劉 里，成飛翔，楊曉麗

(曲靖師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院,云南曲靖 655011)

頭孢唑啉鈉與牛血清白蛋白的相互作用研究及共存金屬離子的影響

劉 里，成飛翔，楊曉麗

(曲靖師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院,云南曲靖 655011)

在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，運(yùn)用熒光光譜和紫外-可見光譜法研究了頭孢唑啉鈉(CS)與牛血清白蛋白(BSA)之間的相互作用，考察了Pb2+，F(xiàn)e3+，Cr3+，Ni2+和Cu2+對(duì)CS與BSA相互作用的影響，計(jì)算了不同溫度下的熱力學(xué)參數(shù)、靜態(tài)結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù).結(jié)果表明，CS對(duì)BSA的猝滅機(jī)制屬于形成復(fù)合物的靜態(tài)猝滅過程，兩者之間的作用主要是氫鍵或范德華力，CS在BSA中的結(jié)合位點(diǎn)主要位于ⅡA.Hill系數(shù)值略小于1，表明藥物之間有弱的負(fù)協(xié)同作用.同步熒光光譜表明，CS對(duì)BSA構(gòu)象產(chǎn)生一定影響，使BSA腔內(nèi)疏水環(huán)境的極性增強(qiáng)，結(jié)合位點(diǎn)更接近于酪氨酸.金屬離子對(duì)CS與BSA的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)均有影響，除Pb2+以外，其他金屬離子都降低了其結(jié)合能力.

頭孢唑啉鈉(CS)；牛血清白蛋白(BSA)；相互作用；金屬離子

頭孢唑啉鈉(化學(xué)名為(6R，7R)-3-[[(5-甲基-1，3，4-噻二唑-2-基)硫]甲基]-7-[(1H-四唑-1-基)乙酰氨基]-8-氧代-5-硫雜-1-氮雜雙環(huán)[4.2.0]辛-2-烯-2-甲酸鈉鹽，分子式為C14H13N8NaO4S3，簡(jiǎn)稱CS)為第一代頭孢菌素，具有抗菌譜廣、毒性低的特點(diǎn)[1]，結(jié)構(gòu)式見圖1.

圖1 頭孢唑啉鈉結(jié)構(gòu)式Fig 1Structural formula of cefazolin sodium

血清白蛋白是血漿中最為豐富的蛋白質(zhì)，能與進(jìn)入血液中的藥物進(jìn)行可逆結(jié)合從而起到在體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)的作用.因?yàn)榻Y(jié)構(gòu)上和人血清白蛋白的相似性，牛血清白蛋白(BSA)被廣泛用于與藥物結(jié)合作用的研究[2].因此，對(duì)CS與BSA的相互作用的研究有助于理解生命體內(nèi)藥物與蛋白的作用機(jī)制和藥效的發(fā)揮以及藥物毒性[2-4].以往研究藥物與BSA相互作用主要集中在猝滅機(jī)理探討上，而本文在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下從更多角度研究了CS與BSA的結(jié)合反應(yīng)，除了常規(guī)的作用機(jī)理的研究，還深入探討了不同溫度下兩者的結(jié)合位點(diǎn)、結(jié)合力類型、結(jié)合部位、藥物之間的協(xié)同性、藥物對(duì)血清白蛋白構(gòu)象的影響以及金屬離子對(duì)CS與BSA結(jié)合反應(yīng)的影響.這些研究對(duì)于闡明CS在機(jī)體內(nèi)的傳輸、代謝過程及藥理作用具有一定的參考價(jià)值.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料和儀器

牛血清白蛋白(上海楷樣生物技術(shù)有限公司)配制成濃度為1.0×10-6mol·L-1的水溶液；頭孢唑啉鈉(97%，百靈威科技有限公司)配制成濃度為4.37×10-4mol·L-1；上述藥品保存于4 ℃的冰箱中.0.5 mol·L-1NaCl溶液，0.1 mol·L-1的pH=7.40的Tris-HCl緩沖溶液；濃度為1×10-3mol·L-1Pb(NO3)2，F(xiàn)eCl3，CrCl3，Ni(NO3)2，CuSO4溶液；實(shí)驗(yàn)用水為超純水.

