霍中華，張曉燕，邱 彥，劉菲菲

·臨床醫(yī)學(xué)··論著·

微小RNA-143誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞株BGC-S23凋亡機(jī)制的探討

霍中華，張曉燕，邱 彥，劉菲菲

目的 探討微小RNA-143(miRNA-143)誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞BGC-823產(chǎn)生凋亡的機(jī)制。方法 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2,bcl-2)3'非編碼區(qū)(untranslation region,UTR)是否存在miRNA-143的結(jié)合位點(diǎn)；熒光定量及免疫印跡方法檢測(cè)胃癌細(xì)胞株(BGC-823)及正常胃黏膜細(xì)胞株(GES-1)中Bcl-2 mRNA及其蛋白含量；熒光素酶報(bào)告基因法驗(yàn)證結(jié)合位點(diǎn)；化學(xué)法合成miRNA-143-mimics、inhibitor及NC序列并轉(zhuǎn)染BGC-823細(xì)胞,轉(zhuǎn)染后48 h收集細(xì)胞、蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Bcl-2蛋白含量；實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間點(diǎn)BGC-823細(xì)胞內(nèi)miRNA-143含量變化,同時(shí)流式法檢測(cè)BGC-823細(xì)胞凋亡。結(jié)果 與GES-1細(xì)胞比較,BGC-823細(xì)胞中Bcl-2蛋白含量及miRNA-143含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；miRNA-143-mimics、miRNA-143-inhibitor與野生型熒光素酶報(bào)告基因共轉(zhuǎn)染組可以明顯抑制或者增強(qiáng)熒光素酶活性,轉(zhuǎn)染后48 h,組間酶活性差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),miRNA-143-mimics和miRNA-143-inhibitor轉(zhuǎn)染對(duì)突變型熒光素酶報(bào)告基因活性無(wú)明顯影響,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；BGC-823細(xì)胞轉(zhuǎn)染miRNA-143-mimics和miRNA-143-inhibitor能夠明顯抑制或者促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)Bcl-2蛋白表達(dá),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；miRNA-143-mimics和miRNA-143-inhibitor轉(zhuǎn)染細(xì)胞能夠明顯引起細(xì)胞內(nèi)miRNA-143含量的改變,轉(zhuǎn)染后48 h,miRNA-143-mimics轉(zhuǎn)染組細(xì)胞內(nèi)miRNA-143含量明顯上升,miRNA-143-inhibitor轉(zhuǎn)染組細(xì)胞內(nèi)miRNA-143含量明顯下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染對(duì)照組和轉(zhuǎn)染對(duì)照組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果表明,miRNA-143表達(dá)量的升高能夠明顯引起B(yǎng)GC-823細(xì)胞的凋亡,基因干預(yù)組與轉(zhuǎn)染對(duì)照組相比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論 miRNA-143通過(guò)抑制Bcl-2基因表達(dá),可引起胃癌細(xì)胞株BGC-823細(xì)胞產(chǎn)生凋亡。

B淋巴細(xì)胞瘤-2；胃癌細(xì)胞株；微小RNA-143；凋亡

據(jù)統(tǒng)計(jì),近5年來(lái),我國(guó)每年新發(fā)胃癌40萬(wàn)例,發(fā)病率占全世界的42%左右,我國(guó)胃癌患者約占全球胃癌患者總數(shù)的40%［1］。預(yù)計(jì)到2015年,我國(guó)胃癌的發(fā)病率還將以每年1.6%的幅度攀升,數(shù)據(jù)驚人,研究胃癌發(fā)病機(jī)制,尋找新的有效治療途徑,刻不容緩。

