陳 峰，曹博智，楊光參

(溫州大學物理與電子信息工程學院，浙江溫州 325035)

三羥甲基氨基甲烷綠色合成金納米粒子

陳 峰，曹博智，楊光參?

(溫州大學物理與電子信息工程學院，浙江溫州 325035)

首次利用三羥甲基氨基甲烷（Tris）作為還原劑，在堿性條件下還原氯金酸溶液；通過調(diào)節(jié)Tris和NaOH的配比、反應時間和添加穩(wěn)定劑，控制合成穩(wěn)定的金納米粒子，粒子尺寸在15 – 47 nm之間．

三羥甲基氨基甲烷；合成；金納米粒子

在眾多的金屬納米材料中金納米粒子具有良好的生物相容性、分子識別功能，一直被視為是生物大分子（核酸分子-DNA）超靈敏檢測[1]、生物傳感[2-3]及核酸分子或藥物分子在細胞內(nèi)定向輸運[4]的最佳載體．在眾多的制備方法中最為經(jīng)典的方法是Turkevitch-Frens的檸檬酸鈉還原法[5]、Brust-Schiffrin相轉(zhuǎn)移法[6]以及種子生長法（Seed-growth method）[7]，這幾種方法是最容易做到在金納米粒子表面上修飾生物分子的，然而這些方法的合成或修飾過程中存在一定的毒性[8]．為了減少金納米粒子在實驗中對生物機體的毒性，實現(xiàn)環(huán)境友好型和生物相容型的金納米粒子合成，并能夠在生物醫(yī)學領域有更好的應用，近十多年來研究者們不斷研發(fā)生物相容的“綠色”還原方法．所謂綠色合成方法是直接利用生物分子或生物相容分子作為還原劑和穩(wěn)定劑制備金納米粒子，它們的制備過程與檸檬酸鈉還原方法類似，可以還原AuⅢ成Au0并保持金納米粒子在溶液中的穩(wěn)定性．目前，已有的“綠色”還原劑有脂質(zhì)體[9]、自然植物的提純物[10]、殼聚糖[11]等．

為了在“綠色”還原的基礎上，使反應條件更加溫和，實驗操作簡單易行，我們首次利用三羥甲基氨基甲烷還原氯金酸制備金納米粒子．三羥甲基氨基甲烷（Tris (Hydroxymethyl) Aminomethane，簡稱Tris)，又名氨基丁三醇，是一種有機化合物，其分子式為(HOCH2)3CNH2，是最常見的生物化學和分子生物學實驗中的緩沖液成分和滴定標準物，可有效地治療急性肺損傷患者酸中毒[12]，誘導磷脂雙層膜形成波紋結構的單層膜[13]．由于它含有三個同等地位的羥基，具有一定的還原性，且活性較強，因此實驗在較為溫和的條件即可完成，實現(xiàn)了綠色還原．通過調(diào)節(jié)Tris的量、反應時間或添加穩(wěn)定劑可得到不同尺寸穩(wěn)定的金納米粒子膠體溶液．

1 實驗設計

1.1 實驗儀器及藥品

1.1.1 實驗儀器

超聲波清洗機（寧波新芝生物科技有限公司，SB-5200-DTD）、錐形瓶、UV-2450紫外-可見光譜儀（日本島津公司，分辨率0.1 nm）、場發(fā)射高分辨電子顯微鏡JEM-2100F（TEM，日本電子，加速電壓為200 kv）．

1.1.2 試驗藥品

超純水（Milli-Q system，18.2 M?）、氯金酸（北京國藥，分析純）、氫氧化鈉（上海國藥，分析純）、三羥甲基氨基甲烷、檸檬酸三鈉（SCRC，北京）．

1.2 實驗過程

1.2.1 藥品配制

取0.5 ml濃度為1%的氯金酸溶液加到錐形瓶中，同時加入49.5 ml超純水將其濃度稀釋至0.01%，配制質(zhì)量分數(shù)為1%的氫氧化鈉和檸檬酸三鈉（citrate）溶液以及濃度為10 mM的Tris溶液（PH=7.5）待用．

