王參智，羅林

(1.中國五冶醫(yī)院神經(jīng)外科，四川 成都，610000;2.昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，云南 昆明 650118)

腦膠質(zhì)瘤是指來源于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，發(fā)生于神經(jīng)外胚層的腫瘤，也稱為神經(jīng)膠質(zhì)瘤。是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最常見的原發(fā)性惡性腫瘤，其發(fā)病率約占顱內(nèi)腫瘤一半，且近年來還有不斷上升的趨勢［1］，年發(fā)病率為5/10萬左右［2］。目前，對膠質(zhì)瘤的治療尚無特異的方法，治療手段主要以手術(shù)切除為主，術(shù)后輔以放療、化療、免疫治療等，但療效較差，其主要原因是與膠質(zhì)瘤中耐藥基因的存在密不可分。其中X線修復(fù)交叉互補(bǔ)基因1(X－rag repair crosscomplementing1，XRCC1)是臨床上針對鉑類的耐藥基因，但XRCC1在腦膠質(zhì)瘤中的研究國內(nèi)外報道的文獻(xiàn)較少，探討分析其與膠質(zhì)瘤惡性程度的關(guān)系，以期為膠質(zhì)瘤患者的個性化化療提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 一般資料 隨機(jī)收集昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院神經(jīng)外科2011年7月至2013年7月手術(shù)中切除的病理結(jié)果明確的腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本47例，所有患者術(shù)前均未行放、化療并排除身體其他部位腫瘤。47例患者標(biāo)本中，男性30例，年齡16～69歲，平均40.26歲;女性17例，年齡21～72歲，平均38.30歲，病程1周至8個月。

1.2 主要試劑 濃縮型兔抗人XRCC1單克隆抗體 (北京中山金橋生物公司);SP廣譜試劑盒 (云南晨綠生物公司);EDTA修復(fù)液 (云南晨綠生物公司);DAB顯色劑 (北京中山金橋生物公司);APES防脫片劑 (福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司);檸檬酸鹽抗原修復(fù)液 (福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司);蘇木素染液 (臺灣BASO貝索企業(yè))。

1.3 石蠟切片的制備 所有標(biāo)本經(jīng)10%中性甲醛固定24～48 h用自來水沖洗24 h去甲醛)。用不同濃度的酒精(酒精濃度可以逐漸升高)置換出組織中的水后。進(jìn)行透明、浸蠟、包埋，用石蠟切片機(jī)將石蠟塊連續(xù)切2張成4 μm厚的切片，分別作為組織學(xué)分級和免疫組化染色。

1.4 SP染色

1.4.1 石蠟切片后烤片，68℃，20 min。

1.4.2 常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水 二甲苯I 20 min—二甲苯 II 20 min—100% 酒精 I 10 min—100%II 10 min—95%，5 min—80%，5 min—70%，5 min。

1.4.3 阻斷滅活內(nèi)源性過氧化物酶 3%H2O237℃孵育10 min，PBS沖洗3×5 min。

1.4.4 抗原修復(fù) 置0.01M枸櫞酸緩沖液 (pH 6.0)中用煮沸 (95℃，15～20 min)，自然冷卻20 min以上，再用冷水沖洗缸子，加快冷卻至室溫，PBS沖洗3×5 min。

1.4.5 正常羊血清工作液封閉，37℃ 10 min，傾去勿洗。

1.4.6 滴加1滴 (1∶50)一抗兔抗人XRCC1單克隆抗體4℃ 冰箱孵育過夜，PBS沖洗3×5 min(用PBS緩沖液代替一抗作陰性對照);滴加生物素標(biāo)記二抗，37℃孵育30 min，PBS沖洗3×5 min。

1.4.7 滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素卵白素工作液，37℃孵育30 min，PBS沖洗3×5 min。

1.4.8 DAB/H2O2反應(yīng)染色，自來水充分沖洗后。

1.4.9 蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水，透明，干燥，封片。顯微鏡下觀察染色結(jié)果并攝片。

1.5 XRCC1陽性結(jié)果判定 采用半定量積分法:陽性染色XRCC1以細(xì)胞核或/和胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒者為準(zhǔn)。具體標(biāo)準(zhǔn)為:(1)陽性細(xì)胞數(shù)＜5%為0分，6% ～25%為1分，26%～50%為2分，51% ～75%為3分，＞75%為4分;(2)陽性強(qiáng)度 (以多數(shù)細(xì)胞判定):淡黃色為1分，黃色為2分，棕褐色為3分。以 (1)、(2)兩者乘積判斷陽性等級:0分為陰性 (－)，1～4分為弱陽性 (+)，5～8分為陽性 (++)，9～12分為強(qiáng)陽性 (+++)。所有檢測結(jié)果在雙盲情況下由主要研究者及病理科專業(yè)人員兩位閱片評估。采用已知陽性切片作對照 (購買試劑時贈送的陽性對照切片)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 本實驗結(jié)果均采用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。XRCC1在不同級別膠質(zhì)瘤中的表達(dá)水平采用Spearman相關(guān)性分析進(jìn)行分析;膠質(zhì)瘤組織中XRCC1的表達(dá)與患者性別、年齡的相關(guān)性采用Fisher確切概率法進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