在Bcl-2蛋白家族中,目前已發(fā)現(xiàn)25種Bcl-2同源蛋白,其成員與細(xì)胞凋亡具有密切的關(guān)系。人Bcl-2基因于1984年被發(fā)現(xiàn),Bcl-2基因在眾多調(diào)節(jié)細(xì)胞程序性凋亡家族基因中被發(fā)現(xiàn)［2］。細(xì)胞增殖異常性疾病,同時(shí)也是細(xì)胞凋亡異常性疾病,細(xì)胞凋亡失控是導(dǎo)致腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要方面,有研究表明, Bcl-2做為凋亡的抑制物,其與胃癌的關(guān)系密切［3-4］。胃癌的形成與Bcl-2的高表達(dá)有關(guān),而且主要作用階段在癌變的早期,提示Bcl-2蛋白可能在胃癌的發(fā)病和治療反應(yīng)性方面起重要作用［5］。由于Bcl-2基因異常表達(dá)導(dǎo)致腫瘤惡性程度不斷升高,Bcl-2基因不同程度地參與了胃癌的凋亡調(diào)控［3］,故Bcl-2基因與胃癌的演進(jìn)有關(guān),在腫瘤的化療中Bcl-2基因可通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡而影響有效的治療。本研究對(duì)胃癌細(xì)胞株BGC-823細(xì)胞及正常胃黏膜細(xì)胞GES-1細(xì)胞中Bcl-2的基因蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)和差異分析,通過(guò)生物信息預(yù)測(cè)可能對(duì)Bcl-2基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控的miRNAs,通過(guò)熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)對(duì)預(yù)測(cè)靶位關(guān)系進(jìn)行驗(yàn)證,最終在BGC-823細(xì)胞中干預(yù)miRNA表達(dá),通過(guò)調(diào)整Bcl-2蛋白表達(dá)來(lái)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的可行性,為胃癌的臨床治療提供新的基因靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑

實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞株均購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞所。胎牛血清,RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基、胰蛋白酶為Hyclone公司產(chǎn)品,轉(zhuǎn)染試劑、Trizol,cDNA制備試劑盒均購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司,熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體和熒光素酶活性檢測(cè)均為Promega公司產(chǎn)品,蛋白一抗及二抗為美國(guó)CST公司產(chǎn)品,細(xì)胞總蛋白提取、定定量試劑盒、化學(xué)發(fā)光試劑盒均為美國(guó)Pierce公司產(chǎn)品,miRNA合成、測(cè)序均在上海生工進(jìn)行,細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒為BD公司產(chǎn)品。

1.2 儀器和設(shè)備

細(xì)胞培養(yǎng)箱為日本三洋公司產(chǎn)品,離心機(jī)為Beckman公司產(chǎn)品,微量移液器為Gilson公司產(chǎn)品,電泳儀,垂直電泳槽及濕法轉(zhuǎn)膜儀均為Bio-rad公司產(chǎn)品,酶標(biāo)儀Thermo公司產(chǎn)品,PCR儀購(gòu)于ABI公司,流式細(xì)胞儀為BD公司產(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 以Bcl-2為靶基因的miRNAs預(yù)測(cè) 采用targetscan預(yù)測(cè)軟件對(duì)Bcl-2(NM_000633)3'UTR區(qū)是否存在miRNA的結(jié)合位點(diǎn)。分析結(jié)果顯示,miRNA-143在Bcl-2基因3'UTR區(qū)存在結(jié)合位點(diǎn),預(yù)測(cè)結(jié)果顯示(圖1),hsa-miRNA-143在Bcl-2基因的3' UTR區(qū)存在7個(gè)堿基的種子區(qū)。

圖1 hsa-m iRNA-143與Bcl-2的靶位關(guān)系預(yù)測(cè)