日本日立公司的F-4600型熒光光譜儀；美國(guó)瓦里安技術(shù)中國(guó)有限公司的Cary-50型紫外可見分光光度計(jì)；上海虹益儀器儀表有限公司的pHS-3C型精密酸度計(jì)；上海一恒科技有限公司的DHG-9035A型超級(jí)恒溫水浴.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

在10 mL比色管中依次加入1.0×10-6mol·L-1BSA溶液2 mL，不同體積的濃度為2.89×10-4mol·L-1CS溶液，0.50 mol·L-1NaCl溶液2.0 mL和0.1 mol·L-1的pH=7.40的Tris-HCl緩沖溶液1.5 mL，稀釋至刻度并搖勻.分別在296,311和326 K溫度下，激發(fā)與發(fā)射狹縫寬度分別為5 nm和10 nm，光電倍增負(fù)高壓為700 V，固定最大激發(fā)波長(zhǎng)(λex)為280 nm，掃描熒光猝滅光譜，最大發(fā)射波長(zhǎng)(λem)在345 nm處，記錄F0和F(F和F0分別指存在CS與不存在CS時(shí)LS-BSA的熒光強(qiáng)度).296 K下，按照上述方法配制溶液和設(shè)定參數(shù)掃描同步熒光光譜(Δλ=15 nm和60 nm).測(cè)定濃度比為1∶1的BSA與CS溶液的紫外吸收光譜.按照上述條件，在CS-BSA體系中加入濃度都為1.0×10-3mol·L-1金屬離子0.1 mL，測(cè)熒光光譜.

2 結(jié)果與討論

2.1 體系條件的優(yōu)化

對(duì)pH值、緩沖溶液種類及用量、BSA的濃度和試劑加入順序進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明，選用BSA濃度為2.0×10-7mol·L-1，緩沖溶液pH=7.40，0.01 mol·L-1的Tris-HCl溶液1.5 mL，按照BSA→CS→NaCl→Tris-HCl的順序加入時(shí)效果最佳.

2.2 猝滅光譜

蛋白質(zhì)中由于色氨酸和酪氨酸的存在使其發(fā)出熒光.蛋白質(zhì)與藥物小分子發(fā)生作用時(shí)，會(huì)使蛋白質(zhì)的熒光強(qiáng)度發(fā)生變化[2].據(jù)此可以利用熒光光譜對(duì)CS與BSA的作用進(jìn)行研究.圖2為在優(yōu)化條件下，固定激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm，發(fā)射波長(zhǎng)在290～500 nm內(nèi)掃描得到的熒光光譜圖.由圖2可知,隨著CS的加入，BSA的熒光發(fā)射峰出現(xiàn)明顯的減弱，表明CS對(duì)BSA具有猝滅作用.

2.3 猝滅機(jī)理的探討

動(dòng)態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅是熒光猝滅的兩種最主要的猝滅機(jī)理[5-7].常用溫度的變化來(lái)確定猝滅類型.在動(dòng)態(tài)猝滅中分子擴(kuò)散起主導(dǎo)，猝滅常數(shù)隨溫度的升高而增大；對(duì)于靜態(tài)猝滅，因有新物質(zhì)生成，穩(wěn)定性起主導(dǎo)作用，溫度越高，猝滅常數(shù)反而越小[5-7].猝滅過程遵循S-V方程

其中，KSV為猝滅常數(shù)；Kq為猝滅過程的速率常

1→12.CBSA=2.0×10-7mol·L-1,CCS=(0,2.889 9,3.612 4,4.334 9,5.057 3,5.779 8,6.502 3,7.224 8,7.947 2,8.669 7,9.392 2,10.115)×10-5mol·L-1