膠質(zhì)瘤細(xì)胞中XRCC1陽性細(xì)胞的形態(tài) 膠質(zhì)瘤細(xì)胞核或/和胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞，XRCC1的表達(dá)見圖1及圖2。

47例膠質(zhì)瘤標(biāo)本中XRCC1陽性細(xì)胞率的表達(dá) 在47例膠質(zhì)瘤標(biāo)本中，XRCC1陽性細(xì)胞率為38.30%。在WHO分類Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ級的XRCC1陽性細(xì)胞率分別為33.33%、25.00%、50.00%、41.67%，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果表明，膠質(zhì)瘤不同級別間XRCC1陽性細(xì)胞表達(dá)率，差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (P＞0.05)，膠質(zhì)瘤不同級別間XRCC1的陽性表達(dá)水平，差異也無統(tǒng)計學(xué)意義P＞0.05) (表1)。在性別、年齡方面之間所存在的差異也無統(tǒng)計學(xué)意義，(表2～3，P＞0.05)。

表1 XRCC1在不同級別膠質(zhì)瘤間陽性細(xì)胞表達(dá)率和陽性表達(dá)水平

表2 XRCC1在不同性別膠質(zhì)瘤病人中的陽性表達(dá)率

表3 在不同年齡段膠質(zhì)瘤病人中的陽性表達(dá)率

3 討 論

XRCC1是參與哺乳動物DNA修復(fù)的130種基因之一，而且是第一個被分離出來的參與修復(fù)離子輻射所致?lián)p害的哺乳動物的修復(fù)基因。XRCC1位于19號染色體的長臂區(qū)(q13.2～q13.3)，全長31.9 kb。XRCC1基因的cDNA全長2.2 kb，包括17個外顯子，編碼一個由633個氨基酸組成的70 kD的蛋白質(zhì)［3］。目前已發(fā)現(xiàn)XRCC1編碼區(qū)有3個單核苷酸多肽位點，為 C263047T(Arg194Trp)、G27466A(Arg280His)和G28152A(Arg399Gln)，這些編碼區(qū)的變異可能改變XRCC1的功能，從而使機(jī)體對疾病的易感性發(fā)生變化。

本研究結(jié)果顯示，不同級別膠質(zhì)瘤間XRCC1的陽性表達(dá)率差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (P＞0.05)，不同級別膠質(zhì)瘤間XRCC1的陽性表達(dá)水平差異也無統(tǒng)計學(xué)意義 (P＞0.05)。其原因，可能是因為在不同個體、不同器官以及同一腫瘤組織的不同部位中XRCC1的表達(dá)存在很大的差異。在不同級別的腫瘤細(xì)胞或同一腫瘤組織切片中發(fā)現(xiàn)XRCC1陽性細(xì)胞的染色強(qiáng)度和分布并不均一，缺乏規(guī)律。因此XRCC1陽性表達(dá)率和表達(dá)水平與腫瘤的惡性程度之間并無關(guān)系。XRCC 1在堿基切除修復(fù)中起整體作用，編碼堿基損傷修復(fù)聯(lián)合序列的一種重要蛋白［4］，其對一系列內(nèi)外氧化劑導(dǎo)致的DNA單鏈斷裂和堿基損傷修復(fù)起重要作用。XRCC1單核苷酸多態(tài)影響XRCC1的活性［5］，當(dāng)XRCC1低表達(dá)或陰性表達(dá)時，DNA損傷的修復(fù)能力下降或得不到及時修，就會引發(fā)癌變或者促進(jìn)癌變的發(fā)生，當(dāng)XRCC1高表達(dá)或陽性表達(dá)時，可以修復(fù)DNA的損傷，降低癌變的風(fēng)險。以前的研究顯示:XRCC1基因多態(tài)性與頭頸部、肺、結(jié)腸及前列腺癌等多種惡性腫瘤發(fā)病風(fēng)險有關(guān)［6－7］。最近的研究顯示:XRCC1基因多態(tài)性與腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生有明顯的相關(guān)性［8］。

另外，在腦膠質(zhì)瘤中XRCC1的表達(dá)水平在性別、年齡方面所存在的差異也無統(tǒng)計學(xué)意義 (表2－3)(P＞0.05)，因此在臨床診療過程中為病人制定個體化治療方案時年齡、性別不能作為參考因素。鉑類藥物的主要作用靶點是DNA，藥物進(jìn)入腫瘤細(xì)胞后與DNA形成鉑－DNA加合物，導(dǎo)致DNA損傷，從而影響DNA的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄，抑制腫瘤的分裂導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［9］。這些鉑－DNA加合物的形成是藥物發(fā)揮毒性作用的關(guān)鍵，體內(nèi)鉑－DNA加合物水平較高的腫瘤患者，對化療具有更高的敏感性且有更好的臨床預(yù)后［10－12］影響鉑類化療敏感性的因素很多，但DNA修復(fù)在其耐藥機(jī)制中起重要作用［13－14］NA損傷后的修復(fù)能力與XRCC1密切相關(guān)。XRCC1是堿基切除修復(fù)及單鏈斷裂修復(fù)系統(tǒng)中的核心成員，參與鉑類藥物引起的損傷修復(fù)過程［15］。腫瘤細(xì)胞中的XRCC1編碼的蛋白質(zhì)與DNA連接酶Ⅲ相互作用，修復(fù)DNA單鏈斷裂，并與DNA聚合酶β一起進(jìn)行堿基切除修復(fù)，降低了鉑類藥物的細(xì)胞毒作用，是造成腫瘤細(xì)胞耐藥的主要原因。不同個體的XRCC1活性不一樣［16］，這可能是導(dǎo)致個體間DNA修復(fù)能力差異的分子基礎(chǔ)。腫瘤細(xì)胞中的XRCC1陽性表達(dá)率和表達(dá)水平越高，DNA修復(fù)能力強(qiáng)，腫瘤耐藥越明顯，化療敏感性越差。