1.3.2 胃癌細(xì)胞株BGC-823及正常胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1中Bcl-2蛋白含量及miRNA-143相對(duì)含量分析 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BGC-823細(xì)胞及GES-1細(xì)胞各5×106個(gè),離心5 min收集細(xì)胞沉淀,分別提取細(xì)胞總蛋白和細(xì)胞總RNA,Western blotting檢測(cè)Bcl-2蛋白含量,RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)miRNA-143含量。(1)蛋白質(zhì)印跡分析Bcl-2蛋白相對(duì)含量:向細(xì)胞沉淀中加入1 ml無(wú)菌磷酸鹽緩沖液(dPBS)洗細(xì)胞兩遍,去掉dPBS,每孔加入0.5 ml細(xì)胞裂解液,按照試劑盒說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞總蛋白,BCA法定量細(xì)胞總蛋白濃度。定量后的細(xì)胞總蛋白,每組10μl進(jìn)行垂直電泳,SDS-聚丙烯酰胺凝膠分離膠濃度為10%,經(jīng)110 V電壓90 min電泳后,立春紅染色觀(guān)察蛋白條件是否完整,400 mA電流轉(zhuǎn)膜90 min,轉(zhuǎn)膜后5%的脫脂牛奶封閉2 h,4℃一抗過(guò)夜孵育,Bcl-2和GAPDH一抗稀釋(TBST)比分別為1∶300和1∶1 000；TBST洗膜3次,加入二抗孵育2 h,羊抗鼠二抗稀釋比為1∶4 000；TBST洗膜3次,添加化學(xué)發(fā)光液反應(yīng)底物,暗室曝光,掃描曝光底片,統(tǒng)計(jì)目的條帶光密度值。目的蛋白光密度值/GAPDH光密度值,即為檢測(cè)蛋白相對(duì)含量。(2)成熟體miRNA-143含量檢測(cè):對(duì)于每組細(xì)胞沉淀,使用4℃預(yù)冷dPBS洗去細(xì)胞表面殘留的培養(yǎng)液及血清；去掉PBS,每孔加入1 ml。4℃預(yù)冷的Trizol細(xì)胞裂解液,震蕩培養(yǎng)板充分裂解細(xì)胞,4℃5 min,將分層后的溶液上清轉(zhuǎn)移到無(wú)菌1.5 m l離心管,酚氯仿法抽提RNA,得到沉淀后用20μl DEPC水溶解,瓊脂糖凝膠電泳觀(guān)察RNA純度及完整性,紫外分光光度測(cè)定RNA濃度。取2μl的總RNA,逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA,特異反轉(zhuǎn)錄引物,H.sapiens 6 snRNA:5'-TACCTTGCGAAGTGCTTAAAC-3',miRNA-143:5'-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGAAGAGCT-3',取2μl反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為PCR反應(yīng)模板,熒光定量法檢測(cè)miRNA-143含量檢測(cè)。2ΔΔCt法分析定量結(jié)果,內(nèi)參選用U6(NM_001101. 3)。PCR反應(yīng)引物序列為:U6-上游引物,5'-GTGCTCGCTTCGGCAGCACAT-3',U6-下游引物5'-TACCTTGCGAAGTGCTTAAAC-3'；miRNA-143-上游引物5'-GCCGGCGCCCGAGCTCTGGCTC-3',miRNA-143-下游引物5'-TGAGATGAAGCACTGTAGCTC-3'。PCR反應(yīng)使用20μl體系,其中,SYBR Premix Ex Tap 10μl,引物(20μM)各取0.2μl,模板使用量為2μl,反應(yīng)體系用無(wú)菌H2O補(bǔ)足。PCR反應(yīng)條件: 95℃變性10 s；58℃退火10 s；72℃延伸10 s,循環(huán)數(shù)設(shè)置為40。

1.3.3 hsa-miRNA-143與Bcl-2預(yù)測(cè)靶位關(guān)系的驗(yàn)證 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期293細(xì)胞,Trizol裂解法提取細(xì)胞總RNA,反轉(zhuǎn)錄制備cDNA。設(shè)計(jì)針對(duì)Bcl-2基因3' UTR區(qū)設(shè)計(jì)PCR引物:上游引物為,5'-GCTCTAGA TTATATACCATTTATCTG-3',下游引物為,5'-GCTCTAGA TTTGCTCACAAATAGTGTATAGG-3',引物兩端分別添加X(jué)baI酶切位點(diǎn),PCR擴(kuò)增包含miRNA-143靶位“5'-CAUCUCA-3'”在內(nèi)的162 bp長(zhǎng)的堿基序列。取2μl cDNA為模板,使用上面引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,94℃變性30s,55℃退30 s,72℃延伸10s,循環(huán)數(shù)為38個(gè)。擴(kuò)增后使用XbaI對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切處理,酶切回收目的片段后克隆到PGL3-promoter熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體,重組載體經(jīng)序列分析后命名為pGL3-Pro-WT-Bcl-2。以pGL3-Pro-WT-Bcl-2為基礎(chǔ),對(duì)miRNA-143靶位進(jìn)行點(diǎn)突變,即將“5'-CATCTCA-3'”突變?yōu)椤?'-ACCTATC-3'”,構(gòu)建突變型熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體pGL3-Pro-MT-Bcl-2。對(duì)2組熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體進(jìn)行無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒DNA提取。同時(shí),化學(xué)法合成RNA:miRNA-143-mimics,miRNA-143-inhibitor, miRNA-143-NC。

