何 靜，張盼盼，孫敏華，康銀峰，謝 鵬，向 斌，韓 翡，譚陽通，任 濤

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院/人獸共患病防控制劑國家地方聯(lián)合工程實驗室/農(nóng)業(yè)部獸用疫苗創(chuàng)制重點實驗室/廣東省動物源性人獸共患病預(yù)防與控制重點實驗室，廣東廣州510642)

雞α干擾素/白細(xì)胞介素18基因的融合表達及抗病毒活性研究

何 靜，張盼盼，孫敏華，康銀峰，謝 鵬，向 斌，韓 翡，譚陽通，任 濤

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院/人獸共患病防控制劑國家地方聯(lián)合工程實驗室/農(nóng)業(yè)部獸用疫苗創(chuàng)制重點實驗室/廣東省動物源性人獸共患病預(yù)防與控制重點實驗室，廣東廣州510642)

何 靜，張盼盼，孫敏華，等.雞α干擾素/白細(xì)胞介素18基因的融合表達及抗病毒活性研究［J］.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2015，36(1):18-22.

【目的】構(gòu)建原核表達載體pET28a-rChIFN-α-ChIL-18、大腸埃希菌Escherichia coli表達及產(chǎn)物純化與活性檢測，研究高效廣譜雞基因工程重組復(fù)合抗病毒制劑，以對雞的病毒性疾病進行防治.【方法】采用融合PCR(Fusion PCR)方法，利用具有互補末端的引物，形成具有重疊鏈的PCR產(chǎn)物，通過PCR產(chǎn)物重疊鏈的延伸將雞α干擾素(Chicken interferon alpha，ChIFN-α)與雞白細(xì)胞介素18(Chicken interleukin-18，ChIL-18)基因構(gòu)建ChIFN-α-ChIL-18融合基因并克隆入pET-28a原核表達載體中進行原核表達.通過鎳柱親和層析法純化可溶性蛋白，并進行SDSPAGE分析、Western-blot鑒定.采用細(xì)胞病變抑制法檢測rChIFN-α-ChIL-18蛋白在細(xì)胞上抑制水泡性口炎病毒(VSV)及新城疫病毒(NDV)增殖活性.【結(jié)果和結(jié)論】成功構(gòu)建并克隆了pET28a-rChIFN-α-ChIL-18融合基因.融合基因在大腸埃希菌中表達的rChIFN-α-ChIL-18蛋白相對分子質(zhì)量約為38 000，蛋白經(jīng)純化后純度在90%以上.rChIFN-α-ChIL-18蛋白在雞胚成纖維(CEF)細(xì)胞上具有明顯抗病毒活性，其抗VSV和NDV的活性明顯高于單一rChIFN-α、rChIL-18蛋白的抗病毒活性.

雞α干擾素;雞白細(xì)胞介素18;融合PCR;抗病毒活性

α干擾素(IFN-α)具有廣譜抗病毒活性［1］，其主要作用是抑制病毒繁殖、抗腫瘤活性、加強NK細(xì)胞殺傷病毒感染細(xì)胞的能力從而抑制病毒的增殖和擴散、增強機體細(xì)胞免疫應(yīng)答水平等［2］.白細(xì)胞介素18 (IL-18)是20世紀(jì)80年代發(fā)現(xiàn)的一類細(xì)胞因子，由單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)的細(xì)胞分泌，在細(xì)胞的活化、增殖和分化中起調(diào)節(jié)作用.ChIL-18除了能明顯誘導(dǎo)IFN-γ基因表達外，還可誘導(dǎo)諸如 IL-2、TNF-α及 GMCSF等多種細(xì)胞因子的產(chǎn)生，同時，IL-18也可增強CTL細(xì)胞和NK細(xì)胞的活性，上調(diào)細(xì)胞毒活性作用，促進T細(xì)胞增殖，在細(xì)胞免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用［3］.近年來有關(guān)IL-18的研究非常活躍，其應(yīng)用領(lǐng)域包括抗腫瘤、抗感染及作為免疫調(diào)節(jié)劑治療一些免疫性疾病，具有重要的臨床應(yīng)用價值.

