林源

(浙江省溫嶺市中醫(yī)院藥劑科，溫嶺 317500)

高效液相梯度洗脫法同時測定情安喘定片5種成分

林源

(浙江省溫嶺市中醫(yī)院藥劑科，溫嶺 317500)

目的 采用高效液相梯度洗脫法，同時測定情安喘定片中蕓香苷、槲皮苷、補骨脂素、佛手柑內(nèi)酯和芹菜素含量。方法 采用依利特Hypersil C18色譜柱(200 mm×4.6 mm，5 μm)；流速：0.9 mL·min-1；以甲醇(A)-0.1%磷酸溶液(B)為流動相進行梯度洗脫；檢測波長：蕓香苷和槲皮苷為254 nm，補骨脂素、佛手柑內(nèi)酯和芹菜素為269 nm，柱溫為35 ℃。結(jié)果 蕓香苷、槲皮苷、補骨脂素、佛手柑內(nèi)酯和芹菜素質(zhì)量濃度分別在6.06～121.20 μg·mL-1(r=0.999 9)、5.80～116.00 μg·mL-1(r=0.999 2)、4.65～93.00 μg·mL-1(r=0.999 7)、7.10～142.00 μg·mL-1(r=0.999 5)、6.30～126.00 μg·mL-1(r=0.999 3)時與其峰面積呈良好的線性關(guān)系；蕓香苷、槲皮苷、補骨脂素、佛手柑內(nèi)酯和芹菜素的平均加樣回收率分別為99.26%，98.28%，97.12%，98.05%，96.72%，RSD(n=6)分別為0.76%，1.54%，0.64%，0.87%，0.61%。結(jié)論 該方法是一種快速、靈敏、準確的分析方法，可用于情安喘定片的質(zhì)量控制。

情安喘定片；蕓香苷；槲皮苷；補骨脂素；佛手柑內(nèi)酯；芹菜素

情安喘定片處方源自國家藥品標準中藥成方制劑第九冊[1]，由魚腥草、五指毛桃、榕樹葉、胡頹子、珍珠層粉、冰片、鹽酸雙氯醇胺等7味藥物組成，氣芳香，味苦澀、辛。具有平喘、止咳、祛痰、消炎之功效，可用于慢性支氣管炎、支氣管哮喘等癥的治療。魚腥草和五指毛桃為方中的主要藥物，原部頒標準中僅對性狀和個別藥材進行顯色鑒別，未對方中的任何藥物進行含量測定[1-2]，很難有效控制產(chǎn)品的質(zhì)量和療效。筆者采用高效液相梯度洗脫法對情安喘定片魚腥草中的蕓香苷、槲皮苷和五指毛桃中的補骨脂素、佛手柑內(nèi)酯、芹菜素進行含量測定，為完善該制劑質(zhì)量標準提供依據(jù)。本方法快速、靈敏、準確，可作為情安喘定片中蕓香苷、槲皮苷、補骨脂素、佛手柑內(nèi)酯和芹菜素的控制方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1200 高效液相色譜儀(安捷倫科技(中國)有限公司，含G1311A四元泵、G1330B自動進樣器恒溫器、G1322A脫氣機、Chemstation色譜工作站、G1315B可變波長檢測器)。

1.2 試藥 蕓香苷對照品(批號：100080-201408，含量：90.2%)、槲皮苷對照品(批號：111538-200504，含量：92.9%)、補骨脂素(批號：110739-201115，含量：99.3%)、芹菜素(批號：111901-201102，含量：99.6%，置五氧化二磷干燥器中減壓干燥12 h后使用)均購于中國食品藥品檢定研究院；佛手柑內(nèi)酯(批號：484-20-8，含量：98.0%)購于上海同田生物技術(shù)有限公司；情安喘定片(規(guī)格：每片0.4 g，批號：131003，131005，131006)購于廈門中藥廠有限公司；陰性對照實驗藥材均購于浙江省臨海醫(yī)藥有限公司中藥飲片廠，經(jīng)各自藥材國家標準檢驗均符合要求；甲醇(色譜純，批號：20130507，含量：≥99.9%)、乙腈(色譜純，批號：20141006，含量：≥99.9%) 購于天津市康科德科技有限公司；磷酸(分析純，批號：20140608，含量：≥85.0%)購于廣州化學試劑二廠。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 依利特Hypersil C18柱(200 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相A為甲醇，流動相B為0.1%磷酸溶液[3-9]，梯度洗脫(0～10 min，20.0%A；～20 min，20.0%A→25.0%A；～40 min，25.0%A→35.0%A；～46 min，35.0%A→20.0%A)；檢測波長(0～20 min，λ1=254 nm[10]；～46 min，λ2=269 nm[11])；流速為0.9 mL·min-1；柱溫為35 ℃；進樣量20 μL。此系統(tǒng)條件下所測組分與其他組分分離效果良好，理論板數(shù)按芹菜素計算不得低于2 000，分離度均>2.0。