選取生長(zhǎng)狀況良好且處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的第三代293細(xì)胞,用胰酶消化并制備細(xì)胞懸液,臺(tái)酚藍(lán)染色后使用血小球計(jì)數(shù)板進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù),使用完全培養(yǎng)基(DMEM+10%胎牛血清)調(diào)整細(xì)胞密度為1× 105個(gè)/m l,將細(xì)胞接種到6孔板,每孔加2 m l細(xì)胞懸液,37℃和5%CO2條件下培養(yǎng)24 h,參照Lipofectmaine 2000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行質(zhì)粒和RNA共轉(zhuǎn)染,同時(shí)每組細(xì)胞轉(zhuǎn)染100 ng的pGL-TK(海腎熒光素酶報(bào)告基因)作為熒光霉素活性的檢測(cè)參照。轉(zhuǎn)染后48 h,使用Promega公司的雙熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)和熒光素酶檢測(cè)儀進(jìn)行熒光素酶含量檢測(cè)。

1.3.4 轉(zhuǎn)染miRNA-143對(duì)胃癌細(xì)胞株BGC-823胞內(nèi)Bcl-2蛋白表達(dá)影響檢測(cè) 細(xì)胞轉(zhuǎn)染取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BGC-823細(xì)胞,胰酶消化后收集細(xì)胞,使用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度至1×105個(gè)/ml,接種細(xì)胞到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板,每孔添加2 ml細(xì)胞懸液,37℃和5%CO2條件下培養(yǎng)24 h,后進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn),轉(zhuǎn)染過(guò)程按照Lipofectmaine 2000說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。收集轉(zhuǎn)染后48 h的細(xì)胞,提取細(xì)胞總蛋白,Western blotting檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Bcl-2蛋白相對(duì)含量。

1.3.5 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞凋亡及細(xì)胞內(nèi)miRNA-143含量檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)分為未轉(zhuǎn)染組、轉(zhuǎn)染對(duì)照組(NC)和miRNA-143-mimics單構(gòu)轉(zhuǎn)染組,取轉(zhuǎn)染后48 h的BGC-823細(xì)胞,使用不含EDTA的0.25%胰酶消化細(xì)胞,收集細(xì)胞沉淀,使用dPBS洗細(xì)胞2遍,收集細(xì)胞沉淀,按Annexin V-FITC凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)加入PI及FITC,避光室溫孵育20 min后,上機(jī)檢測(cè)。激發(fā)波長(zhǎng)Ex=488 nm,Annexin V-FITC的綠色熒光通過(guò)FITC通道(FL1)檢測(cè),紅色熒光通過(guò)PI通道(FL2)檢測(cè)。同時(shí),收集細(xì)胞,提取細(xì)胞總RNA, RealTime-PCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)miRNA-143相對(duì)含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有操作均以SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件完成,實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,采用單因素方差分析,其中多組資料兩兩比較采用LSD多重檢驗(yàn),檢驗(yàn)水準(zhǔn)a=0.05。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌細(xì)胞BGC-823及胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1細(xì)胞中Bcl-2蛋白及miRNA134含量檢測(cè)

2組細(xì)胞中Bcl-2蛋白含量檢測(cè)結(jié)果(圖1A)顯示,BGC-823細(xì)胞中Bcl-2蛋白相對(duì)含量(2.17± 0.28)明顯高于GES-1細(xì)胞(1.00±0.81),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01),這說(shuō)明Bcl-2在胃癌細(xì)胞中呈高表達(dá)。miRNA-134相對(duì)含量檢測(cè)數(shù)據(jù)(圖1B)說(shuō)明,BGC-823細(xì)胞中miRNA-143相對(duì)含量(0.21± 0.01)明顯低于GES-1細(xì)胞(1.00±0.10),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。2組結(jié)果說(shuō)明,在胃癌細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)與miRNA143含量顯著負(fù)相關(guān)(相關(guān)系數(shù)為0.91)。

2.2 熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體構(gòu)建

PCR擴(kuò)增得到特異的PCR產(chǎn)物,通過(guò)與DNA Marker比對(duì),其大小與理論值(172 bp)完全相符(圖2A)。成功構(gòu)建野生型熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體,并通過(guò)點(diǎn)突變成功構(gòu)建野生型熒光素酶基因表達(dá)載體,測(cè)序分析與標(biāo)準(zhǔn)序列完全一致(圖2B)。