1.2.2 金納米粒子合成

利用Frens方法[14]制備金納米粒子作為參照．

將盛有50 ml質(zhì)量分數(shù)為0.01%的HAuCl4溶液的錐形瓶放入超聲機中，設定溫度為50℃，超聲加熱15分鐘，此時實際溫度為43℃，取1 ml Tris與2 ml NaOH的混合液加入氯金酸溶液中．由于將超聲機加蓋，30分鐘后溶液實際溫度達到了53℃，加入200 μl檸檬酸鈉溶液作為穩(wěn)定劑，繼續(xù)超聲30分鐘，溶液顏色逐漸加深，最終呈現(xiàn)酒紅色，實驗完成．

為了找到最佳的反應條件，反復進行多組實驗，對不同時間段的溫度實時監(jiān)測，研究不同還原劑比率、不同時間、有無穩(wěn)定劑條件下的反應情況．

（1）將還原劑的量擴大一倍，向超聲加熱15分鐘（實際溫度達到28℃）的50 ml氯金酸溶液中加入2 ml NaOH和2 ml Tris的混合液，溶液顏色慢慢變紅，超聲20分鐘后，溫度達到48℃，再加入200 μl的檸檬酸鈉溶液，繼續(xù)超聲10分鐘停止實驗．

（2）為了保持相同的反應時間，利用（1）中，同樣比率的反應溶液，先將反應溶液超聲反應30分鐘，實際溫度達到44℃，再加入200 μl的檸檬酸鈉溶液超聲30分鐘，溶液顏色較（1）中更鮮亮．

（3）不添加檸檬酸鈉作為穩(wěn)定劑，在氯金酸溶液超聲加熱15分鐘后， 直接加入4 ml體積比1∶1的Tris-NaOH混合液加入HAuCl4溶液中，觀察液體顏色變化，2分鐘內(nèi)液體變?yōu)榈仙?，持續(xù)振蕩，溶液顏色逐漸加深，由粉紅色漸漸變?yōu)榧t色，超聲60分鐘后停止實驗．

（4）將盛有50 ml質(zhì)量分數(shù)為0.01%的HAuCl4溶液的錐形瓶放入超聲機中，設定溫度為50℃，超聲加熱15分鐘后實際溫度為43℃，加入1∶1的NaOH和Tris的混合液2 ml，超聲加熱30分鐘，溶液溫度達到47℃，但顏色幾乎沒有變化，再加入1 ml的NaOH溶液顏色迅速變紅，超聲15分鐘，溶液溫度逐漸達到50℃，15分鐘后停止實驗．將制備好的溶液分裝、離心（轉(zhuǎn)速12 000 r/min下離心30分鐘，移去上清液，加入等量的超純水稀釋）備用．

為了便于討論，將上述6種方法制備的溶液分別進行編號：樣本1，樣本2，……，樣本6．

2 結果與討論

2.1 樣品溶液的紫外光譜研究

利用UV-2450紫外-可見光譜儀，測量6種樣品溶液的紫外吸收光譜，掃描范圍為300 – 800 nm，不同溶液樣本的紫外吸收峰及吸收強度曲線見圖1．由圖1可知，它們的吸收峰分布在518 – 540 nm之間，屬于金納米粒子的等離子體吸收范圍[5]，表明了金納米粒子的生成．其中，檸檬酸鈉還原制備的金納米粒子的吸收峰在519 nm，而其他樣品的吸收峰值均大于519 nm，這是因為隨著金納米粒子的粒徑增大，紫外吸收峰會發(fā)生紅移[15]．紫外吸收強度的高低，表現(xiàn)為樣品溶液顏色的深淺，顏色越鮮亮，則吸收強度越大．

圖1 不同樣本金納米粒子的紫外吸收光譜

2.2 金納米粒子的形貌表征

樣品溶液的顏色能夠初步反映金納米粒子的形貌特征．金納米粒子溶液樣本均為紅色，可推斷這些金納米粒子的形狀大致為球形．將樣品溶液滴加在銅網(wǎng)上干燥，利用JEM-2100F場發(fā)射高分辨電子顯微鏡（TEM）對每種金納米粒子進行形貌（圖2）和粒徑分布統(tǒng)計（圖3）．由透射電鏡圖片可知，金納米粒子為球形或類球形，并具有良好的分散性，平均粒徑在15 – 47 nm之間．

