曾祥煉，譚艾娟＊，呂世明，曹正花，常 鑫，劉日昂

（1.貴州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng)550025；2.貴州大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng)550025）

隨著抗菌藥物的廣泛應(yīng)用，尤其是不規(guī)范使用[1]，導(dǎo)致耐藥菌增多、耐藥性水平增高、耐藥譜擴(kuò)大及耐藥機(jī)制的復(fù)雜化[2]，使耐藥菌感染疾病的病程延長(zhǎng)，甚至治療失效。因此，細(xì)菌耐藥性已成為威脅人類(lèi)健康的重大因素之一[3]。如何延緩或降低細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生與發(fā)展，恢復(fù)其對(duì)藥物的敏感性已成為目前全球研究的熱點(diǎn)。我國(guó)和其他國(guó)家或組織，如歐盟主要是通過(guò)促進(jìn)合理使用抗生素、預(yù)防感染、開(kāi)發(fā)新型抗生素和耐藥性監(jiān)測(cè)等措施控制耐藥性的問(wèn)題，但實(shí)施效果不理想[4]。環(huán)丙沙星和恩諾沙星是獸醫(yī)臨床上最常用的2種治療細(xì)菌性感染的藥物，因而其耐藥性問(wèn)題非常嚴(yán)重。為給制定臨床使用抗菌藥物的輪換用藥方案，降低耐藥性的危害提供科學(xué)依據(jù)，筆者研究了耐藥細(xì)菌對(duì)同類(lèi)抗菌藥物敏感性恢復(fù)的差異以及細(xì)菌傳代、營(yíng)養(yǎng)因素和耐藥菌比例對(duì)敏感性恢復(fù)的影響。

1 材料與方法

1.1 菌株、藥品和培養(yǎng)基

菌株：耐藥大腸桿菌D600、野生型大腸桿菌D549（敏感菌株），由貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院基礎(chǔ)獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室提供；質(zhì)控菌株為大腸埃希氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC25922，購(gòu)自中國(guó)獸藥監(jiān)察所。藥品：環(huán)丙沙星、恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)品，購(gòu)于上海盛思生化科技有限公司。培養(yǎng)基：LB肉湯、米勒－海頓肉湯（MHB），購(gòu)于上海博微生物科技有限公司。

1.2 藥物的最小抑菌濃度（MIC）測(cè)定

參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（CLSI）抗菌藥物敏感性試驗(yàn)操作標(biāo)準(zhǔn)，采用微量肉湯稀釋法，測(cè)定試驗(yàn)菌株對(duì)環(huán)丙沙星和恩諾沙星的MIC值。

1.3 不同傳代耐藥菌的敏感性測(cè)定

將大腸桿菌耐藥菌株D600劃線(xiàn)于麥康凱平板上，挑取1個(gè)單菌落接種于LB 肉湯中，37℃恒溫培養(yǎng)18h，3次重復(fù)，然后按1%（體積分?jǐn)?shù)）轉(zhuǎn)接到新LB肉湯中，以此作為0代菌株，以后每天傳1次，連續(xù)傳代至32d（細(xì)菌生長(zhǎng)代數(shù)參照細(xì)菌傳代方法[5]計(jì)算，24h內(nèi)約為6.64代，共計(jì)約210代），每隔30代測(cè)定對(duì)環(huán)丙沙星和恩諾沙星的MIC值。

1.4 不同耐藥菌比例下耐藥菌的敏感性測(cè)定

將含相同菌落數(shù)的D600 和D549 按0.05∶0.95、0.1∶0.9、0.15∶0.85、0.2∶0.8、0.5∶0.5、1∶0體積比例混合，在無(wú)營(yíng)養(yǎng)匱乏脅迫因子（正常營(yíng)養(yǎng)）條件下培養(yǎng)，按不同傳代耐藥菌對(duì)藥品的敏感性測(cè)定方法設(shè)置重復(fù)與傳代，每隔30代測(cè)定對(duì)環(huán)丙沙星和恩諾沙星的MIC值。