本研究采用融合PCR(Fusion PCR)方法，將雞ChIFN-α與Ch IL-18基因構(gòu)建成Ch IFN-α-Ch IL-18融合基因并克隆入pET-28a原核表達載體中進行表達，該蛋白具有很好的免疫原性和很強的抗水泡性口炎病毒(VSV)和新城疫病毒(NDV)活性.這項研究可有效地降低研制成本，易于生產(chǎn)，且具有疊加的ChIFN-α和ChIL-18抗病毒功能，為生產(chǎn)高活性及高效基因工程重組復(fù)合抗病毒制劑奠定了基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌(毒)株與質(zhì)粒 大腸埃希菌Escherichia coli BL21、DH5α菌株由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院動物傳染病實驗室保存;VSV由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院惠贈; NDV及質(zhì)粒載體pET-28a均由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院動物傳染病實驗室保存.

1.1.2 試劑 PCR擴增用試劑、內(nèi)切酶、T4連接酶、dNTP均為大連(寶)生物(TaKaRa)工程有限公司產(chǎn)品;DNA回收試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA純化試劑盒等試劑均為Omega公司產(chǎn)品;TRIzol試劑為Invitrogen公司產(chǎn)品;淋巴細(xì)胞分離液為杭州灝洋生物工程公司產(chǎn)品;DM EM培養(yǎng)基和小牛血清均為Hyclone公司產(chǎn)品.

1.1.3 主要儀器設(shè)備 PTC-200型PCR儀為美國MJReSearch公司產(chǎn)品;凝膠成像分析系統(tǒng)為英國Gyndene公司產(chǎn)品;Galaxy 300 L CO2培養(yǎng)箱為英國Rsbiotech公司產(chǎn)品;分光光度計(ND-1000)為Nano-Drop公司產(chǎn)品;恒溫CO2培養(yǎng)箱為英國Rsbiotech公司產(chǎn)品;超聲波裂解儀為美國Scientz公司產(chǎn)品.

1.2 方法

1.2.1 引物的設(shè)計與合成 參照GenBank登錄的ChIFN-α基因序列(DQ226092)、ChIL-18基因序列(AJ277865)及pET-28a(+)多克隆位點，用Oligo 7 (Molecular Biology Insights Inc.，Cascade，CO)輔助設(shè)計2對具有互補末端的引物，分別為P1/P2、P3/ P4引物對，引物均由英濰捷基(廣州)貿(mào)易有限公司(Life technologies)合成.本試驗所用引物見表1.

表1 試驗所用引物1)Tab.1 PCR primers used in this study

1.2.2 Ch IFN-α-ChIL-18融合基因的構(gòu)建 參照李敏等［4］報道的方法進行ChIFN-α-ChIL-18融合基因的構(gòu)建.首先采用 P1/P2引物對，以 rpMD19-T/ ChIFN-α質(zhì)粒為模板對ChIFN-α基因片段進行擴增后，采用P3/P4引物對，以rpMD19-T/ChIL-18質(zhì)粒為模板擴增ChIL-18基因片段.使用低熔點瓊脂糖凝膠回收試劑盒分別回收ChIFN-α、ChIL-18基因片段，將上述2個回收產(chǎn)物混合，取0.5μg混合物用于ChIFN-α與ChIFN-γ基因的融合反應(yīng).采用P2/P3引物對，依據(jù)上述融合反應(yīng)片段為模板進行ChIFN-α與ChIL-18融合片段的PCR擴增.回收約996 bp的PCR產(chǎn)物.

1.2.3 ChIFN-α-ChIL-18融合基因的克隆、測序與表達 將“1.2.2”回收的996 bp左右的PCR產(chǎn)物定向克隆至 pMD19-T載體，后篩選陽性克隆質(zhì)粒(pMD19-T/ChIFN-α-ChIL-18)送英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司測序，陽性克隆質(zhì)粒經(jīng)Eco RⅠ和Hin dⅢ雙酶切后連接到經(jīng)相同酶雙切后的表達載體pET-28a(+)，將構(gòu)建好的重組pET-28a/ChIFN-α-ChIL-18表達質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入宿主菌E.coli BL21中，篩選陽性重組菌送英濰捷基(廣州)貿(mào)易有限公司(Life technologies)測序.選取核苷酸序列和插入方向都正確的重組菌、pET-28a/ChIFN-α-ChIL-18空載體菌對照、BL21空菌對照進行IPTG誘導(dǎo)表達，采用SDSPAGE分析表達蛋白.

