高陽，胡曉梅，楊寧，孫宇，梁官釗，韓晨珠，段昕所

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，河北承德067020)

siRNA沉默腎上腺髓質(zhì)素基因?qū)375黑素瘤細(xì)胞表達(dá)VEGF IL－10的影響*

高陽，胡曉梅，楊寧，孫宇，梁官釗，韓晨珠，段昕所＊＊

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，河北承德067020)

目的:研究siRNA沉默腎上腺髓質(zhì)素基因?qū)375黑素瘤細(xì)胞表達(dá)VEGF、IL－10的影響。方法:采用人黑素瘤細(xì)胞株A375，分為采用正常未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞做為空白對照，人工合成的非特異序列轉(zhuǎn)染A375細(xì)胞為陰性對照，人工合成的腎上腺髓質(zhì)素(ADM)靶向小分子干擾RNA轉(zhuǎn)染A375細(xì)胞為抑制ADM基因表達(dá)實驗組。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)方法和免疫細(xì)胞化學(xué)染色方法檢測各組細(xì)胞中VEGF、IL－10的表達(dá)水平。結(jié)果:空白對照組、陰性對照組、ADM siRNA轉(zhuǎn)染組ELISA法測定VEGF的表達(dá)量分別為192.246±17.330、187.831±14.450、96.218±10.078 pg/mL;IL－10的表達(dá)量分別為108.822±7.55、103.250±4.785、37.024±5.770pg/mL，組間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01或P＜0.05)。免疫組化法測定顯示結(jié)果同ELISA結(jié)果。結(jié)論:siRNA沉默ADM基因可下調(diào)A375黑素瘤細(xì)胞免疫抑制分子VEGF、IL－10的表達(dá)。

小分子干擾;腎上腺髓質(zhì)素;黑素瘤;血管內(nèi)皮生長因子;白細(xì)胞介素－10

腎上腺髓質(zhì)素(ADM)是在嗜鉻細(xì)胞瘤組織中發(fā)現(xiàn)的一種內(nèi)源性血管活性肽，研究發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)的腫瘤細(xì)胞能夠產(chǎn)生ADM，并且在促進(jìn)腫瘤生長的過程中發(fā)揮著腫瘤生長因子的作用。RNA干擾技術(shù)可以對基因進(jìn)行沉默，目前研究已證實siRNA(small interference RAN，siRNA)沉默腎上腺髓質(zhì)素基因能夠?qū)375黑素瘤細(xì)胞阻滯在G2/M期，抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡，降低A375黑素瘤細(xì)胞的體外侵襲能力［1，2］。腫瘤細(xì)胞分泌免疫抑制分子抑制機體免疫功能，使腫瘤細(xì)胞逃避機體的免疫監(jiān)視，是腫瘤得以發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移的重要機制。ADM基因的表達(dá)是否與免疫抑制分子介導(dǎo)的免疫逃逸有關(guān)值得進(jìn)一步研究。

1 資料與方法

1.1 材料:黑色素瘤細(xì)胞系A(chǔ)375購于北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司;小干擾RNA(siRNA)、轉(zhuǎn)染試劑riboFECT TM CP Buffer(10×)、riboFECT TM CP Reagent購于廣州市銳博生物科技有限公司;VEGF一抗(鼠抗人)、IL－10一抗(兔抗人)、ADM一抗(鼠抗人)購于美國Santa Cruz公司;二抗(抗鼠、兔)購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;DAB顯色試劑盒購于福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司;ELISA主要試劑人VEGF ELISA試劑盒、人IL－10 ELISA試劑盒購于深圳市達(dá)科為生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染:取對數(shù)生長的A375細(xì)胞，胰酶消化，以含10%FBS的1640培養(yǎng)液吹打，并制備成濃度為1×105/mL的細(xì)胞懸液，以每1000μL加入24孔板中，每組siRNA設(shè)三個復(fù)孔。待細(xì)胞融合至50%～60%，用50 nM的ADMsiRNA轉(zhuǎn)染A375細(xì)胞，siRNA序列參考李志加文獻(xiàn)［1］，將配制好的siRNA工作液以每孔1.25μL的量混勻，室溫孵育5min，每孔按照5μL riboFECT TM CP Reagent加入siRNA工作液配制成混合液，輕輕吹打混勻，室溫孵育0～15min，將混合液以每孔6.25μL加入到443.75μL細(xì)胞培養(yǎng)液中，陰性對照組轉(zhuǎn)染非特異序列，空白對照組加入500μL不含ADMsi－RNA的完全培養(yǎng)液，使每孔的終體積為500μL，置于37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，作用24h。