2.3 hsa-miRNA-143與Bcl-2基因靶位關(guān)系驗(yàn)證

分別共轉(zhuǎn)染miRNA-143-mimics、miRNA-143-inhibitor、miRNA-143-NC與2組熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體pGL3-Pro-WT-Bcl-2和pGL3-Pro-MT-Bcl-2,轉(zhuǎn)染后48 h,對(duì)于野生型熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體,miRNA-143-mimic能夠明顯抑制熒光素酶活性,從36.80±6.18降至7.20±1.23,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01),而miRNA-143-inhibitor轉(zhuǎn)染組熒光素酶相對(duì)活性則從36.80±6.18上升到55.40± 9.12,與單獨(dú)野生型熒光素酶轉(zhuǎn)染組(37.8±4.2)比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；對(duì)于突變性熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體,miRNA-143-mimic共轉(zhuǎn)染(40.2±4.5)與pGL3-Pro-MT-Bcl-2單獨(dú)轉(zhuǎn)染組(39.8±4.1)比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05), miRNA-143-inhibitor轉(zhuǎn)染(39.2±4.9)對(duì)突變型熒光素酶報(bào)告基因活性(49.8±4.1)也無(wú)明顯影響(P＞0.05)；miRNA-143-NC與pGL3-Pro-WT共轉(zhuǎn)染組(36.60±7.22)對(duì)野生型熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體轉(zhuǎn)染組熒光素酶活性(36.80±6.18)明顯影響,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),miRNA-143-NC與pGL3-Pro-MT共轉(zhuǎn)染組(49.7±4.4)對(duì)突變型熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體轉(zhuǎn)染組熒光素酶活性(49.8± 4.1)明顯影響,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。以上數(shù)據(jù)和結(jié)果說(shuō)明,miRNA-143與Bcl-2基因之間的預(yù)測(cè)靶位確實(shí)存在。

圖1 胃癌細(xì)胞BGC-S23及胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1細(xì)胞中Bcl-2蛋白及m iRNA134含量檢測(cè)

圖2 克隆構(gòu)建及序列分析

2.4 轉(zhuǎn)染后BGC-823細(xì)胞內(nèi)Bcl-2蛋白含量檢測(cè)

Western blotting檢測(cè)轉(zhuǎn)染miRNA-143后BGC-823細(xì)胞中Bcl-2蛋白相對(duì)含量。細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后,轉(zhuǎn)染組細(xì)胞內(nèi)Bcl-2蛋白含量較轉(zhuǎn)染對(duì)照組及對(duì)照轉(zhuǎn)染組均有明顯變化,其中轉(zhuǎn)染對(duì)照組Bcl-2蛋白含量為1.00±0.25,mimics轉(zhuǎn)染組細(xì)胞內(nèi)Bcl-2蛋白含量為0.19±0.02,組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01),inhibitor轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞內(nèi)Bcl-2蛋白則上升至1.36±0.36,與轉(zhuǎn)染對(duì)照組(1.00±0.25)比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),轉(zhuǎn)染對(duì)照組(1.00± 0.25)與未轉(zhuǎn)染組(0.96±0.12)比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),說(shuō)明轉(zhuǎn)染試劑及轉(zhuǎn)染過(guò)程對(duì)BGC-823細(xì)胞內(nèi)Bcl-2蛋白表達(dá)無(wú)明顯影響。見(jiàn)圖3。

圖3 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞內(nèi)Bcl-2蛋白含量檢測(cè)圖

2.4 miRNA-143含量變化對(duì)BGC-823細(xì)胞凋亡的影響

細(xì)胞轉(zhuǎn)染后48 h,收集細(xì)胞,雙染法檢測(cè)轉(zhuǎn)染miRNA-143后細(xì)胞凋亡變化。流式檢測(cè)結(jié)果顯示,未轉(zhuǎn)染組,NC轉(zhuǎn)染組和miRNA-143-mimics轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的凋亡率分別為(16.22±2.11)%、(16.92± 1.83)%和(48.25±4.13)%,miRNA-143轉(zhuǎn)染組與未轉(zhuǎn)染組及陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染組比較,均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。這說(shuō)明,miRNA143表達(dá)升高,可以使腫瘤細(xì)胞BGC-823產(chǎn)生凋亡。見(jiàn)圖4。