1.2.4 重組ChIFN-α-ChIL-18融合蛋白的誘導(dǎo)表達及 Western-blot分析 將測序正確的 pET-28a/ ChIFN-α-ChIL-18于10 mL含Kna+的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、150 r/min擴大培養(yǎng)12 h.取培養(yǎng)物5 mL接種于500 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)至D600nm達到0.6～0.8時，加入IPTG至終濃度為0.5 mmol/L，16℃誘導(dǎo)表達10 h，同時，設(shè)立37℃誘導(dǎo)表達(IPTG至終濃度為1.0 mmol/L)的對照組、未誘導(dǎo)的菌液和pET-28a/BL21空載體菌作為陰性對照.制備12%分離膠和5%濃縮膠，利用SDSPAGE電泳檢查目的蛋白表達情況.將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜(NC)，將His標(biāo)簽抗體(1∶2 000)作為一抗，然后用辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠(1∶10 000)作二抗，進行Western-blot反應(yīng).

1.2.5 重組ChIFN-α-ChIL-18融合蛋白的純化 通過試驗證明pET-28a/ChIFN-α-ChIL-18原核表達載體表達的融合蛋白于上清液中以可溶性形式存在，按GE公司Ni-NTA純化系統(tǒng)說明書的Native purifycation方法純化融合蛋白.

用紫外分光光度計分別測定D260nm和D280nm，根據(jù)下式計算蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度［ρ(蛋白質(zhì))］［5］: ρ(蛋白質(zhì))=(1.45×D280nm-0.74×D260nm).

1.2.6 rChIFN-α-ChIL-18蛋白抗病毒活性檢測 采用微量細(xì)胞病變抑制法在雞胚成纖維(CEF)細(xì)胞上測定rChIFN-α-ChIL-18蛋白的抗VSV及NDV活性.同時設(shè)rChIFN-α、rChIL-18蛋白對照.CEF細(xì)胞在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)至單層后，將純化的ChIFN-α-ChIL-18、rChIFN-α、rChIL-18用維持液(DMEM+體積分?jǐn)?shù)為2%的FCS)進行4倍倍比稀釋，每個稀釋度重復(fù)8孔，于37℃，體積分?jǐn)?shù)為5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后，棄上清液，用PBS洗滌后，分別加入100μL 100TCID50 VSV和100μL 100TCID50NDV的病毒稀釋液，同時設(shè)置只用病毒攻毒對照組和正常細(xì)胞對照組，繼續(xù)培養(yǎng)48～72 h后觀察細(xì)胞病變情況，待陽性對照細(xì)胞出現(xiàn)明顯細(xì)胞病變時判定結(jié)果，能抑制50%細(xì)胞病變的細(xì)胞因子的最高稀釋度的倒數(shù)作為其抗VSV、NDV活性單位.采用Reed-Muench法［6］計算 rChIFN-α-ChIL-18蛋白抗VSV及NDV活性，同時與rChIFN-α、rChIL-18蛋白進行比較.

2 結(jié)果與分析

2.1 Ch IFN-α-Ch IL-18融合基因的構(gòu)建

以重組質(zhì)粒 pMD19-T/ChIFN-α和 pMD19-T/ ChIL-18為模板PCR擴增IFN-α和IL-18片段，得到ChIFN-α和ChIL-18 PCR擴增產(chǎn)物，大小分別為489和510 bp;采用P2/P3引物對擴增到了大小為996 bp左右的ChIFN-α-ChIL-18融合基因，這些擴增產(chǎn)物大小均與預(yù)期的相一致(圖1).說明采用融合PCR方法成功構(gòu)建了ChIFN-α-ChIL-18融合基因.

