熊 勇，趙春艷，楊青松，王錦琳

(1.云南民族大學 民族藥資源化學國家民委-教育部重點實驗室,云南 昆明 650500；2.昆明食用菌研究所,云南 昆明 650221)

燈盞花ITS2基因克隆及RNA二級結構預測

熊 勇1，趙春艷2，楊青松1，王錦琳1

(1.云南民族大學 民族藥資源化學國家民委-教育部重點實驗室,云南 昆明 650500；2.昆明食用菌研究所,云南 昆明 650221)

利用PCR方法擴增燈盞花ITS2基因并克隆，獲得ITS2基因序列.用生物軟件對ITS2序列進行分析并構建系統(tǒng)進化樹和RNA二級結構，得到燈盞花的ITS2核苷酸序列為205 bp，基于ITS序列飛蓬屬11種共分為5支，分支與地理分布情況基本一致.ITS2 RNA二級結構在飛蓬屬種間表現(xiàn)基本一致，而TS2區(qū)結構表現(xiàn)出屬間差異.利用rDNA ITS區(qū)序列一結構和二級結構相結合達到鑒定藥用植物燈盞花分類的目的.

燈盞花；基因克隆；ITS2；系統(tǒng)樹；RNA二級結構

燈盞花學名為短葶飛蓬Erigeronbreviscapus(Vant.)Hand.-Mazz,為菊科(Composttiae)紫苑族(Trib.AstereaeCass.)飛蓬屬(Ergeiorn)多年生草本植物，主要產(chǎn)于我國云南、貴州、四川等省，其中95%以上的野生資源分布于云南[1]，作為傳統(tǒng)民族藥，在云南少數(shù)民族苗族和白族地區(qū)的運用已有600多年歷史[2].從20世紀70年代開始，以燈盞花總黃酮為原料的燈盞花制劑廣泛應用于臨床，具有多種療效且療效好、安全性高，尤其是在治療心腦血管疾病方面，其總有效率達88.3%[3-4]，目前野生資源日益減少[5].為解決燈盞花藥材的資源短缺，在云南省很多地州燈盞花已經(jīng)大面積種植并推廣[6]，對當?shù)氐慕?jīng)濟發(fā)展起到重要的作用.由于燈盞花野生種值資源長期的自然選擇和生境的改變，以及栽培品種經(jīng)過長期的人工雜交選育等原因，導致部分基因流失[7]，栽培品種的遺傳多樣性豐富度在降低，因此利用有效的DNA分子方法對該藥用植物的鑒定具有重要的作用.DNA分子鑒定技術擁有傳統(tǒng)鑒定不可比擬的一些優(yōu)勢，已成功運用于多種中藥材鑒定[8]，其中核糖體DNA第二內(nèi)轉錄間隔區(qū)(rDNA ITS2)序列長度小于 300 bp，適合進行各種分子操作，而且變異較快，能夠提供較豐富的信息位點，已在藥用植物鑒別系統(tǒng)發(fā)育和分類研究中發(fā)揮重要作用[9].本文以云南燈盞花為材料，對其rDNA ITS2序列進行了克隆及序列測定，并將其與相關植物的序列進行比較分析，以此來鑒定藥用植物燈盞花，同時為我國藥材市場安全提供保障.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 植物材料

供試燈盞花來自云南省劍川縣沙溪鎮(zhèn)，實驗室栽種，新鮮燈盞花植物葉片作為材料.

1.1.2 試劑

2×PCR Master mix，DNA MarKer，PCR產(chǎn)物快速膠回收試劑盒，質粒puM-T，大腸桿菌感受態(tài)細胞，上述試劑及試劑盒均購于北京泰克生物技術有限公司.

1.1.3 引物

根據(jù)相關文獻設計引物[9]，設計引物由北京梓熙生物科技有限公司合成，燈盞花rDNA ITS2區(qū)域的引物的序列如表1：

表1 設計的引物序列

1.2 試驗方法

1.2.1 燈盞花總DNA的提取

燈盞花總DNA提取方法參照SDS法[10]，用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質量.

