馬 娟，楊 芬，唐玉斌，陳芳艷，王新剛

(1．江蘇科技大學環(huán)境與化學工程學院，江蘇鎮(zhèn)江 212018) (2．江蘇科技大學生物技術學院，江蘇鎮(zhèn)江 212018)

壬基酚降解菌的分離篩選及其降解條件的優(yōu)化

馬 娟1，2，楊 芬2，唐玉斌1*，陳芳艷1，王新剛1

(1．江蘇科技大學環(huán)境與化學工程學院，江蘇鎮(zhèn)江 212018) (2．江蘇科技大學生物技術學院，江蘇鎮(zhèn)江 212018)

為了有效地對壬基酚(NP)污染水環(huán)境進行生物修復，豐富高效降解NP的微生物資源，從垃圾填埋場的垃圾滲濾液中，分離得到兩株NP高效降解菌SLY7和SLY8，根據(jù)菌落的形態(tài)特征和16S rDNA序列分析，初步鑒定SLY7為施氏假單胞菌(Pseudomonas stutzeri)，SLY8為非脫羧勒克菌(Leclercia adecarboxylata)．通過搖瓶實驗考察NP的初始濃度、pH、溫度以及投菌量等因素對菌株降解NP能力的影響．結(jié)果表明:菌株SLY7的最佳降解條件為溫度30℃，pH為8.0，接種量3%(V/ V)，振蕩速率120 r/min，在此條件下，歷時3 d，對初始濃度為10 mg/L的NP的降解率可達72.83%;菌株SLY8的最佳降解條件為溫度35℃，pH為7.0，接種量5%(V/V)，振蕩速率120 r/min，在此條件下，歷時3 d，對初始濃度為5 mg/L的NP的降解率可達64.43%．

壬基酚;生物降解;降解條件優(yōu)化;施氏假單胞菌;非脫羧勒克菌;16S rDNA

壬基酚(NonylPhenol，NP)是歐盟列出的13種優(yōu)先控制的持久性有毒污染物之一［1］，主要來源于非離子表面活性劑壬基酚聚氧乙烯醚的分解或降解，具有高度的疏水性，在河流底泥中可積累400 d之久，一旦進入人體便會持久存在且不易排出［2］．NP還具有雌激素效應，可刺激或抑制免疫系統(tǒng)，改變免疫應答通路，不僅對水生動植物具有極強的毒害性，甚至會影響人的大腦發(fā)育和神經(jīng)系統(tǒng)．我國在2011年將NP加入有毒物質(zhì)限制名單，嚴格禁止NP的進出口［2］．

環(huán)境中的NP分布范圍廣，濃度較低，具有生物富集性，難以被生物降解．用物理吸附和化學光解法對其進行處理成本較高，不適合大規(guī)模應用．而生物降解法與其他處理方法相比，因其成本低、綠色環(huán)保且去除效率高，已成為去除環(huán)境介質(zhì)中NP的一種可控的、快速有效的方法［3］．迄今為止，人們分離出的NP降解菌主要有假單胞菌(Pseudomonas)、食酸菌(Acidovorax)、假絲酵母菌(Candida maltosa)、寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas)、鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas)、芽孢桿菌(Bacillus)和鞘脂菌屬(Sphingobium)等［4］．近年來，研究分離出的NP降解菌多數(shù)來自于土壤、河底沉積物以及污水處理廠的活性污泥中，且多數(shù)都集中在土壤環(huán)境的污染控制上，對水環(huán)境中NP的生物降解報道較少．本研究從垃圾填埋場的滲濾液中分離得到2株NP降解菌，并進行了菌種鑒定和降解條件優(yōu)化，以期豐富NP降解菌資源，為NP污染水環(huán)境的生物修復提供參考．