1.5 不同營(yíng)養(yǎng)水平下耐藥菌的敏感性測(cè)定

將菌株D600 分別接種于用生理鹽水稀釋2倍、4倍、8倍、16倍和32倍后的LB肉湯中，按不同傳代耐藥菌對(duì)藥品的敏感性測(cè)定方法設(shè)置重復(fù)與傳代，每隔30代測(cè)定對(duì)環(huán)丙沙星和恩諾沙星的MIC值。

1.6 多因子綜合作用下耐藥菌的敏感性測(cè)定

采用L9（33）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，選擇傳代次數(shù)、耐藥菌比例和營(yíng)養(yǎng)因子等3個(gè)因素（表1），按不同傳代耐藥菌對(duì)藥品的敏感性測(cè)定方法設(shè)置重復(fù)與傳代，并測(cè)定其對(duì)環(huán)丙沙星和恩諾沙星的MIC 值，篩選出耐藥菌敏感性恢復(fù)的最佳條件。

表1 多因子對(duì)耐藥菌敏感性恢復(fù)的L9（33）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 The L9（33）orthogonal design of multiple factors to drug－sensitivity restoration

2 結(jié)果與分析

2.1 藥物的最小抑菌濃度

從表2看出，大腸桿菌ATCC25922 和大腸桿菌D549均為敏感菌株，大腸桿菌D600對(duì)環(huán)丙沙星和恩諾沙星均高度耐藥。

表2 環(huán)丙沙星和恩諾沙星對(duì)試驗(yàn)菌株的MIC 值Table 2 The MIC value of tested strains to ciprofloxacin and enrofloxacin

表3 不同傳代次數(shù)耐藥菌D600的MIC值Table 3 MIC values of D600with different subcultivation times

2.2 不同傳代耐藥菌D600的敏感性

從表3看出，經(jīng)210代傳代，環(huán)丙沙星對(duì)耐藥大腸桿菌D600的MIC 值從0代的128μg／mL 下降至210代的32μg／mL，而對(duì)恩諾沙星的敏感性沒(méi)有變化。經(jīng)線(xiàn)性回歸分析，耐藥菌傳代次數(shù)與環(huán)丙沙星MIC值間呈顯著關(guān)系（P＜0.05），與恩諾沙星MIC值間差異不顯著。說(shuō)明，耐藥大腸桿菌D600對(duì)環(huán)丙沙星的敏感性可隨傳代而逐步恢復(fù)。

2.3 不同耐藥菌比例下耐藥菌D600的敏感性

從表4看出，耐藥菌比例變化對(duì)細(xì)菌敏感性恢復(fù)的影響均較小，環(huán)丙沙星對(duì)細(xì)菌的MIC 值由0代的128μg／mL 下降至60～210代的16μg／mL，而對(duì)恩諾沙星的MIC值沒(méi)有變化。說(shuō)明，在沒(méi)有營(yíng)養(yǎng)匱乏脅迫因子作用下，野生型敏感菌不能形成優(yōu)勢(shì)菌群，對(duì)菌群敏感性恢復(fù)沒(méi)有作用。

2.4 不同營(yíng)養(yǎng)水平下耐藥菌D600的敏感性

從表5看出，隨著傳代次數(shù)的增加和營(yíng)養(yǎng)水平的下降，耐藥菌對(duì)2 種藥物的敏感性均逐漸恢復(fù)，對(duì)環(huán)丙沙星、恩諾沙星的 MIC 值由0 代的≥128μg／mL（高度耐藥）分別恢復(fù)到210 代的0.25μg／mL和1.0μg／mL（敏感）。