1.2.2 燈盞花的ITS2基因的PCR擴增

PCR擴增反應在Eppedorf PCR儀上進行，反應體系總體積50 μL：25 μL 2×Mixture，引物2R和引物2F各2 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 20 μL.

反應條件：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，32次循環(huán)，72 ℃再延伸10 min，最后4 ℃保存.擴增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)觀察結果.

1.2.3 燈盞花ITS2基因克隆

取PCR產(chǎn)物于1.5%膠進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，進行膠回收.將回收的DNA片段連接到puM-T載體上，于16 ℃反應3 h；將連接后的puM-T載體轉化到DH5α感受態(tài)宿主中培養(yǎng)；再將菌液涂布在含有X-gal底物、IPTG誘導物和氨芐青霉素的固體培養(yǎng)基平板中，利用藍白斑遺傳學篩選法篩選；挑選白色單一菌落，LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，提取質粒，將構建的重組質粒通過PCR法轉化子鑒定，將重組質粒送到生物公司進行測序.

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

用生物軟件DNAMAN對正向、反向測序結果進行拼接獲得燈盞花ITS2基因一致序列，并在NCBI上進行同源性比較，查看克隆結果的可靠性，去除5.8S和28S區(qū)段獲得ITS2間隔區(qū)序列.用Mega 6.0[11]中的 Kimura-2-parameter 模型計算遺傳距離，構建距離矩陣.以菊科飛蓬屬Erigeron為聚類基礎，用鄰接 (neighbor-joining method，N-J) 法構建系統(tǒng)進化樹，再用DNAstar[12]、ClassyTK1.0、RnaViz2.0[13]等繪制RNA二級結構.

2 結果與分析

2.1 燈盞花ITS2基因PCR擴增產(chǎn)物

燈盞花不同居群ITS2基因PCR擴增序列長度約在250～500 bp之間，PCR產(chǎn)物均出現(xiàn)清晰明顯條帶(圖1).

2.2 測序結果分析

用DNAMAN對正向、反向測序結果進行拼接獲得燈盞花ITS2基因一致序列，使用基于隱馬爾可夫模型的HMMer注釋方法去除兩端5.8S和28S區(qū)段獲得ITS2間隔區(qū)序列205 bp，燈盞花ITS2基因序列如圖2.

2.3 遺傳距離

以自測的燈盞花Erigeronbreviscapu為探針，在NCBI庫進行blast獲得飛蓬屬11個種，利用生物軟件Mega6.0中Kimura 2-parameter model分析飛蓬屬基于ITS2序列的種間遺傳距離并構建距離矩陣(表2).飛蓬屬種間的遺傳距離為0.000～0.051，Erigeronkarvinskianus[14]與其他種的遺傳距離均較大為 0.036～0.051;本研究獲得的燈盞花ITS2序列與NCBI庫中Erigeronbreviscapus(GU213433)遺傳距離最近，而與加勒比飛蓬Erigeronkarvinskianus最遠，與地理分布距離一致.

表2 飛蓬屬種間的遺傳距離

2.4 系統(tǒng)發(fā)育分析

將飛蓬屬的11個物種進行序列對比，并采用Mega軟件構建其N-J系統(tǒng)發(fā)育樹圖3(黑體為本研究獲得的燈盞花ITS2序列).系統(tǒng)發(fā)育樹共分成5支，Erigeronmorrisonensis、Erigeronborealis、Erigeronacris與Erigeronunifloru先聚在一起，然后再與Erigeronbreviscapus聚類，作為整個進化樹的核心.實驗所要研究的目的樣品Erigeronbreviscapus與GenBank庫中Erigeronbreviscapus(GU213433)聚在一起，說明本實驗結果準確，而Erigeronkarvinskianus[15]單獨聚在一起.燈盞花與飛蓬屬的其他物種有一定的差異，其他的物種聚在不同的分支，這可能與物種的地理分布有關系，如Erigeronbreviscapus(短葶飛蓬)主要生長在云南、西藏；Erigeronmorrisonensisvar(玉山飛蓬)等分布在臺灣，Erigeronursinus(一年蓬)等分布在四川、西藏、安徽等?。籈rigeronkarvinskianus(加勒比飛蓬)主要生長在北美，而臺灣也有分布.每個分支的物種基本與地理分布相符合.