3 討論

microRNAs(miRNAs,微小RNA)是一類(lèi)分布廣泛的內(nèi)源性非編碼蛋白質(zhì)的RNA,核酸長(zhǎng)度一般為20～25個(gè)堿基。miRNAs具有高度保守的遺傳學(xué)特性,通過(guò)與基因3'UTR區(qū)的靶點(diǎn)結(jié)合,對(duì)基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控［6］。miRNAs與腫瘤的形成和發(fā)展具有密切關(guān)系,其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用更已成為國(guó)際生命醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)之一［7］。miRNA的表達(dá)與多種腫瘤進(jìn)展及預(yù)后相關(guān),可作為腫瘤標(biāo)志分子。研究顯示,固有的miRNA調(diào)控機(jī)制失常,是多種腫瘤中癌基因及抑癌基因異常表達(dá)的內(nèi)在原因［8］。

圖4 細(xì)胞增殖活性及m iRNA-143含量檢測(cè)圖

miRNA可以作為癌基因或抑癌基因發(fā)揮促癌或抑癌作用,miRNA與胃癌關(guān)系密切［9-10］。有研究人員使用miRNA芯片技術(shù)對(duì)胃癌及癌旁組織進(jìn)行表達(dá)譜分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)miRNA-21、miRNA-191、miRNA-223、miRNA-24、miRNA-107、miRNA-92和miRNA-221等在胃癌中呈高表達(dá)［11］,也有研究發(fā)現(xiàn),相比于正常組織,胃癌組織中miRNA-128b、miRNA-129和miRNA-148的表達(dá)顯著降低［12］。胃癌是一種多基因疾病,其發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多步驟參與、多種相關(guān)基因失活的結(jié)果,而miRNA在胃癌的發(fā)生發(fā)展中具有致癌或者作抑癌的雙重作用,microRNA在胃癌中表達(dá)失調(diào)的情況被相繼報(bào)道,Zhang等［13］研究發(fā)現(xiàn)miRNA-650在胃癌中表達(dá)上調(diào),miRNA-21在人胃癌組織及細(xì)胞株中顯著性過(guò)表達(dá)［14］,而miRNA-218被證實(shí)有潛力作為抑制胃癌轉(zhuǎn)移的靶向治療候選基因之一,miRNA-101在胃癌組織和胃癌細(xì)胞中顯著低表達(dá)。并且miRNA-101過(guò)表達(dá)可以明顯抑制細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移［15］。盡管胃癌與miRNA關(guān)系的研究已取得一定的進(jìn)展,尋找miRNA的靶蛋白或靶基因,研究調(diào)控miRNA表達(dá)的分子機(jī)制從而指導(dǎo)基因治療仍是該領(lǐng)域重要的研究方向。miRNAs是否通過(guò)Bcl-2對(duì)胃癌細(xì)胞凋亡產(chǎn)生調(diào)控作用,是一個(gè)值得研究的課題。

實(shí)驗(yàn)中,筆者嘗試并尋找miRNA-143通過(guò)其靶基因Bcl-2基因?qū)ξ赴┘?xì)胞凋亡具有調(diào)控作用的,并最終應(yīng)運(yùn)miRNA理論來(lái)解釋miRNA-143-Bcl-2與BGC-823細(xì)胞之間的關(guān)系。研究中,首先利用miRNA靶位的生物學(xué)預(yù)測(cè)在線(xiàn)軟件TargetScan進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)在Bcl-2的3'UTR有兩處位置存在miRNA-145的結(jié)合位點(diǎn),對(duì)于預(yù)測(cè)的結(jié)合位點(diǎn),則進(jìn)一步通過(guò)熒光素酶報(bào)告基因進(jìn)行了驗(yàn)證,miRNA-143可以用過(guò)其位于保守區(qū)的結(jié)合位點(diǎn),結(jié)合于3'UTR,并對(duì)其上有的基因翻譯產(chǎn)生抑制作用。而非保守區(qū)位點(diǎn)為無(wú)效位點(diǎn),之所以出現(xiàn)這樣的原因,可能與位點(diǎn)所處位置有關(guān),另外,從miRNA進(jìn)化的角度考慮,其對(duì)于靶基因結(jié)合區(qū)域的物種間保守性也是要求較高的。