1 實驗

1.1 實驗試劑及培養(yǎng)基

1)NP－乙醇儲備液(NP濃度為0.05 g/mL):準確稱取0.5 g NP，用乙醇溶解并定容至100 mL的棕色容量瓶中，保存于4℃的冰箱備用．

2)NA培養(yǎng)基(g/L):牛肉膏10，蛋白胨20，NaCl 10，瓊脂粉18，pH為7.0～7.2，121℃高壓滅菌30 min．

3)無機鹽培養(yǎng)基(g/L):NH4Cl 2.5，KH2PO42.5，Na2HPO45，MgSO4·7H2O 0.5，F(xiàn)eSO4· 7H2O 0.05，MnC12·4H2O 0.2，CaC12·2H2O 0.05，pH為7.0～7.2，121℃高壓滅菌30 min．

4)無機鹽固體培養(yǎng)基:在3)的基礎上，添加2%(體積分數(shù))的瓊脂．

1.2 壬基酚降解菌的分離和純化

菌源取自鄭州垃圾填埋場的垃圾滲濾液．將垃圾滲濾液按10%(即100 mL的培養(yǎng)液中含10 mL的滲濾液)的接入量接種于無機鹽液體培養(yǎng)基中，以梯度壓力式馴化法進行馴化，NP的濃度梯度分別為1，5，10，20，30，50，80，100，150，200 mg/L，放入30℃，120 r/min的水浴振蕩器中培養(yǎng)，每個梯度培養(yǎng)5 d．反復接種培養(yǎng)、分離、純化，直至得到純單菌落．將得到的菌種分別接種于噴灑NP儲備液的無機鹽固體平板上，再反復分離、鏡檢、純化，直至得到可在上述平板上生長的純菌株．

1.3 菌株的鑒定

16S rDNA鑒定用上海生工細菌基因組DNA快速抽提試劑盒提取細菌的總DNA作為模板，采用細菌通用引物27f:AGAGTTTGATCCTGGCTCAG和1492r:TACCTTGTTACGACTT進行PCR擴增反應．擴增反應體系(25 μL體系):10×Buffer 2.5 μL;Mixed dNTP 2.0 μL;27f Primer 1.0 μL(10 pmol/L);1492r Primer 1.0 μL(10 pmol/L);DNA模板 1 μL(約10 ng/μL);Taq聚合酶 0.25 μL (2.5 U/μL);ddH2O 17.25 μL．PCR反應條件:預變性溫度為94℃，反應時間為5 min;變性溫度為94℃，反應時間為45 s;退火溫度為55℃，反應時間45 s;延伸溫度為72℃，反應時間為90 s;終延伸溫度為72℃，反應時間為10 min;循環(huán)次數(shù)為35次．PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，用DNA回收試劑盒回收DNA條帶，純化好的PCR產(chǎn)物先連接至pMD18－T vector，再轉(zhuǎn)化到DH10B感受態(tài)細胞，涂板培養(yǎng)后將篩選出的陽性克隆進行測序(測序工作委托上海生工生物工程技術服務有限公司完成)．采用Blast軟件將測序結(jié)果與Gen-Bank中已知菌株的16S rDNA序列進行同源性比較，選取同源性較高的序列，利用MEGA 5.0軟件和Neighbor－joining法計算序列的系統(tǒng)進化距離，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹．

1.4 壬基酚的提取與定量檢測

培養(yǎng)液中NP的提取方法參照文獻［5］．NP定量檢測采用島津高效液相色譜(LC－20A)，色譜柱為Inertsil ODS－SP C18柱．檢測條件:波長278 nm;柱溫 35℃;流動相甲醇/水為 90∶10，流速1 mL/min;進樣量10 μL，R2＞0.999．

樣品處理:將樣品經(jīng)過0.45 μm有機相濾膜過濾后，進行高效液相色譜檢測，r2＞0.999．

1.5 壬基酚降解菌降解條件優(yōu)化

每次以一個因素為變量，其他條件保持不變，考察各因素變化條件下菌株對底物降解效率的影響(各實驗組做3次重復和不加菌的空白對照)，以確定菌株的最佳降解條件．分別設4個實驗組:

1)初始底物質(zhì)量濃度對降解效率的影響:向無機鹽基礎培養(yǎng)基(pH 7.0)中加入NP儲備液，使得NP的初始質(zhì)量濃度分別為5，10，15，20，30，40，50，60，70，80，100 mg/L．按10%的投菌量接入待試菌株，在溫度30℃、轉(zhuǎn)速120 r/min的搖床中培養(yǎng);

2)pH對降解效率的影響:將無機鹽液體培養(yǎng)基的pH分別調(diào)至4，5，6，7，8，9，10，NP初始質(zhì)量濃度為10 mg/L，按比例(10%)接入待試菌株，在溫度30℃、轉(zhuǎn)速120 r/min的搖床中培養(yǎng);

3)溫度對降解效率的影響:將待試菌株按10%的投菌量分別接種于NP初始質(zhì)量濃度10 mg/L、pH為7.0的無機鹽液體培養(yǎng)基中，分別于20，25，30，35，40，45℃下進行搖床培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速為120 r/min;

4)投菌量對降解效率的影響:在NP質(zhì)量濃度為10 mg/L、pH為7.0、溫度為30℃的條件下，改變投菌量大小，分別為1%，3%，5%，10%，15%，20%．

所有的實驗組均在培養(yǎng)3 d后測定培養(yǎng)液中NP的濃度(每個樣品做3個平行試驗)．

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株的鑒定

經(jīng)富集、分離，獲得2株對NP具有顯著降解效果的菌株，這2株菌皆能以NP作為唯一碳源和能源生長繁殖，分別命名為SLY7和SLY8．圖1是菌株的菌落形態(tài)，由圖1a)可以看出，SLY7在NA培養(yǎng)基上呈黃色，菌落邊緣不規(guī)則，表面有褶皺，大而干燥，不易挑取;圖1b)顯示SLY8的菌落在NA培養(yǎng)基上呈乳黃色，形態(tài)規(guī)則，近圓形，中央略突起，表面光滑濕潤．2株菌革蘭氏染色結(jié)果都呈陰性．

圖1 菌株的菌落形態(tài)Fig．1 Colony morphology of strain

圖2是2株菌基于16S rDNA基因同源性的系統(tǒng)發(fā)育樹．由圖2可以看出，SLY7與Pseudomonas stutzeri在進化樹上處于同一分支，具有相近的進化距離，表明它與Pseudomonas stutzeri發(fā)育關系最緊密．綜合菌落的形態(tài)特征和16S rDNA序列分析結(jié)果，初步鑒定SLY7屬于施氏假單胞菌(Pseudomonas stutzeri)．假單胞菌在自然界中分布廣泛，在生物修復、生物防治、生物轉(zhuǎn)化和耐藥性等方面具有較高的理論和應用價值［6］．施氏假單胞菌隸屬于假單胞菌屬，同樣也參與了多環(huán)芳烴［7］、聯(lián)苯［8］、氟氯氰菊酯［9］、咔唑［10］等有機物污染和重金屬污染［11］環(huán)境的生物修復．

SLY8與Enterobacter sp．在進化樹上處于同一分支，具有相近的進化距離，表明它與Enterobacter sp．發(fā)育關系最緊密．綜合菌株的形態(tài)特征和16S rDNA序列分析結(jié)果，初步鑒定SLY8屬于非脫羧勒克菌(Leclercia adecarboxylata)．非脫羧勒克菌是腸桿菌科的一種，對抗菌藥物具有耐藥性，該菌還具有降解多環(huán)芳烴［12－13］的能力，并且在厭氧環(huán)境中能夠降解除草劑［14］．

圖2 菌株基于16S rDNA基因同源性的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig．2 Phylogenetic tree of strains based on the 16S rDNA gene homology