圖2 CS對(duì)BSA的猝滅光譜

Fig 2Quenching spectra of CS with BSA

數(shù)(最大值約為2.0×1010L·mol-1·s-1)；τ0為熒光體平均壽命，一般為10-8s數(shù)量級(jí)；[C]為CS的濃度.假設(shè)CS對(duì)BSA的猝滅機(jī)理為動(dòng)態(tài)猝滅，作出296,311和326 K溫度下CS對(duì)BSA熒光猝滅的S-V曲線，如圖3.所求得的KSV,Kq列于表1.表1中不同溫度下所求得的Kq都遠(yuǎn)大于2.0×1010L·mol-1·s-1，說明CS對(duì)BSA的猝滅不屬于動(dòng)態(tài)猝滅.由圖3可知，隨著溫度的升高，直線斜率即Ksv減小，正好與靜態(tài)猝滅機(jī)理相吻合[5-7].若CS對(duì)BSA為靜態(tài)猝滅，應(yīng)更符合L-B方程[9]：

其中KLB為靜態(tài)猝滅結(jié)合常數(shù).(F0-F)和[C]作不同溫度下的L-B曲線，結(jié)果見表2.從表2可以看出，三個(gè)溫度下的相關(guān)系數(shù)都達(dá)到0.99以上，線性關(guān)系良好，其KLB值都在104個(gè)數(shù)量級(jí)，結(jié)合力很強(qiáng)，表明CS與BSA的結(jié)合符合靜態(tài)猝滅特征.

圖3 CS對(duì)BSA熒光猝滅的S-V曲線Fig 3S-V plots at three different temperatures 表1 不同溫度下CS和BSA的猝滅常數(shù)Tab 1S-V quenching constant at different temperatures

溫度T/KS?V方程S?Vequations相關(guān)系數(shù)rCorrelationcoefficients(r)Ksv/(L·mol-1)Kq/(L·mol-1·s-1)296F0/F=41443[C]+02922099144144341443×1012311F0/F=30584[C]+07401099613058430584×1012326F0/F=18380[C]+08589099421838018380×1012

表2 L-B 線性回歸方程的相關(guān)參數(shù)

紫外吸收光譜也是一種區(qū)分猝滅機(jī)理的重要方法[5-7].動(dòng)態(tài)猝滅不影響熒光體的吸收光譜，而復(fù)合物的形成會(huì)引起熒光體的吸收光譜的變化[5-7].因此為了進(jìn)一步證明該反應(yīng)體系為靜態(tài)猝滅，測(cè)定了BSA(曲線c)、CS(曲線d)、CS與BSA等摩爾混合物(曲線b)的紫外吸收曲線以及CS與BSA等摩爾混合物與CS的差譜(曲線a)，結(jié)果見圖4.a與c兩條曲線沒有重疊在一起，說明CS與BSA反應(yīng)生成了新物質(zhì)，猝滅機(jī)理為靜態(tài)猝滅.

2.4 結(jié)合常數(shù)K以及結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n

如藥物小分子與生物大分子存在n個(gè)等同且獨(dú)立的結(jié)合位點(diǎn)，它們之間相互作用關(guān)系符合

圖4 CS-BSA的紫外光譜圖Fig 4UV spectra of CS-BSA

Langmuir公式：

分別在296，311，326 K溫度下，以lg(F0-F)/F對(duì)lg[C]作圖，由直線斜率和截距可求出CS與BSA不同溫度下的K及n值，結(jié)果見表3.由表3知，n≈1，表明CS與BSA可形成1個(gè)結(jié)合位點(diǎn)；K的值至少達(dá)到105，表明CS與BSA的結(jié)合作用較強(qiáng).總體趨勢(shì)來(lái)看n和K隨溫度升高而降低，溫度的提升不利于血清白蛋白攜帶CS在體內(nèi)進(jìn)行運(yùn)轉(zhuǎn)、貯存和分配.