圖1 融合PCR擴增ChIFN-α-ChIL-18融合基因Fig.1 Fusion PCR amplification of ChIFN-α-ChIL-18 fusion gene

2.2 Ch IFN-α-Ch IL-18基因表達載體的構(gòu)建

ChIFN-α-ChIL-18融合基因成功克隆入pMD19-T載體，測序結(jié)果表明，融合基因序列全長為996 bp，對比原模板質(zhì)粒中的ChIFN-α和ChIL-18核苷酸序列沒有發(fā)生變異.對陽性rpET-28a/ChIFN-α-ChIL-18質(zhì)粒測序表明，插入 pET-28a載體中的 ChIFN-α-ChIL-18融合基因長度為 996 bp，與 pMD19-T/ ChIFN-α-ChIL-18克隆質(zhì)粒中的相應(yīng)基因序列完全一致.以上結(jié)果表明成功構(gòu)建了pET-28a/ChIFN-α-ChIL-18表達質(zhì)粒.

2.3 rCh IFN-α-Ch IL-18蛋白的表達及鑒定

重組菌BL21(pET-28a/ChIFN-α-ChIL-18)經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，經(jīng)SDS-PAGE和Western-blot分析，結(jié)果表明，表達的重組蛋白相對分子質(zhì)量為38 000左右，與預(yù)期大小相一致;且該融合蛋白具有可溶性，由SDS-PAGE電泳結(jié)果可知，16℃比37℃更利于蛋白在上清液中的表達.對照BL21空菌和含pET-28a空載體的BL21菌在相應(yīng)位置均無條帶(圖2).

圖2 pET28a-ChIFN-α-ChIL18/BL21 SDS-PAGE和Westernblot分析Fig.2 SDS-PAGE and Western-blot analyses of pET28a-ChIFN-α-ChIL18

2.4 重組Ch IFN-α-Ch IL-18融合蛋白的純化

將誘導(dǎo)后的菌體超聲裂解，純化后經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測，結(jié)果顯示目的蛋白由Native-100的咪唑洗滌液洗脫下來，用凝膠掃描分析，蛋白純度高達90%以上(圖3).經(jīng)紫外分光光度計測定融合蛋白ChIFNα-IL18質(zhì)量濃度為0.350 mg/mL.

圖3 rChIFN-α-ChIL18蛋白純化結(jié)果Fig.3 SDS-PAGE analyses of the purified protein rChIFN-α-ChIL18

2.5 rCh IFN-α-Ch IL-18蛋白抗病毒活性檢測

2.5.1 rChIFN-α-ChIL-18蛋白抗VSV活性 將抑制50%細(xì)胞病變的干擾素稀釋度的倒數(shù)作為干擾素抗VSV活性單位.計算得rChIFN-α-ChIL-18、rChIFN-α以及rChIL-18的活性分別約為4.67×106、2.58× 105、5.9×103IU/mg.試驗結(jié)果表明，分別經(jīng)rChIFN-α-ChIL-18、rChIFN-α及 rChIL-18蛋白作用后感染VSV的正常CEF細(xì)胞，正常的CEF細(xì)胞均無細(xì)胞病變，而病毒對照組感染VSV的CEF細(xì)胞基本死亡(圖4).說明rChIFNα-IL18和rChIFN-α、rChIL-18均有明顯的抗病毒活性，且融合蛋白的抗病毒效果要高于單一蛋白.

圖4 rChIFN-α-ChIL-18蛋白對VSV的抑制作用Fig.4 rChIFN-α-ChIL-18 antiviral activities against VSV

2.5.2 rChIFN-α-ChIL-18蛋白抗NDV活性 將可以抑制50%細(xì)胞病變的干擾素的稀釋濃度的倒數(shù)作為干擾素抗NDV活性單位.計算得rChIFN-α-ChIL-18、rChIFN-α及rChIL-18抗NDV的活性分別約為3.17×106、2.0×103、1.19×103IU/mg.試驗結(jié)果表明，分別經(jīng) rChIFN-α-ChIL-18、rChIFN-α及 rChIL-18蛋白作用后感染NDV的正常CEF細(xì)胞，正常的CEF細(xì)胞均無細(xì)胞病變，而病毒對照組感染VSV的 CEF細(xì)胞基本死亡(圖5).說明rCh IFNα-IL18和rChIFN-α、rChIL-18均有明顯的抗病毒活性，且融合蛋白的抗病毒效果要高于單一蛋白.