總之XRCC1是DNA損傷修復(fù)的重要基因，XRCC1突變使基因的穩(wěn)定性下降，可能增加腫瘤易感性，XRCC1在膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要的作用。XRCC1的過渡表達(dá)與膠質(zhì)瘤細(xì)胞對鉑類化療藥物產(chǎn)生耐藥有關(guān)，同時也為膠質(zhì)瘤的個性化治療提供了一個新的靶點和方向。檢測腦膠質(zhì)瘤中XRCC1表達(dá)水平的高低可作為腦膠質(zhì)瘤對鉑類化療藥是否耐藥的指標(biāo)，從而為不同級別的腦膠質(zhì)瘤患者制定個體化治療方案提供合理的理論依據(jù)。

圖1 XRCC1在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的陰性表達(dá) (10×40)

圖2 XRCC1在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的陽性表達(dá) (10×40)(10×40)

［1］Ohgaki H，Kleihues P.Epidemiology and etiology of gliomas［J］，Acta neuropathologica，2005，109(4):93 －108.

［2］Stupp R，Hegi ME，Vanden Bent MJ，et al.Changing paradigms－an update on the multidisciplinary management of malignant glioma ［J］.Oncologist，2006，11(2):165 －180.

［3］Karlsson KH，Radulescu I，Rydberg B，et al.Repair of radiation－induced heat－labile sites is independent of DNA －PKcs，XRCC1 and PARP ［J］.Radiat Res，2008，169(5):506－512.

［4］Thacker J，Zdzienicka MZ.The manmalian XRCC1 genes:their roles in DNA repair and genetic stability ［J］.DNA Repair，2003，2:655－672.

［5］RosellR，Lord RV，TaronM，et al.DNA repair and cisplat in resistan cein nonsm al l cell lung cancer ［ J］.Lung Cancer，2002，38(3):217－227.

［6］朱虔兮，邊建超.XRCC1基因多態(tài)性與腫瘤遺傳易感性研究進(jìn)展［J］.國外醫(yī)學(xué)腫瘤分冊，2004，31:323－326.

［7］Lin Y，Scheurer MZ，El－zein R，et al.Association and interactions between DNA repair gene Polymorphisms and adult glioma［J］.Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2009，18:204.

［8］劉建民，孫鴻，黃良文，等.XRCC1基因多態(tài)性與腦膠質(zhì)瘤相關(guān)性研究［J］.現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2011，38(16):3340－3341.

［9］Altaha R，Liang X，Yu JJ，et al.Excision repair cross complementing group 1:gene expression and platinum resistance［J］.Int J Mol Med，2004，14:959－970.

［10］Jordan p.Carmo Fonseca M:moleculer mechanisms involved in cisplatin cytotoxicity ［J］.Cell Mol Life Sci，2000，57:1229－1235.

［11］Van de vaart PJM，Belderbos J，De Jong D，et al.DNA －adduct levels as a predictor of outcome for NSCLC patients receiving daily cisplatin and radiotherapy ［J］.Int J Cancer，2000，89:160－166.

［12］Furuta T，Ueda T，Aune G，et al.Transcription coupled nucleotide excision repair as a determinant of cisplatin sensitivity of human cells［J］.Cancer Res，2002，62:4899 －4902.

［13］Lord RVN，Brabender J，Gandara D，et al.Low ERCC1 expression on correlates with prolonged survival after cisplatin plus gemcitabine chemotherapy in non－small－cell lung cancer［J］.Clin Cancer Res，2002，8(11):2286 －2291.

［14］kennedy RD，Qu Inn JE，Mullan PB，et al.The role of BRCA1 in the cellular response to chemotherapy［J］.Natl Cancer Inst，2004，96(22):1659 －1669.

［15］Rosell，Lord R V，Taron M，et al.DNA repair and cisplatin resistance in non － smasll cell lung cancer［J］.Lung Cancer，2002，38:217－227.

［16］Lunn RM，Langlois RG，Hsieh LL，et al.XRCC1 polymorphimsm:effects on aflatoxin B1－DNA adducts and glycophorin A variant frequency ［J］.Cancer Res，1999，59:2557－2561.