表3 CS-BSA的K和n

2.5 熱力學(xué)參數(shù)和作用類型

靜電引力、疏水作用力、氫鍵等是藥物小分子與蛋白質(zhì)大分子的主要結(jié)合作用力[8-11].把結(jié)合反應(yīng)的焓變?chǔ)看作是一個(gè)常數(shù)(溫度變化范圍不大時(shí))[8-11].根據(jù)熱力學(xué)公式[8-11]計(jì)算CS與BSA結(jié)合反應(yīng)的ΔH，熵變?chǔ)及吉布斯自由能變?chǔ)， 結(jié)果見表4.根據(jù)Ross等總結(jié)出的規(guī)則判斷[11-13]，ΔH<0,ΔS<0，表明氫鍵和范德華力是CS與BSA 之間的主要作用力.

表4 CS-BSA體系的熱力學(xué)參數(shù)值

2.6 結(jié)合位置的確定

與人血清白蛋白相似，BSA含有3個(gè)α-螺旋域(Ⅰ-Ⅲ)，每個(gè)α-螺旋域包含兩個(gè)亞螺旋域A 和 B.為確定藥物小分子與BSA結(jié)合的具體位置并反映出在兩者的作用過程中色氨酸殘基和酪氨酸殘基的實(shí)際參與情況，用Sulkowska和劉保生等[11-14]提出的方法，即比較λex=280 nm 和λex=295 nm激發(fā)時(shí)的CS與BSA濃度比與F/F0之間關(guān)系曲線.由圖5可知，兩種激發(fā)波長(zhǎng)下，兩條曲線是獨(dú)立的，而且猝滅程度在280 nm時(shí)比295 nm時(shí)要大，說明在CS與BSA的猝滅反應(yīng)中，色氨酸和酪氨酸殘基都參與其中，結(jié)合位點(diǎn)主要位于亞螺旋域的ⅡA中.

2.7 藥物協(xié)同性

劉保生等[12-15]認(rèn)為藥物協(xié)同性是指藥物與具有多重結(jié)合部位的BSA結(jié)合過程中各結(jié)合部位之間可能存在相互影響作用，可用Hill方程[12-15]進(jìn)行分析：

圖5 λex為 280和 295 nm時(shí)，CS-BSA熒光光譜Fig 5 Fluorescence spectra of CS-BSA at λex=280 and 295 nm

lg(H/(1-H))=lgKH+nHlg[C]，

其中，H為結(jié)合飽和分?jǐn)?shù);KH為結(jié)合常數(shù);nH為Hill系數(shù).在熒光實(shí)驗(yàn)中：

其中，B=(F0-F)/F0；1/Bm為1/B對(duì)1/[C]作圖的截距.CS-BSA的nH值的計(jì)算結(jié)果見表5.表5中三個(gè)溫度下的nH都略小于1，而且變化不大，表明藥物協(xié)同性對(duì)溫度變化不是很敏感.CS與BSA結(jié)合過程中，CS分子之間呈現(xiàn)出弱的負(fù)協(xié)同作用，即前一個(gè)藥物分子結(jié)合到BSA位點(diǎn)上后，阻礙后一個(gè)藥物分子與BSA的結(jié)合.

表5 不同溫度下的Hill系數(shù)nH

2.8 CS對(duì)BSA構(gòu)象的影響

蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化通常用同步熒光光譜來(lái)分析，根據(jù)λem的變化來(lái)確定其熒光猝滅主要由何種氨基酸殘基起主導(dǎo)作用[8-10]，而且氨基酸殘基的λem移動(dòng)方向與其所處的疏水性也緊密相關(guān)[8-10].Δλ=60 nm和Δλ=15 nm分別顯示色氨酸和酪氨酸殘基的熒光特征[8-10].在Δλ=15 nm和Δλ=60 nm條件下測(cè)CS加入BSA之后的同步熒光光譜，結(jié)果見圖6.由圖可知，隨CS濃度的增大，這兩種氨基酸殘基的λem均向長(zhǎng)波移動(dòng)，說明CS的加入改變了BSA的構(gòu)象，使其疏水結(jié)構(gòu)增大，引起肽鏈的伸展程度增大，導(dǎo)致BSA腔內(nèi)疏水環(huán)境的極性增強(qiáng)，疏水性減弱.因酪氨酸的λem向長(zhǎng)波移動(dòng)的程度大于色氨酸，表明酪氨酸殘基所處的微環(huán)境疏水性降低得更多[8-10].酪氨酸的猝滅程度大于色氨酸，表明CS與BSA相結(jié)合的位點(diǎn)偏向于酪氨酸.