1.2.2 免疫細(xì)胞化學(xué)染色方法檢測各組ADM、VEGF、IL－10蛋白的表達(dá)情況:細(xì)胞爬片固定后，所有切片染色均采用相同條件，按免疫組化步驟進(jìn)行。結(jié)果判定以細(xì)胞內(nèi)(胞漿、胞核、核膜)呈現(xiàn)棕黃色著色為陽性，不著色為陰性(～)。每組選三張片，每個細(xì)胞爬片隨機選擇5個高倍視野(10×40倍)，每個視野作為一例標(biāo)本，以細(xì)胞質(zhì)和(或)細(xì)胞膜中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性，將陽性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的百分比和染色強度進(jìn)行半定量處理。每個細(xì)胞爬片選擇5個具有代表性的高倍視野(×400倍)，計算陽性率，評價方法參照Birner等［3］的方法，＜25%為1分，25%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分。染色強度染色弱但強于陰性對照者為1分，染色清晰者為2分，染色強者為3分。上述兩項評分相加，＜3分為(－)，3分為(+)，4～5分為(++)，6～7分(+++)最后計算兩種記分的和做為半定量分級。

1.2.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測各組細(xì)胞培養(yǎng)上清中VEGF、IL－10的含量。按照所購試劑盒的步驟，采取雙抗體夾心ELISA法測定上清VEGF、IL－10的含量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理:采用SPSS17.0統(tǒng)計學(xué)軟件對結(jié)果進(jìn)行處理，免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果采用卡方檢驗進(jìn)行分析;計量資料數(shù)據(jù)以±s表示，采用單因素方差分析，組間比較采用q檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫細(xì)胞化學(xué)染色方法檢測各組ADM、VEGF、IL －10蛋白的表達(dá)情況

圖1 各組細(xì)胞ADM的表達(dá)結(jié)果

圖2 各組細(xì)胞VEGF的表達(dá)結(jié)果

表1

圖3 各組細(xì)胞IL－10的表達(dá)結(jié)果

2.1.1 免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測siRNA沉默效果:在轉(zhuǎn)染不同RNA序列(ADM序列、非特異序列)及未轉(zhuǎn)染的干預(yù)作用下，各組A375黑素瘤細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)24h，經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測結(jié)果，圖1中ADM-siRNA轉(zhuǎn)染組ADM的表達(dá)量明顯低于空白對照(χ2= 40.168，P＜0.01)和陰性對照組(χ2=40.168，P＜0.01)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，而陰性對照和空白對照組ADM高表達(dá)，兩組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=30.498，P＜0.01)。圖2中A375黑素瘤細(xì)胞可見VEGF陽性表達(dá)，陽性染色主要定位于胞漿、胞膜及胞核。ADMsiRNA轉(zhuǎn)染組VEGF的陽性信號較空白對照組(χ2=41.589，P＜0.01)及陰性對照組(χ2=41.589，P＜0.01)低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，而空白對照組和陰性對照組陽性表達(dá)較高，兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=27.726，P ＜0.01)。

圖3中A375黑素瘤細(xì)胞可見IL－10陽性表達(dá)，陽性染色主要定位于胞漿、胞膜及胞核。ADMsiRNA轉(zhuǎn)染組IL－10的陽性信號較空白對照組(χ2=27.726，P＜0.01)及陰性對照組(χ2=30.498，P＜0.01)低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，而空白對照組和陰性對照組陽性表達(dá)較高，兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=19.408，P＜0.01)。

2.1.2 免疫細(xì)胞化學(xué)染色方法檢測各組ADM、VEGF、IL－10蛋白的表達(dá)分級情況，見表1。

2.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測各組細(xì)胞培養(yǎng)上清中VEGF和IL－10的含量:在轉(zhuǎn)染不同RNA序列(ADM序列、非特異序列)及未轉(zhuǎn)染的干預(yù)作用下，各組A375黑素瘤細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)24h收集培養(yǎng)上清，ELISA法檢測，結(jié)果見表2。轉(zhuǎn)染ADMsiRNA后A375黑素瘤細(xì)胞表達(dá)VEGF的量顯著低于陰性對照組和空白對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=129.935，P＜0.01);兩兩比較，陰性對照組與空白對照組差異無顯著性(P ＞0.05)，ADMsiRNA轉(zhuǎn)染組與陰性對照組和空白對照組兩組分別比較均具有顯著性差異(P＜0.01)。

表2 各組上清液中VEGF和IL－10的含量(pg/mL，±s)

表2 各組上清液中VEGF和IL－10的含量(pg/mL，±s)

分組NVEGFIL－10空白對照組9192.246±17.329108.822±7.55陰性對照組9187.831±14.450 103.250±4.785 ADMsiRNA轉(zhuǎn)染組996.218±10.07837.024±5.770