2.5 燈盞花ITS2基因RNA二級結構分析

利用DNAstar中GenQuset、RnaViz2.0等軟件構建本研究獲得的Erigeronbreviscapus、GeneBank下載的Erigeronkarvinskianus(AF118487)以及菊屬雛菊Bellisperennis(JX065158)[15]rDNA ITS2區(qū)序列二級結構，并分析結構上的差異，結果見圖4～6.

短葶飛蓬(燈盞花)Erigeronbreviscapus與加勒比飛蓬Erigeronkarvinskianus在一級結構上具有一定的差異，基于ITS2核苷酸序列在11個飛蓬屬的種間距離也較遠，但從從圖4～5 可以看出，Erigeronbreviscapus與Erigeronkarvinskianu預測的RNA二級結構得到的莖環(huán)數(shù)量一樣都是4，結構也相似，而菊屬雛菊Bellis perennis ITS2二級結構莖環(huán)數(shù)為5，結構也相差較大，表現(xiàn)為種內(nèi)基本一致，屬間差異較大.

3 結果與討論

ITS2二級結構的核心區(qū)域具有高度的保守性，在研究物種的起源及高級階元的系統(tǒng)進化關系中起著很重要的作用[16].相對于DNA序列和氨基酸序列，RNA二級結構能夠提供結構差異方面的信息，對于燈盞花的分子分類具有一定的參考價值，可以作為一種研究物種分子系統(tǒng)學的重要手段.本研究發(fā)現(xiàn)，飛蓬屬種間rDNA 的ITS2核苷酸序列具有一定的差異，表現(xiàn)出遺傳距離與地理分布項一致，但是構建的rDNA 的ITS2 RNA二級結構在飛蓬屬種間基本一致，表現(xiàn)為在菊科不同屬間二級結構有差異.

本研究所克隆測序的燈盞花ITS2序列長度約為205bp，與GeneBank中的Erigeron breviscapus(GU213433)相比較沒有差異，結果正確.用Mega中Kimura 2-parameter model計算并構建遺傳距離圖，以及用N-J法構建系統(tǒng)進化樹，所分析的飛蓬屬11個種分為五支，加勒比飛蓬Erigeron karvinskianu與其他種遺傳距離較大，每個分支的物種基本與地理分布相符合，通過遺傳距離以及系統(tǒng)發(fā)育樹，可以為燈盞花的雜交育種提供一定的理論基礎.

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(責任編輯 王 琳)

Cloning of ITS2 gene and analysis of its RNA secondary structural characteristics inErigeronbreviscapus

XIONG Yong1,ZHAO Chun-yan2,YANG Qing-song1,WANG Qing-lin1

(1.Key Laboratory of Chemistry in Ethnic Medicinal Resources,State Ethnic Affairs Commission and Ministry of Education of China,Yunnan Minzu University,Kunming 650500,China; 2. Kunming Edible Fungi Institute,Kunming 650221,China)

The rDNA ITS2 region in theErigeronbreviscapuswas amplified by PCR and cloned,and its sequence was obtained. The biological software was used to analyze rDNA ITS2 sequence and modeled its RNA secondary structure and phylogenetic tree. The length of ITS sequence was 205 bp. The phylogenetic tree(N-J) showed 11Erigeronspecies clustered into 5 branches based on ITS2 gene sequences. The ITS homology ofErigeronwas consistent with that of geographic distribution. A comparison of the secondary structures of rDNA ITS2 sequences revealed that the different species inErigeronhad no diversity. The secondary structure of the ITS2 regions was quite different among these genus species. Nucleotide sequence combined with the secondary structure of rDNA ITS region may achieve some identification of the classification ofErigeronbreviscapus.

Erigeronbreviscapus; ITS2 gene cloning; Phylogenetic tree; RNA secondary structure

2014-11-24.

云南民族大學民族藥資源化學國家民委-教育部重點實驗室開放基金(MZY1116).

熊勇(1977-)，男，碩士，副教授.主要研究方向:生物化學.

Q7

A

1672-8513(2015)02-0151-05