圖6 CS猝滅BSA的同步熒光光譜Fig 6Synchronous fluorescence spectrometry of BSA as CS

2.9 金屬離子的影響

金屬離子的存在會(huì)直接影響藥物與蛋白質(zhì)的結(jié)合[17].因此文中研究了Fe3+,Cr3+,Ni2+,Cu2+和Pb2+對(duì)CS與BSA的結(jié)合作用的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表6.從表6可以看出，金屬離子不同，K′和n也不同，其原因可能是由于金屬元素本身的原子結(jié)構(gòu)不同，才導(dǎo)致與BSA的結(jié)合力和結(jié)合位點(diǎn)的差異.Fe3+,Cr3+,Ni2+,Cu2+減小了K，可能是Fe3+,Cr3+,Ni2+,Cu2+與BSA先結(jié)合，占據(jù)了BSA的結(jié)合位點(diǎn)，從而使CS與BSA結(jié)合作用減弱.而Pb2+增大了K，可能是由于它們先與CS結(jié)合，然后再與血清白蛋白結(jié)合，這樣結(jié)合促進(jìn)了CS與BSA的結(jié)合能力[17].總之， CS與BSA的相互作用對(duì)金屬離子的加入比較敏感.Pb2+的加入會(huì)使CS與BSA的結(jié)合常數(shù)有較大增加，有利于延長(zhǎng)藥物的釋放時(shí)間，增加了藥效時(shí)間.而Fe3+,Cr3+,Ni2+,Cu2+的加入使CS與BSA的結(jié)合常數(shù)有所減小，縮短了藥物的存儲(chǔ)時(shí)間，增大了藥物的最大作用強(qiáng)度[10].

表6 共存物質(zhì)的影響

注:K′為有干擾的表觀結(jié)合常數(shù)值;*為不加金屬離子

3 結(jié)論

用熒光和紫外光譜法推斷出CS對(duì)BSA熒光產(chǎn)生靜態(tài)猝滅，兩者靠氫鍵和范德華力結(jié)合；通過計(jì)算求得了K和n值的大小，表明CS可以被BSA運(yùn)輸；兩者結(jié)合位置位于BSA的亞螺旋域ⅡA中；CS對(duì)結(jié)合反應(yīng)產(chǎn)生負(fù)協(xié)同作用，即CS加入使BSA的親和性減弱，不利于后續(xù)CS與BSA的結(jié)合.同步熒光光譜表明，CS使BSA構(gòu)象產(chǎn)生了影響，結(jié)合位點(diǎn)離酪氨酸更近，疏水性減弱.詳細(xì)研究了Fe3+,Cr3+,Ni2+,Cu2+和Pb2+對(duì)CS與BSA相互作用的影響.

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：二部[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005:921-924.

[2] 汪世龍.蛋白質(zhì)化學(xué)[M].上海：同濟(jì)大學(xué)出版社,2012:139-141.

[3] 薛春霞,董社英.藥物分子與血清白蛋白相互作用的研究進(jìn)展[J].廣東化工,2013,40(20):148-149.

[4] 王芳,裴明硯,唐乾,等.藥物與血清白蛋白相互作用中熒光光譜學(xué)的研究進(jìn)展[J].大連大學(xué)學(xué)報(bào),2009(3):39-43.

[5] LAKOWICA J R.PrinciplesofFluorescenceSpectroscopy[M].3rd ed.New York:Springer,2006:280-281.

[6] 許金鉤,王尊本.熒光分析法[M].第3版.北京:科學(xué)出版社,2006:64-70.

[7] 陳國(guó)珍,黃賢智,鄭朱梓,等.熒光分析法[M].第2版.北京:科學(xué)出版社,1990:64-86.