2.2 混合對照品溶液配制 取5種對照品蕓香苷、槲皮苷、補骨脂素、佛手柑內(nèi)酯和芹菜素各適量，精密稱定，分別置5個20 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，配制得蕓香苷、槲皮苷、補骨脂素、佛手柑內(nèi)酯和芹菜素質(zhì)量濃度分別為0.606，0.580，0.465，0.710，0.630 mg·mL-1的對照品儲備溶液。再分別精密吸取上述對照品儲備溶液5，2，4，2，1 mL置同一個50 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得蕓香苷、槲皮苷、補骨脂素、佛手柑內(nèi)酯與芹菜素質(zhì)量濃度分別為0.060 6，0.023 2，0.037 2，0.028 4，0.012 6 mg·mL-1的混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 取本品適量，研細，混勻，稱取約1.0 g，精密稱定，精密加入甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲波超聲提取40 min，取出，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.4 陰性對照溶液的制備 按情安喘定片處方比例稱取除魚腥草的其余藥味和除五指毛桃的其余藥味各1份，按情安喘定片的制備工藝分別制成魚腥草陰性對照樣品和五指毛桃陰性對照樣品[1]，按照“2.3”項下供試品溶液的制備方法制成魚腥草陰性對照溶液和五指毛桃陰性對照溶液。

2.5 專屬性實驗 分別精密吸取供試品溶液、混合對照品溶液、魚腥草陰性對照溶液及五指毛桃陰性對照溶液20 μL，按“2.1”項下色譜條件測定，結(jié)果在與蕓香苷、槲皮苷、補骨脂素、佛手柑內(nèi)酯和芹菜素對照品色譜圖相應(yīng)的保留時間處，供試品溶液色譜圖中有吸收峰；而魚腥草陰性對照溶液色譜圖中未顯示蕓香苷和槲皮苷吸收峰；五指毛桃陰性對照溶液色譜圖中未顯示補骨脂素、佛手柑內(nèi)酯和芹菜素吸收峰。色譜圖見圖1。

2.6 線性關(guān)系考察 分別精密吸取“2.2”項下各對照品儲備溶液0.1，0.2，0.5，1.0，2.0 mL，分別置5個10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。按“1.2”項下色譜條件進行測定，以峰面積Y與對照品質(zhì)量濃度X，得蕓香苷回歸方程為：Y=2.326 5×104X+513.4，r=0.999 9，線性范圍為6.06～121.20 μg·mL-1；槲皮苷Y=5.321 8×103X+317.1，r=0.999 2，線性范圍為5.80～116.00 μg·mL-1；補骨脂素Y=1.569 9×104X+602.7，r=0.999 7，線性范圍為4.65～93.00 μg·mL-1；佛手柑內(nèi)酯Y=1.098 1×104X+291.9，r=0.999 5，線性范圍為7.10～142.00 μg·mL-1；芹菜素Y=6.021 8×103X-591.3，r=0.999 3，線性范圍為6.30～126.00 μg·mL-1。結(jié)果表明：蕓香苷、槲皮苷、補骨脂素、佛手柑內(nèi)酯和芹菜素在各自的線性范圍內(nèi)，所測組分質(zhì)量濃度與峰面積線性關(guān)系良好。

2.7 精密度實驗 取“2.2”項下的混合對照品溶液按照“2.1”項下色譜條件，精密吸取混合對照品溶液20 μL，連續(xù)重復(fù)進樣6次，分別測得5種成分的峰面積，峰面積RSD分別為0.57%，0.98%，0.33%，0.56%和0.85%。結(jié)果表明，儀器精密度良好。