研究結(jié)果表明,胃癌細(xì)胞株BGC-823細(xì)胞中的Bcl-2蛋白表達(dá)明顯高于正常胃黏膜細(xì)胞株,而miRNA-143含量在兩組細(xì)胞中的趨勢(shì)與Bcl-2蛋白含量負(fù)相關(guān)；通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法在BGC-823細(xì)胞內(nèi)可以有效干預(yù)miRNA-143的表達(dá),在BGC-823細(xì)胞中,過(guò)表達(dá)miRNA-143可以通過(guò)抑制Bcl-2蛋白的表達(dá)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生凋亡增加的趨勢(shì)。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果和數(shù)據(jù)提示,miRNA-143的低表達(dá)可能是BGC-823細(xì)胞中Bcl-2基因異常的關(guān)鍵原因,通過(guò)基因干預(yù)的方法在BGC-823細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miRNA-143,可以通過(guò)抑制其靶基因Bcl-2基因的表達(dá),有效誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的過(guò)程在實(shí)驗(yàn)中均得到證實(shí)。本研究的意義在于證實(shí)miRNA-143的低表達(dá)是BGC-823細(xì)胞中Bcl-2蛋白高表達(dá)的主要原因,在細(xì)胞內(nèi)過(guò)表達(dá)miRNA-143可以增加腫瘤細(xì)胞凋亡,這為以新的基因?yàn)榘悬c(diǎn)的藥物開(kāi)發(fā)提供了新的思路。

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Study on themechanism involving the apoptosis of BGC-S23 strain induced by m iRNA-143

Huo Zhonghua,Zhang Xiaoyan,Qiu Yan,Liu Feifei

(No.454 Hospital of CPLA,Nanjing 210002,China)

Objective To investigate the mechanism involving the apoptosis of BGC-823 strain induced by miRNA-143. M ethods Fluorometry and Western blotwere used to detect Bcl-2 mRNA and the protein contents in the gastric cancer strain(BGC-823)and normal gastric mucosa strain(GES-1).We verified the binding site by a Lnciferase reportermethod.MiRNA-143-mimics,inhibitor and NCwere chemically synthesized.Bcl-2 protein levelsweremeasured byWestern blotting 48 hours after transiently transfected with eithermiRNA-143mimics,inhibitors,or negative controlmiRNAs into BGC-823 cells.Apoptosis assayswere employed to evaluate cell apoptosis in BGC-823 strain,and miRNA-143 expression levels in BGC-823 weremeasured by quantitative PCR(qPCR)simultaneously at different time points after transfection.Results The study successfully predicted and verified the putative miRNA-143 binding site in the 3'UTR of human Bcl-2 gene.Bcl-2 level in BGC-823 cellswas significantly increased andmiRNA-143 levelwas decreased,as compared with that of GES-1 cells,and significant differences could be noted,when comparisons were made between the groups(P＜0.01).Research results indicated thatmiRNA-143-mimics/miRNA-143-inhibitor and the wild type luciferase reporter geneco-transfection significantly reduced and induced the activity of luciferase.Forty-eight hours after transfection,statistical significance could be noticed,when the co-transfection group was compared with the single transfection group(P＜0.05).The transfection ofmiRNA-143-mimics and miRNA-143-inhibitors had no significanteffects on the activity ofmutant luciferase reporter gene.Statistical significance could be seen,when the co-transfection group was compared with the single transfection group(P＜0.05).Furthermore,the transfection ofmiRNA-143-mimics and miRNA-143-inhibitor could significantly inhibit or enhance the expression of Bcl-2 protein,and statistical significance could be found,when itwas compared with the control group(P＜0.05).miRNA-143-mimics and miRNA-143-inhibitor transfected cells could induce changes inmiRNA-143 level.Forty-eighthours after transfection,miRNA-143 level in themiRNA-143-mimics transfected cellswas obviously elevated,while that in themiRNA-143-inhibitor was significantly reduced,and statistical significance could also be noted,when itwas compared with the control group(P＜0.05).There were no significant differences in miRNA-143 levels,when the negative control group was compared with the transfected control group(P＜0.05).Results of apoptosis detection indicated that the elevated expression levelofmiRNA-143 could significantly induce apoptosis of BGC-823,and statistical significance could be seen,when the gene intervention group was compared with the transfected control group(P＜0.05).Conclusion Through the inhibition of Bcl-2 gene expression,miRNA-143 could induce the apoptosis of the gastric cancer BGC-823 strain.

Bcl-2；BGC-823；miRNA-143；Apoptosis

R34

A

10.3969/j.issn.1009-0754.2015.06.012

2015-07-07)

(本文編輯:張陣陣)

210002 南京,解放軍第四五四醫(yī)院(霍中華、邱彥)；南京軍區(qū)聯(lián)勤部衛(wèi)生部苜蓿園路干休所(張曉燕)；濟(jì)南軍區(qū)空軍司令部門(mén)診部(劉菲菲)