[8] 劉里,彭洪生,伏云紅.熒光光譜法研究頭孢孟多酯與牛血清白蛋白的相互作用[J].中國(guó)測(cè)試,2014,40(3):64-67.

[9] 殷磊,劉里,何志釗,等.熒光光譜法研究頭孢硫脒與牛血清白蛋白的相互作用[J].安徽農(nóng)學(xué)通報(bào),2012,18(19):14-17.

[10] 劉里.光譜法研究馬來(lái)酸氯苯那敏與牛血清白蛋白的相互作用[J].西北師范大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2014,50(5):44-47.

[11] ROSS P D,SUBRAMANIAN S.Thermodynamic of protein association reactions:Forces contributing to stability[J].Biochemistry,1981,20(11):3096-3102.

[12] 閆瀟娜.光譜法研究蛋白質(zhì)與藥物小分子的相互作用及存金屬離子的影響[D].保定：河北大學(xué),2013.

[13] 劉保生,王晶.頭孢噻肟鈉和氯霉素與牛血清白蛋白相互作用的熒光光譜分析[J].發(fā)光學(xué)報(bào),2011,32(6):628-635.

[14] SULKOWSKA A,BOJKO B,ROWNICKA J,et al.Paracetamol and cytarabine binding competition in high affinity binding sites oftransporting porotein[J].MoStruct,2006,26(9):792-793.

[15] BOJKO B,SULKOWSKA A,MACIAZEK-JURCZYK M,et al.The influence of dietary habits and pathological conditions on the binding of theophylline to serum albumin[J].PharmBiomedAnal,2010,52(3):384-390.

[16] 宋玉民,張瓊.李清萍抗凝血藥物華法靈鈉與人血清白蛋白的相互作用研究[J].西北師范大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2011:47(1):48-50.

[17] 樂薇,吳小霞.熒光法研究蘆丁-Zn2+-牛血清白蛋白的相互作用[J].西北師范大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2010:46(4):66-68.

(責(zé)任編輯 陸泉芳)

Study on the interaction between cefazolin sodium and bovine serum albumin and the effect of coexistent metal ion on the reaction

LIU Li，CHENG Fei-xiang,YANG Xiao-li

(College of Chemistry and Chemical Engineering,Qujing Normal University，Qujing 655011，Yunnan，China)

Under the optimal conditions，fluorescence spectrometry and U-V absorption spectrometry are used to investigate the interaction of cefazolin sodium(CS) with bovine serum albumin(BSA).The effects of metal ions on the interaction CS with BSA are also discussed.The quenching of fluorescence of BSA by CS is a static quenching procedure involving complex formation.Under different temperature,thermodynamic parameters,static binding constants and number of binding sites are calculated.The interaction between BSA and CS is dominated by van der Waals forces or hydrogen bond.The primary binding site for CS is located at sub-domainⅡA of BSA.The values of Hill’s coefficients are less than 1,which indicated that there is some very weak negative cooperative effect.Synchronous spectra shows that the conjugation reaction between CS and BSA can affect the conformation of BSA,leading to the polarity around BSA weakened.Synchronous fluorescence indicates that the binding site of CS and BSA is near by tyrosine residue.The effects of metal ions Pb2+,Fe3+,Cr3+,Ni2+and Cu2+on the interactions between BSA and CS are investigated,and the results show that Fe3+,Cr3+,Ni2+and Cu2+have negative influence and Pb2+has positive influence on the combination of CS and BSA．

cefazolin sodium(CS);bovine serum albumin(BSA);interaction;metal ions

2014-11-09;修改稿收到日期:2015-02-08

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(21261019);云南省教育廳科研項(xiàng)目(2012Y414)

劉里(1982—)，女，吉林省吉林市人，講師，碩士.主要研究方向?yàn)樗幬锘瘜W(xué)和分子發(fā)光學(xué)理論與應(yīng)用. E-mail:m18908746298@163.com

O 657.3；Q 51

A

1001-988Ⅹ(2015)04-0052-06