圖2 檸檬酸鈉及Tris方法合成的金納米粒子的TEM圖像

2.3 NaOH對金納米粒子合成的影響

Tris是一種胺類有機物，在水溶液中由于電子效應、溶劑化效應等，呈現(xiàn)出弱堿性，但不會吸收空氣中的二氧化碳，具有較高的穩(wěn)定性，自身堿性受溫度影響較大[16]．實驗過程中我們發(fā)現(xiàn)，Tris只有在強堿條件下才能顯現(xiàn)出其還原性，而少量的NaOH不能促進反應發(fā)生．必須在反應過程中需要加入足量的NaOH溶液作為輔助因子，而且NaOH的加入順序?qū)嶒灲Y果也會產(chǎn)生很大的影響，NaOH只有在與Tris混合或在Tris之后加入到氯金酸溶液中，才能完成實驗；若先將NaOH加入氯金酸溶液中，則反應無法進行．

圖3 檸檬酸鈉及Tris方法合成的金納米粒子相應的粒徑分布圖

2.4 穩(wěn)定劑對金納米粒子的影響

實驗發(fā)現(xiàn)，Tris-NaOH混合液還原氯金酸，無論是否存在穩(wěn)定劑均能得到穩(wěn)定的金納米粒子溶液．表明Tris在反應過程中自身也可作為穩(wěn)定劑．表1為不同反應條件下，金納米粒子的平均粒徑．比較在相同反應條件下，穩(wěn)定劑對金納米粒子的影響．樣本2是加入穩(wěn)定劑情況下，金納米粒子平均粒徑為46.11 nm，樣本6是不加入穩(wěn)定劑的情況下，平均粒徑為44.31 nm．表明穩(wěn)定劑的有無，對制備金納米粒子尺寸影響較?。顒e在于加入少量檸檬酸鈉后，檸檬酸根包覆在金粒子表面使其粒徑稍微變大，所以反應中檸檬酸鈉作用可忽略．

表1 不同反應條件下, 金納米粒子的平均粒徑

2.5 反應時間和溫度對金納米粒子合成的影響

從表1可以看出，反應時間對合成金納米粒子的尺寸有較大的影響．反應時間越長，形成的顆粒也就越大．溫和條件下，反應過程相對緩慢．加入足量還原劑后，Au3+逐漸被還原成Au0，金原子積聚成核．較短時間內(nèi)，小核的金納米粒子被周圍的Tris分子包圍，穩(wěn)定的分散于溶液中（21.35 nm）；當反應時間較長時，會有更多的Au0被還原出來，形成的更大的納米顆粒（30.23 nm）．

溫度也是實驗成功的關鍵因素．實驗研究發(fā)現(xiàn)，Tris在室溫下不能自發(fā)的還原氯金酸形成Au0，所以在加入還原劑之前，必須預先對氯金酸溶液進行熱處理，使其溫度達到28℃以上．因此在反應前，需要先對氯金酸溶液超聲加熱15分鐘．

2.6 Tris還原法形貌可控展望

圖2中樣本4中的金納米粒子在反應中局部出現(xiàn)聚集情況，將圖片放大，見圖4．可以看到：聚集的金納米粒子僅表現(xiàn)為單層、雙層，甚至是三層的疊加，而不會團聚成一個整體，這說明Tris還原的金納米粒子能夠保持較好的分散性．同時發(fā)現(xiàn)，在眾多的球形粒子中，存在個別其他形貌的粒子（三角形、正方形、長方形）．所以可以通過調(diào)整實驗方案，來實現(xiàn)金納米粒子的形貌控制．

圖4 樣本4中金納米粒子的TEM放大圖像

3 結 論

Tris超聲法還原氯金酸，實驗操作安全簡便、反應條件溫和，不會對環(huán)境造成污染和破壞，是一種“綠色”還原方法．利用三羥甲基氨基甲烷（Tris）作為還原劑，在堿性條件下還原氯金酸溶液；通過調(diào)節(jié)Tris和NaOH的配比、反應時間和添加穩(wěn)定劑，控制合成穩(wěn)定的金納米粒子．

實驗發(fā)現(xiàn)：

（1）Tris只有在NaOH的促進下才能進行還原反應，而且與NaoH加入的順序有很大關系，只有與Tris混合或在Tris之后加入到反應溶液中，才能完成實驗．

（2）Tris自身可作穩(wěn)定劑，不需要再加入其他穩(wěn)定試劑．

（3）反應時間對金納米粒子的尺寸會有一定的影響，反應時間越長，形成的顆粒也就越大．溫度是實驗成功的關鍵因素，Tris在室溫下不能自發(fā)的還原氯金酸形成Au0．

（4）反應中，2 ml Tris+2 ml NaOH混合液，能夠還原制得較穩(wěn)定且分散的金納米粒子．通過調(diào)節(jié)實驗條件，可實現(xiàn)控制合成多種尺寸的單分散球形金納米粒子．

[1] Zanoli L M, Spoto G. Functionalized gold nanoparticles for ultrasensitive DNA detection [J]. Analytical and bioanalytical chemistry, 2012, 402(5): 1759-1771.

