楊國(guó)俊，李 寧，王保偉，李宜培，李 艷

(1.河南醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，鄭州 451191； 2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，鄭州 450000)

基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)

萊菔硫烷對(duì)H446細(xì)胞株的抑制作用及CYR61的影響*

楊國(guó)俊1，李 寧2，王保偉1，李宜培1，李 艷1

(1.河南醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，鄭州 451191； 2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，鄭州 450000)

目的 探討萊菔硫烷(sulforaphane, SFN)對(duì)小細(xì)胞肺癌H446細(xì)胞株的抑制作用及CYR61基因表達(dá)的影響。方法 MTT法檢測(cè)SFN對(duì)H446細(xì)胞的抑制作用；流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況；Real-time PCR檢測(cè)H446肺癌細(xì)胞株CYR61表達(dá)。結(jié)果 MTT結(jié)果顯示：SFN從20 μM的濃度起開始出現(xiàn)細(xì)胞抑制效應(yīng)，抑制率與SFN濃度呈正相關(guān)關(guān)系。40 μM SFN干預(yù)組的CYR61基因表達(dá)量較高，與其他組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 SFN在一定濃度下對(duì)H446細(xì)胞株有抑制作用，并促進(jìn)CYR61基因表達(dá)，為食用十字花科類蔬菜防治肺癌提供依據(jù)。

萊菔硫烷；H446；CYR61；Real-time PCR

隨著肺癌發(fā)病率和死亡率的逐年上升，已成為影響中國(guó)居民健康的主要惡性腫瘤之一[1]。肺癌中約有20%為小細(xì)胞癌，其惡性程度高，倍增時(shí)間短，轉(zhuǎn)移早而廣泛，極易發(fā)生繼發(fā)性耐藥，容易復(fù)發(fā)。研究證實(shí)萊菔硫烷(sulforaphane, SFN)可抑制A549細(xì)胞株的增殖，增加腫瘤組織中CYR61基因的表達(dá)[2]。目前，研究者對(duì)SFN抑制小細(xì)胞肺癌的作用研究較少。該研究通過MTT、流式細(xì)胞儀和real-time PCR等方法分析探討了SFN對(duì)H446細(xì)胞株的抑制作用、細(xì)胞凋亡及CYR61表達(dá)的影響，從而為臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 SFN來源于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院，純度為95%；H446肺癌細(xì)胞株購于中國(guó)科學(xué)院；1640培養(yǎng)基(Sigma 公司)；10%胎牛血清；培養(yǎng)條件(37℃，5%CO2，飽和濕度)。

1.2 儀器及試劑 MTT 裂解液(Sigma公司)；RPMI 1640培養(yǎng)粉(Gibco公司)；A-5082型酶標(biāo)儀(Tecan公司)；熒光定量PCR儀(Genetimes Technology,Inc.)；CYR61和β-actin 引物(Sangon)；流式細(xì)胞儀(BD公司)。

1.3 MTT實(shí)驗(yàn)

1.3.1 分組 SFN無水乙醇稀釋，加入細(xì)胞培養(yǎng)液中，分為0、5、10、20、40、80、160 μM SFN 7個(gè)濃度組。

1.3.2 MTT 細(xì)胞懸液200μl加入96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)。 24 h后，加入0、5、10、20、40、80、160 μM SFN不同濃度培養(yǎng)液200 μl，每一劑量6孔。培養(yǎng)8、16、24、32 h后，各孔分別加入5 g·L-1的MTT 20 μl，作用4 h，吸棄MTT。每孔加入二甲基亞砜150 μl，振蕩10 min后用490 nm 波長(zhǎng)在酶標(biāo)儀上檢測(cè)吸光值。將MTT的50%抑制率作為確定SFN作用時(shí)間和濃度的依據(jù)。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 吸去各組上清液，常規(guī)消化細(xì)胞；1 500 r·min-1離心5 min，棄上清；PBS重懸細(xì)胞后，移至EP管中，1 500 r·min-1離心5 min。加5μl的Annexin V-FTTC溶液和2.5μl的PI至100 μl細(xì)胞混懸液中，混合后室溫避光反應(yīng)30 min，加入反應(yīng)緩沖液400 μl，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.5 CYR61基因表達(dá)的檢測(cè)

1.5.1 CYR61和β-actin引物設(shè)計(jì) CYR61和β-actin特異引物的設(shè)計(jì)采用PRIMER3軟件，由上海Sangon合成。見表1。

表1 β-actin和CYR61基因的引物

1.5.2 RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄 RNA提取采用TRIzol試劑，cDNA合成采用AMV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒。

1.5.3 Real-time PCR 建立15 μl反應(yīng)體系：10×buffer 1.5 μl，dNTPs(2.5 mM)1.5 μl，MgCl2(20 μM)1.0 μl，F(xiàn)luorescein(1000×)0.09 μl，Eva Green(20×)0.75 μl，正反引物 (3 mM)各0.6 μl，Tap (2.5 u/μl) 0.15 μl，模板DNA 0.5 μl，水8.91 μl。β-actin和CYR61擴(kuò)增條件：94℃ 3 min，94℃ 20 sec，58℃ 20 sec，72℃延伸40 sec，89℃ 15 sec采集熒光，40個(gè)循環(huán)。