圖5 rChIFN-α-ChIL-18蛋白對NDV的抑制作用Fig.5 rChIFN-α-ChIL-18 antiviral activities against NDV

3 討論

目前禽類病毒性傳染病依然嚴(yán)重威脅著養(yǎng)禽業(yè)，但是仍然沒有有效的藥物可以預(yù)防，人們的防控依然主要依靠疫苗免疫.由于疫苗的單一血清型而導(dǎo)致無法有效地對快速變異的病毒進行防控，而大量藥物的使用，引起一系列的藥物殘留和抗藥性的問題.因此研發(fā)廣譜、高效、安全、無毒副作用的抗病毒藥物對促進養(yǎng)雞業(yè)健康發(fā)展具有重要意義.干擾素因具有廣譜的抗病毒活性，一方面可以促進機體加強對病毒的抵抗，另一方面也能促進疫苗的免疫效果.因此重組干擾素的研究和應(yīng)用將成為病毒性疾病防治的重要方向.

rIFN-α具有廣譜的抗病毒活性，基因工程rIFN-α作為抗病毒制劑對多種病毒性疾病的療效已明確［7］.rChIFN-α蛋白對NDV［8］、禽流感H9N2型病毒及馬立克氏病毒［9-11］均具有抑制作用，rChIL-18蛋白可調(diào)節(jié)機體免疫功能，明顯誘導(dǎo)IFN-γ基因表達，增強疫苗的免疫效果.本研究通過融合PCR方法成功將ChIFN-α、ChIL-18基因融合成ChIFN-α-ChIL-18融合基因并進行了融合表達，經(jīng)對比rChIFN-α-ChIL-18融合蛋白進行生物學(xué)活性測定結(jié)果表明，rChIFN-α-ChIL-18蛋白在 CEF細(xì)胞上具有明顯優(yōu)于單一rChIFN-α和rCh IL-18的生物學(xué)活性，說明rCh IFN-α-ChIL-18具有單一rChIFN-α蛋白和rChIL-18蛋白的雙重生物學(xué)活性，調(diào)動了機體強大的免疫功能，發(fā)揮抗病毒效果，這與閆若潛等［7］的相關(guān)報道一致.

本研究采用的融合PCR方法，與傳統(tǒng)利用酶切位點將各個片段逐個連接到載體上的方法相比，此技術(shù)在不需要內(nèi)切酶消化和連接酶處理的條件下實現(xiàn)DNA片段的體外連接，大大縮短了反應(yīng)時間，降低了操作難度.

重組蛋白絕大部分以可溶的形式存在于上清液中.正常的誘導(dǎo)表達中，蛋白主要以包涵體的形式存在，由于包涵體純化難度高、純化產(chǎn)物不易保存，本試驗經(jīng)過多次探索，發(fā)現(xiàn)在16℃低溫誘導(dǎo)條件下，上清液中可檢測到可溶性蛋白表達.

本研究證明，rChIFN-α-Ch IL-18蛋白對NDV和VSV具有有效的抑制效應(yīng)，本試驗為臨床上新城疫的防治提供了新的思路和方法，對病毒性疫病的防控具有重要意義［10］.同時為下一步將rChIFN-α-ChIL-18蛋白用于雞體內(nèi)抗病毒感染研究奠定了基礎(chǔ).

［1］ MEAGER A，LEUNG H，WOOLLEY J，et al.Assays for tumour necrosis factor and related cytokines［J］.J Immunol Methods，1989，116(1):1-17.

［2］ JOHNSON H M，BAZE FW，SZENTE B E.How interferons fight disease［J］.Sci Am，1994，270(5):68-75.

［3］ 王憲文，劉興友，王巖.雞白細(xì)胞介素18研究進展［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36(16):6776-6777.

［4］ 李敏，楊謙.一種高效構(gòu)建同源重組DNA片段的方法—融合PCR［J］.中國生物工程雜志，2007，27(8): 53-58.