2.2 底物濃度對菌株降解壬基酚能力的影響

圖3為底物濃度對SLY7和SLY8降解效果的影響．從圖中可看出，SLY7對不同濃度NP的降解率均高于SLY8，說明SLY7對NP毒性的耐受力和代謝能力要強于SLY8．當SLY7和SLY8的初始濃度分別為10 mg/L和5 mg/L時，降解效果最佳，降解率分別為67.21%和62.66%．可見這2株菌適宜低濃度NP的生物降解．隨著濃度的升高，2株菌對NP毒性的耐受力呈直線下降趨勢，當?shù)孜餄舛冗_到50 mg/L時，SLY8對NP的降解率降到了30%以下，而SLY7對NP的降解率也只有37.56%．這可能是由于NP在水中的溶解度較低(僅有5.43 mg/L)，當NP初始濃度達到50 mg/L時，由于其疏水性造成NP呈油滴狀漂浮于液體培養(yǎng)基表面，在培養(yǎng)基中分布不均勻，導致菌體不能很好地利用碳源，從而降低了菌株對NP的降解．

圖3 初始壬基酚濃度對菌株降解效率的影響Fig．3 Effect of initial NP concentration on degradation efficiencies of strains

2.3 pH對菌株降解壬基酚能力的影響

圖4為pH對菌株降解NP的影響．

圖4 pH對菌株降解壬基酚效率的影響Fig．4 Effect of pH on NP degradation by strains

由圖4可知，pH對菌株降解NP有顯著影響．這是由于pH能影響培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)的離子化程度，從而影響營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和有毒物質(zhì)的毒性．當pH為4.0時，兩株菌對NP的降解率均低于30%．隨著pH的升高，降解率逐漸升高．當SLY7和SLY8的培養(yǎng)基初始pH分別為8.0和7.0時，菌株對NP的降解率均達到最大值，分別為70.54%和60.64%．之后，隨著pH的升高降解率逐步下降，當pH為10.0時，SLY8的降解率降至25.11%，但SLY7的降解率仍有47.51%，可見SLY7對堿性環(huán)境具有較好的耐受力．pH過高或過低時，都能使NP降解酶的活性降低甚至失活，從而影響降解途徑．因此，確定SLY7和SLY8的培養(yǎng)液最適初始pH分別為8.0和7.0．這與文獻［15］研究的NP降解菌最佳產(chǎn)酶條件相符合．

2.4 溫度對菌株降解壬基酚能力的影響

溫度對菌株降解NP能力的影響見圖5．

圖5 溫度對菌株降解效率的影響Fig．5 Effect of temperature on NP degradation by strains

從圖5可以看出，在25～40℃范圍內(nèi)，2株菌都能較好地降解液體培養(yǎng)基中的NP，降解率都達到了50%以上，可見2株菌都具有較寬的溫度適應范圍．當SLY7的培養(yǎng)溫度小于30℃，SLY8的培養(yǎng)溫度小于35℃時，2株菌對NP的降解率隨溫度的升高而升高．文獻［16］也曾報道過溫度升高有利于NP的生物降解．這可能是由于溫度的升高增加了NP在液體環(huán)境中的溶解度，利于菌體對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收．當SLY7的培養(yǎng)溫度大于30℃，SLY8的培養(yǎng)溫度大于35℃時，2株菌對NP的降解率隨溫度的升高而降低．這是由于過高的溫度抑制了NP降解酶的活性和菌體的生長，從而影響菌株對NP的降解．當SLY7和SLY8的培養(yǎng)溫度分別為30℃和35℃時，菌株對NP的降解效果最好，故確定SLY7和SLY8的最適宜培養(yǎng)溫度分別為30℃和35℃．