1.6 統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS 18.0軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，以α=0.05作為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 MTT檢測(cè)結(jié)果 SFN在10、20、40、80、160 μM范圍，干預(yù) 8、16、24、32 h后，在20 μM/16 h處開始出現(xiàn)抑制效應(yīng)，存在明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系和時(shí)間效應(yīng)關(guān)系。干預(yù)32 h的50%抑制率對(duì)應(yīng)的SFN濃度為71 μM，故將32 h作為細(xì)胞干預(yù)時(shí)間較為合適，SFN濃度分別設(shè)為：0、20、40、80 μM。

2.2 SFN對(duì)H446細(xì)胞凋亡的影響 SFN作用于H446細(xì)胞后，凋亡率隨SFN濃度的增高而升高，呈明顯的劑量依賴性。見表2。

單因素方差分析組間比較結(jié)果顯示， 各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.3 SFN干預(yù)后Cyr 61基因的Real-time PCR結(jié)果 單因素方差分析兩兩比較結(jié)果顯示， 40 μM濃度SFN干預(yù)組的CYR61表達(dá)量較高，與其他組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表3。

表2 不同濃度SFN對(duì)H446細(xì)胞凋亡率的影響%]

表3 H446細(xì)胞株CYR61的Real-time PCR Ct 值

注：與其他組比較，1)P<0.05。

3 討論

萊菔硫烷是從十字花科蔬菜中提取的一種異硫氰酸鹽。許多研究證實(shí)，萊菔硫烷具有很強(qiáng)的化學(xué)防癌和抗癌活性，對(duì)乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌、肺癌、胃癌、結(jié)腸癌和白血病等多種癌癥具有抗癌活性[3-6]，有望成為一種極有前景的抗癌藥物[7-8]。作用機(jī)制可能是抑制一相代謝酶的活性、誘導(dǎo)二相代謝酶的活性，導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯及細(xì)胞凋亡發(fā)揮抗癌作用[9-10]；影響腫瘤細(xì)胞的增殖及生長(zhǎng)周期，侵襲、并能抑制血管生成[11]等。目前，臨床上對(duì)小細(xì)胞肺癌的治療雖然以化療為主，但療效并不理想，且毒副作用大，因此，該實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)未使用陽性對(duì)照藥物。研究結(jié)果顯示：SFN對(duì)H446細(xì)胞株有明顯的抑制作用，且具有劑量效應(yīng)關(guān)系和時(shí)間效應(yīng)關(guān)系特點(diǎn)，SFN濃度越大，干預(yù)時(shí)間越長(zhǎng)，抑制率越大；H446細(xì)胞凋亡率與SFN呈明顯的劑量依賴性。

多數(shù)研究結(jié)果顯示，CYR61基因?qū)Σ煌M織的腫瘤發(fā)展起不同的調(diào)控作用。CYR61在乳腺癌、橫紋肌肉瘤、結(jié)腸腺癌、卵巢癌等癌組織中高度表達(dá)[12]；在非小細(xì)胞肺癌、前列腺癌、肝癌等組織中低度表達(dá)[13]。該研究中，定量Real-PCR結(jié)果顯示，SFN干預(yù)32 h后40 μM SFN濃度組的CYR61基因表達(dá)量顯著高于其他組。80 μM SFN濃度組的CYR61基因表達(dá)量降低可能與干預(yù)濃度過高導(dǎo)致活細(xì)胞數(shù)量減少有關(guān)。SFN可能是小細(xì)胞肺癌的潛在治療藥物，其機(jī)制可能是通過增加CYR61基因的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)，具體機(jī)制還需深入研究。

綜上所述，SFN可抑制肺癌細(xì)胞株的生長(zhǎng)，可能是治療肺癌的一個(gè)潛在藥物，且其提取于天然十字花科植物，毒副作用小。因此，加強(qiáng)對(duì)十字花科植物中萊菔硫烷功能的研究，以十字花科植物為原料研制具有抗癌作用的食源性藥物，具有重要的意義。

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[責(zé)任編校：楊紅梅]

Inhibition of Sulforaphane on H446 Cell Lines and its Effect on CYR61 Expression

YANG Guo-jun1， LI Ning2， WANG Bao-wei1， LI Yi-pei， LI Yan1

(1.HenanMedicalCollege,Zhengzhou451191； 2.HenanAgriculturalUniversity,Zhengzhou450000,China)

Objective To explore the inhibition of SFN on H446 cell lines and its effects on CYR61 expression. Methods The inhibition of SFN on H446 cell lines was detected by MTT. The cell apoptosis was detected by flow cytometry. CYR61 expression level in H446 lung cancer cell lines was identified by real-time PCR. Results MTT results indicated that SFN had a restrain effect with a dose-dependent manner when the concentration exceeded 20 μM. The expression of CYR61 was higher in the SFN intervention group of 40 μM and its difference compared with other groups has statistical significance.Conclusion SFN inhibited the growth of H446 cells in a concentration-depended manner and promoted CYR61 expression of H446 lung cancer cell lines, which provides basis for vegetable-broccoli in the prevention of lung cancer.

sulforaphane; H446; CYR61; Real-time PCR

2014-11-10

楊國(guó)俊(1968-)，男，河南省周口市人，碩士，副教授，從事營(yíng)養(yǎng)與疾病的研究。

河南省重點(diǎn)科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào)：142102310089)。

R 730.1

A

1008-9276(2015)04-0413-03