3 討論

黑素瘤的形成過程存在著免疫逃逸機制，而腫瘤細(xì)胞主要通過分泌免疫抑制分子逃避機體免疫系統(tǒng)識別和攻擊，目前已確定的免疫抑制分子有20余種，其中與黑素瘤密切相關(guān)的免疫抑制分子有血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、白細(xì)胞介素－10(IL－10)和前列腺素E2 (PGE2)等。這些細(xì)胞因子通過自分泌－旁分泌等途徑參與細(xì)胞的轉(zhuǎn)型及逃避免疫監(jiān)視，為腫瘤的發(fā)生及發(fā)展創(chuàng)造有利的微環(huán)境。新生血管的形成貫穿著腫瘤發(fā)生及發(fā)展的各個階段［4，5］，VEGF被認(rèn)為是促進(jìn)血管生成作用最強的細(xì)胞因子［6～8］，腫瘤細(xì)胞分泌的VEGF不僅能夠與血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的特異性受體結(jié)合，還能同時表達(dá)VEGF受體，這種共表達(dá)方式說明了VEGF可通過自分泌或旁分泌方式影響腫瘤的生物學(xué)行為，并且在一定程度上降低了機體免疫系統(tǒng)對腫瘤的排斥效應(yīng)。IL－10是由免疫適應(yīng)細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞、上皮細(xì)胞等非免疫細(xì)胞產(chǎn)生，能夠抑制多種效應(yīng)分子，抑制生物體的抗腫瘤免疫。本研究利用RNA干擾技術(shù)沉默ADM基因，采用的小干擾RNA(siRNA)序列是參照李志加的研究，由生物公司設(shè)計三對siRNA序列，實時熒光定量(qRT)－PCR檢測3對siRNA序列轉(zhuǎn)染A375細(xì)胞后細(xì)胞內(nèi)靶基因mRNA表達(dá)，以檢測其轉(zhuǎn)染效果，三組干擾率分別為15%、76%、50%，轉(zhuǎn)染效果最佳的第二組其siRNA序列:正向鏈為5’－GCCAGAGCAUGAAC AACUUdTdT－3，反向鏈為3’－dT-dTCGGUCUCGUACUUGUUGA A－5’，干擾靶序列為GCCAGAGCATGAACAACTT，本實驗繼續(xù)采用此siRNA序列，轉(zhuǎn)染A375黑素瘤細(xì)胞沉默ADM基因，作用24h干擾ADM基因后利用免疫細(xì)胞化學(xué)染色及ELISA方法檢測。結(jié)果說明ADM基因表達(dá)下調(diào)可抑制A375黑素瘤細(xì)胞VEGF及IL－10的表達(dá)。郭雙華［9］通過對人腎癌786－O細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)加入100nM 的ADM后VEGF及ADM蛋白mRNA表達(dá)增高，而加入阻滯劑培養(yǎng)后，VEGF的表達(dá)受到抑制，說明ADM可能通過調(diào)節(jié)VEGF的表達(dá)來參與腎癌新生血管生成、進(jìn)而促進(jìn)腫瘤發(fā)展，本實驗也證實了這種調(diào)節(jié)機制，但是否是從轉(zhuǎn)錄水平影響mRNA表達(dá)，亦或是影響信號傳導(dǎo)途徑的某一關(guān)鍵因子還有待進(jìn)一步研究。

IL－10基因啟動子區(qū)域存在著多態(tài)性，這與腫瘤的進(jìn)展密切相關(guān)，有研究發(fā)現(xiàn)，IL－10－1082AA基因型與乳腺癌的進(jìn)程相關(guān)，作用24h干擾ADM基因后利用免疫細(xì)胞化學(xué)染色及ELISA方法檢測發(fā)現(xiàn)IL－10的表達(dá)受到了抑制，說明免疫抑制分子IL－10的表達(dá)受到ADM基因的影響，前期的研究已證實siRNA沉默A375黑素瘤細(xì)胞ADM基因，抑制了細(xì)胞增殖，促進(jìn)凋亡，將細(xì)胞阻滯在G2/M期，本實驗繼續(xù)深入研究基因干擾后其對腫瘤細(xì)胞表達(dá)免疫抑制分子的影響，通過細(xì)胞化學(xué)染色及ELISA法檢測siRNA沉默A375黑素瘤細(xì)胞ADM基因是否對VEGF及IL－10的表達(dá)有影響。

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Impact of Small Interference RNA－induced Silencing of Adrenomedullin Gene on the Expression of VEGF IL－10 in Malignant Melanoma Cells

GAO Yang，HU Xiaomei，YANG Ning，et al
(The Affiliated Hospital to Chengde Medical College，Hebei Chengde067000，China)

Objective:To assess the impact of small interference RNA－induced silencing of adrenomedullin gene on the expression of VEGF，IL－10 in malignant melanoma cells.Method:A375 cells were classified into 3 groups to be transfected with the selected siRNA(test group)，non－specific sequences (negative control group)，or remain untransfected(blank control group).Immunocytochemical staining and ELISA was performed to detect the expressions of VEGF and IL－10 in each group.Result:The expression of VEGF was 192.246±17.330 pg/mL in the control group，187.831±14.450 pg/mL in the negative control group and 96.218±10.078 pg/mL in ADMsiRNA transfected group.The expression of IL－10 was 108.822±7.55 pg/mL in the control group，103.250±4.785 pg/mL in the negative control group and 37.024±5.770 pg/ mL in ADMsiRNA transfected group.The differences were statistically significant.The results of immunohistochemistry are the same of ELISA.Conclusion:siRNA silencing adrenomedullin gene can inhibit the expression of VEGF and IL－10 in A375 melanoma cell.

small interfering;Adrenomedullin;Melanoma;VEGF;IL－10

B

10.3969/j.issn.1006－6233.2015.07.013

1006－6233(2015)07－1096－04

河北省科技支撐計劃項目，(編號:09276101D－14)

＊＊通訊作者:Email:duanxinsuo2002@163.com