2.5 投菌量對菌株降解壬基酚能力的影響

投菌量對菌株降解NP能力的影響見圖6．

圖6 投菌量對菌株降解效率的影響Fig．6 Effect of inoculating dosage on NP degradation by strains

如圖6，對于SLY7，當投菌量在1%～3%時，降解率呈上升趨勢;當投菌量大于3%時，降解效率變化不大，基本維持在70%左右．因為投菌量過大時，SLY7在培養(yǎng)的過程中會聚成菌團，不利于菌體和NP接觸，限制了菌體的生長和代謝．投菌量對SLY8降解率的影響和SLY7相似，當投菌量在1%～5%時，降解率隨投菌量升高而升高，當投菌量高于5%時，其降解率變化不大，基本維持在60%左右．由于NP高度疏水性造成其在培養(yǎng)基中分布不均勻，加入的菌量過多會使菌株爭奪少量營養(yǎng)，種內(nèi)斗爭限制了菌株生長，因此過多的投菌量對NP降解率的提高效果不明顯．當SLY7和SLY8的初始投菌量分別為3%和5%時，不僅有較高的降解率，而且還可以防止菌種浪費．

3 結(jié)論

1)從垃圾填埋場的垃圾滲濾液中，分離得到2株NP高效降解菌株SLY7和SLY8，經(jīng)鑒定SLY7為施氏假單胞菌(Pseudomonas stutzeri)，SLY8為非脫羧勒克菌(Leclercia adecarboxylata)．

2)菌株SLY7的最佳降解條件為溫度30℃，pH為8.0，投菌量3%(V/V)，振蕩速率120 r/min，在此條件下，歷時3 d，對初始濃度為10 mg/L的NP的降解率可達72.83%．

3)菌株SLY8的最佳降解條件為溫度35℃，pH為7.0，投菌量5%(V/V)，振蕩速率120 r/min，在此條件下，歷時3 d，對初始濃度為5 mg/L的NP的降解率可達64.43%．

這些結(jié)果預示著施氏假單胞菌和非脫羧勒克菌在NP污染水體的生物修復方面具有應用價值．

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(責任編輯:顧 琳)

Isolation，screening of NP-degrading bacteria and the optimization of degradation conditions

Ma Juan1，2，Yang Fen2，Tang Yubin1*，Chen Fangyan1，Wang Xingang1
(1．School of Environmental and Chemical Engineering，Jiangsu University of Science and Technology，Zhenjiang Jiangsu 212018，China) (2．School of Biotechnology，Jiangsu University of Science and Technology，Zhenjiang Jiangsu 212018，China)

In order to effectively control the NP-polluted water and enrich microbial resources of NP-degrading bacteria，two bacterial strains were isolated from the landfill leachate．The two NP-degrading bacteria，designated strains SLY7 and SLY8．The morphology observation and 16S rDNA identification revealed that the two strains belonged to Pseudomonas stutzeri and Leclercia adecarboxylata，respectively．By shaking flasks tests，the effects of the conditions of degradation of NP by the strains was studied．SLY7 was determined that the optimum conditions were inoculum amount 3%，pH 8.0，and 30℃，on a shaker at 120 rpm for 3 d．Under these conditions，when the initial concentration was 10 mg/L，the degrading rate of NP reached 72.83%．SLY8 was determined that the optimum conditions were inoculum amount 5%，pH 7.0，and 35℃，on a shaker at 120 rpm．Under these conditions，the duration was 3 d，when the initial concentration was 5 mg/L，the degrading rate of NP reached 64.43%．

nonylPhenol;biodegradation;optimization of degradation conditions;Pseudomonas stutzeri;Leclercia adecarboxylata;16S rDNA

X172

:A

:1673－4807(2015)05－0501－06

10．3969/j．issn．1673－4807．2015．05．016

2015－03－21

馬娟(1989—)，女，碩士研究生．*通信作者:唐玉斌(1964—)，男，博士，教授，研究方向為環(huán)境生物技術．E-mail:ybbill@163．com

馬娟，楊芬，唐玉斌，等．壬基酚降解菌的分離篩選及其降解條件的優(yōu)化［J］．江蘇科技大學學報:自然科學版，2015，29(5): 501－506．