［5］ 韋琴，彭貴青，金梅林，等.雞α干擾素基因的克隆、原核表達及抗病毒效果研究［J］.生物工程學(xué)報，2006，22 (5):737-743.

［6］ SAGANUWAN SA.Amodified arithmeticalmethod of reed and muench for determination of a relatively idealmedian dose(LD50)［J］.Afr JPharm Pharmacol，2011，5(12): 1543-1546.

［7］ 閆若潛，謝彩華，吳志明.雞α干擾素/白細(xì)胞介素2基因的融合表達及活性研究［J］.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，43 (3):594-604.

［8］ YEH H Y，WINSLOW B J，JUNKER D E，et al.In vitro effects of recombinant chicken interferon-gamma on immune cells［J］.J Interf Cytok Res，1999，19(6):687-691.

［9］ MEAGER A.Biological assays for interferons［J］.J Immunol Methods，2002，261(1/2):21-36.

［10］VOLPINI L M，CALNEK B W.Interferon modulation of marek＇s disease virus genome expression chicken cell lines［J］.Avian Dis，1996，40(1):78-87.

［11］XING Z，SCHATK A.Inhibitory effects ofnitric oxide and gamma interferon on in vitro and in vivo replication of Marek＇s disease virus［J］.J Virol，2000，74(8):3605-3612.

【責(zé)任編輯 柴 焰】

Expressions and antiviral bioactivities of chicken interferon α/chicken interleukin-18 fusion protein

HE Jing，ZHANG Panpan，SUN Minhua，KANG Yinfeng，XIE Peng，XIANG Bin，HAN Fei，TAN Yangtong，REN Tao
(College of Veterinary Medicine，South China Agricultural University/National and Regional Joint Engineering Laboratory for Medicament of Zoonosis Prevention and Control/Key Laboratory of Animal Vaccine Development，Ministry of Agriculture/Key Laboratory of Zoonosis Prevention and Control of Guangdong Province，Guangzhou 510642，China)

【Objective】This study was conducted to explore a highly efficient chicken gene engineering antiviral agent to prevent and control the chicken viral disease.A recombinant plasmid pET28a-rChIFNα-IL18 was constructed，which was expressed in Escherichia coli，purified by Ni-NTA and tested for antiviral bioactivitiy.【Method】This study introduced a novelmethod for constructing vectors by fusion PCR，which generated PCR productswith overlapping chain using Primers complementary to the end.Through the extension of PCR products，ChIFN-αand ChIL-18 constituted the ChIFN-α-ChIL-18 fusion gene when cloned into the vector pET-28a，induced the expression in E.coli strain BL21(DE3).This protein was purified by Ni-NTA and detected by SDS-P AGE and Western-blot.Cytopathic effects(CPE)were applied to examine the potency of recombination rChIFN-α-ChIL-18 against vesicular stomatitis virus (VSV)and newcastle disease virus(NDV)proliferation.【Result and conclusion】The fusion gene of ChIFN-α-ChIL-18 was successfully constructed and cloned into pET-28a vector.The rChIFN-α-ChIL-18 protein was expressed in E.coli and successfully purified with a molecular mass of about 38 000 and more than 90%on SDS-PAGE，which indicated that the correct rChIFN-α-ChIL-18 fusion protein had been obtained.The antiviral activity units of rChIFN-α-ChIL-18 protein inhibiting the reproduction of VSV and NDV on chicken embryo fibroblast(CEF)cellsweremuch higher than those of the recombinant rChIFN-α，rChIL-18 protein.

chicken interferon alpha;chicken interleukin-18;fusion PCR;antiviral activity

S852.65

A

1001-411X(2015)01-0018-05

2014-02-24 優(yōu)先出版時間:2014-12-02

優(yōu)先出版網(wǎng)址:http://www.cnki.net/kcms/doi/10.7671/j.issn.1001-411X.2015.01.004.html

何 靜(1988—)，女，碩士研究生，E-mail:amilyjingjing@163.com;通信作者:任 濤(1968—)，男，教授，博士，E-mail:rentao@scau.edu.cn

廣東省戰(zhàn)略性新興產(chǎn)業(yè)核心技術(shù)攻關(guān)(2012A020800006)