A.魚腥草陰性對照溶液；B.五指毛桃陰性對照溶液；C.對照品；D.樣品；1.蕓香苷；2.槲皮苷；3.補骨脂素；4.佛手柑內(nèi)酯；5.芹菜素

圖1 蕓香苷、槲皮苷、補骨脂素、佛手柑內(nèi)酯和芹菜素的HPLC圖

2.8 重復(fù)性實驗 稱取同一批號供試品，按“2.2”項下供試品溶液制備方法制備6份供試品溶液，按照“2.1”項下色譜條件依法進樣測定，計算各成分含量RSD分別為0.67%，0.25%，0.81%，0.59%和0.91%。結(jié)果表明，本法測定重復(fù)性良好。

2.9 穩(wěn)定性實驗 精密吸取同一供試品溶液(批號：131003)，在室溫下放置0，2，4，8，12，24 h后，每次進樣20 μL，測定其峰面積值，蕓香苷、槲皮苷、補骨脂素、佛手柑內(nèi)酯和芹菜素峰面積的RSD分別為0.52%，0.83%，0.29%，0.50%和0.73%。表明供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.10 加樣回收率實驗 取已知含量的同一批情安喘定片(批號：131003，蕓香苷為3.13 mg·g-1、槲皮苷為1.18 mg·g-1，補骨脂素為1.95 mg·g-1，佛手柑內(nèi)酯為1.44 mg·g-1，芹菜素為0.628 mg·g-1) 適量，研細，混勻，取約0.5 g，精密稱定，精密加入混合對照品溶液25 mL和甲醇25 mL，按“2.3”項下供試品溶液的配制方法制備加樣供試品試液。按“2.1”項下色譜條件進樣測定，計算5種組分回收率，結(jié)果見表1。

2.11 樣品測定 取3個批號的樣品甲組成分，按“2.3”項下供試品制備方法，按“2.1”項下色譜條件測定本品中蕓香苷、槲皮苷、補骨脂素、佛手柑內(nèi)酯和芹菜素含量，結(jié)果見表2。

3 討論

3.1 色譜條件的選擇 實驗過程中考察流動相乙腈-水梯度洗脫、甲醇-水梯度洗脫、甲醇-0.1%磷酸溶液梯度洗脫，結(jié)果以甲醇-0.1%磷酸溶液梯度洗脫時色譜峰分離較好，分離度均>2.0。本方法采用多波長梯度洗脫法同時測定情安喘定片中5種成分的含量，對有效控制該品種的質(zhì)量和療效意義重大。蕓香苷和槲皮苷的檢測波長參考文獻資料[10]和預(yù)實驗結(jié)果，該組分檢測波長定為254 nm；補骨脂素、佛手柑內(nèi)酯和芹菜素的檢測波長參考文獻資料[11]和預(yù)實驗結(jié)果，該組分檢測波長定為269 nm。

表1 蕓香苷、槲皮苷、補骨脂素、佛手柑內(nèi)酯和芹菜素加樣回收率實驗

批號蕓香苷槲皮苷補骨脂素佛手柑內(nèi)酯芹菜素1310031.25±0.010.472±0.0020.780±0.0050.576±0.0050.251±0.0071310051.39±0.020.523±0.0050.812±0.0080.594±0.0020.262±0.0031310061.16±0.010.491±0.0030.764±0.0030.569±0.0040.255±0.006

3.2 供試品溶液提取方法的選擇 在供試品溶液制備過程中，分別考察了加熱回流法、超聲提取法對蕓香苷、槲皮苷、補骨脂素、佛手柑內(nèi)酯和芹菜素5種成分的提取效率，結(jié)果顯示加熱回流提取與超聲提取法效率相當，但考慮到超聲波超聲提取較加熱回流簡便易行，故選取超聲提取法；超聲提取時間選取20，40，60 min進行考察，結(jié)果超聲提取40 min和超聲提取60 min提取率相差不大，但明顯高于提取20 min，故選取超聲波超聲提取40 min作為該品種中蕓香苷、槲皮苷、補骨脂素、佛手柑內(nèi)酯和芹菜素含量測定供試品溶液的提取方法。

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DOI 10.3870/yydb.2015.08.027

2014-05-19

2014-08-05

林源(1984-)，男，浙江溫嶺人，主管中藥師，學士，研究方向：中藥學。電話：(0)13566665731，E-mail：lunwenlinyuan@163.com。

R286；R927.2

B

1004-0781(2015)08-1086-04