2.5 多因子綜合作用下耐藥菌D600的敏感性

從表6看出，3個(gè)因素對(duì)耐藥菌D600恢復(fù)環(huán)丙沙星、恩諾沙星的敏感性均有作用，培養(yǎng)基稀釋倍數(shù)越大、耐藥菌比例越小、傳代次數(shù)越多則細(xì)菌對(duì)2種藥物的MIC值越小，直至恢復(fù)到敏感。對(duì)降低環(huán)丙沙星MIC值的貢獻(xiàn)率大小依次為培養(yǎng)基稀釋倍數(shù)（R＝0.916 3）、耐藥菌比例（R＝1.083 3）、傳代次數(shù)（R＝1.75）；對(duì)降低恩諾沙星MIC 值的貢獻(xiàn)率大小依次 為 耐 藥 菌 比 例 （R＝1.583 4）、傳 代 次 數(shù)（R＝3.417）、培養(yǎng)基稀釋倍數(shù)（R＝3.75）。說(shuō)明，在具有營(yíng)養(yǎng)匱乏脅迫因子作用下，野生型敏感菌易形成優(yōu)勢(shì)菌群，對(duì)菌群敏感性的恢復(fù)有較大作用。

表4 不同耐藥菌比例下耐藥菌D600的MIC值Table 4 MIC values of D600with various proportion of drug－resistant strains μg／mL

表5 不同營(yíng)養(yǎng)水平下耐藥菌D600的MIC值Table 5 MIC values of D600with various nutrition levels μg／mL

表6 多因子綜合作用下耐藥菌D600的MIC 值Table 6 MIC values of D600with the influences of multiple factors

3 結(jié)論與討論

細(xì)菌耐藥性伴隨著抗菌藥物的應(yīng)用而出現(xiàn)[6]。不同類(lèi)別抗菌藥物耐藥性的產(chǎn)生機(jī)制以及停用后敏感性恢復(fù)的快慢不同，同類(lèi)抗菌藥物耐藥性的產(chǎn)生機(jī)制以及停用后敏感性恢復(fù)的快慢相似[7]，與本研究結(jié)果不符，即氟喹諾酮類(lèi)藥物中環(huán)丙沙星的敏感性恢復(fù)速度快于恩諾沙星，且存在較大差異，可能是2種藥物在耐藥形成的分子機(jī)制上存在差異。高度耐藥大腸桿菌D600在沒(méi)有恩諾沙星的選擇壓力下其耐藥水平相當(dāng)穩(wěn)定，其MIC值歷經(jīng)210代傳代沒(méi)有變化。與孟甄等的研究，即高水平耐藥性的表型并非遺傳穩(wěn)定的，去除選擇壓力以后易于恢復(fù)的結(jié)論[8]不一致。

在無(wú)藥物選擇壓力下，大腸桿菌D600 自然傳代210代，對(duì)環(huán)丙沙星的敏感性可逐漸恢復(fù)；敏感菌與耐藥菌不同比例混合對(duì)敏感性恢復(fù)作用不明顯；營(yíng)養(yǎng)匱乏的脅迫作用在細(xì)菌的敏感性恢復(fù)中發(fā)揮重要作用，敏感菌與耐藥菌比例因子只有在營(yíng)養(yǎng)匱乏脅迫條件下才能發(fā)揮作用，可能是營(yíng)養(yǎng)匱乏有利于基因的篩選，促進(jìn)野生型敏感菌形成優(yōu)勢(shì)菌群而降低藥品的MIC值。

本研究?jī)H用2種藥物對(duì)細(xì)菌的敏感性恢復(fù)進(jìn)行研究，建議今后對(duì)細(xì)菌的敏感性恢復(fù)進(jìn)行系統(tǒng)研究，以評(píng)估各種因子，尤其是臨床抗菌藥物使用環(huán)境相關(guān)因子在細(xì)菌藥物敏感性恢復(fù)中的作用，并制定抗菌藥物重復(fù)用藥的條件與標(biāo)準(zhǔn)，為防止耐藥性的產(chǎn)生及降低細(xì)菌耐藥性的危害提供依據(jù)[9]；篩選出敏感性恢復(fù)較好的藥物，結(jié)合本地細(xì)菌耐藥性檢測(cè)結(jié)果為人醫(yī)臨床以及獸醫(yī)臨床制定合理的輪換用藥方案[10]，即多使用敏感性易于恢復(fù)的藥物，少使用或盡量不用敏感性難恢復(fù)的抗菌藥物，以達(dá)到降低細(xì)菌耐藥性的目的。

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