL 位點(diǎn)貢獻(xiàn)率為14．89%，接近于15%，可視為主效QTL。然而糖分含量符合典型數(shù)量性狀遺傳特征，比較容易受到環(huán)境條件的影響。因此本研究檢測到的2個QTL 位點(diǎn)需進(jìn)一步利用永久性群體進(jìn)行重復(fù)的驗(yàn)證，以期為甜瓜果實(shí)糖含量相關(guān)基因的精細(xì)定位提供理論依據(jù)，進(jìn)而為甜瓜果實(shí)品質(zhì)的遺傳改良奠定基礎(chǔ)。

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