[2] Mirkin C A, Letsinger R L, Mucic R C, et al. A DNA-based method for rationally assembling nanoparticles into macroscopic materials [J]. Nature, 1996, 382(6592): 607-609.

[3] Anker J N, Hall W P, Lyandres O, et al. Biosensing with plasmonic nanosensors [J]. Nature materials, 2008, 7(6): 442-453.

[4] Ghosh P, Han G, De M, et al. Gold nanoparticles in delivery applications [J]. Advanced drug delivery reviews, 2008, 60(11): 1307-1315.

[5] Daniel M C, Astruc D. Gold nanoparticles: assembly, supramolecular chemistry, quantum-size-related properties, and applications toward biology, catalysis, and nanotechnology [J]. Chemical reviews, 2004, 104(1): 293-346.

[6] Brust M, Walker M, Bethell D, et al. Synthesis of thiol-derivatised gold nanoparticles in a two-phase liquid-liquid system [J]. J Chem Soc, Chem Commun, 1994, (7): 801-802.

[7] Sau T K, Murphy C J. Room temperature, high-yield synthesis of multiple shapes of gold nanoparticles in aqueous solution [J]. Journal of the American Chemical Society, 2004, 126(28): 8648-8649.

[8] Murphy C J, Gole A M, Stone J W, et al. Gold nanoparticles in biology: beyond toxicity to cellular imaging [J]. Accounts of Chemical Research, 2008, 41(12): 1721-1730.

[9] He P, Urban M W. Phospholipid-stabilized Au-nanoparticles [J]. Biomacromolecules, 2005, 6(3): 1224-1225.

[10] Kumar K P, Paul W, Sharma C P. Green synthesis of gold nanoparticles with zingiber officinale extract: Characterization and blood compatibility [J]. Process Biochemistry, 2011, 46(10): 2007-2013.

[11] Laudenslager M J, Schiffman J D, Schauer C L. Carboxymethyl chitosan as a matrix material for platinum, gold, and silver nanoparticles [J]. Biomacromolecules, 2008, 9(10): 2682-2685.

[12] Kallet R H, Jasmer R M, Luce J M, et al. The treatment of acidosis in acute lung injury with tris-hydroxymethyl aminomethane (THAM) [J]. American journal of respiratory and critical care medicine, 2000, 161(4): 1149-1153.

[13] Mou J, Yang J, Shao Z. Tris (hydroxymethyl) aminomethane (C4H11NO3) induced a ripple phase in supported unilamellar phospholipid bilayers [J]. Biochemistry, 1994, 33(15): 4439-4443.

[14] Frens G. Controlled nucleation for the regulation of the particle size in monodisperse gold suspensions [J]. Nature, 1973, 241(105): 20-22.

[15] Newman J D S, Blanchard G J. Formation of gold nanoparticles using amine reducing agents [J]. Langmuir, 2006, 22(13): 5882-5887.

[16] Bates R G, Hetzer H B. Dissociation constant of the protonated acid form of 2-amino-2-(hydroxymethyl)-1, 3-propanediol (tris-hydroxymethyl)-aminomethane and related thermodynamic quantities from 0 to 50° [J]. The Journal of Physical Chemistry, 1961, 65(4): 667-671.

Ultrasonic Synthesis Method of Gold Nanoparticles Using Tris (Hydroxymethyl) Aminomethane

CHEN Feng, CAO Bozhi, YANG Guangcan
(College of Physics and Electronic Information Engineering, Wenzhou University, Wenzhou, China 325035)

This paper introduces the method for reduction of the chloroauric acid solution under the alkaline condition via first use of tris (hydroxymethyl) aminomethane (Tris) as a reducing agent. The controled synthsis of gold nanoparticles proves stabilized through adjusting the ratio of Tris and NaOH, reaction time and accretion of stabilizers, which makes the size of ions between 15nm and 47 nm．

Tris (Hydroxymethyl) Aminomethane; Synthesis; Gold Nanoparticles

O648

A

1674-3563(2015)01-0032-06

10.3875/j.issn.1674-3563.2015.01.006 本文的PDF文件可以從xuebao.wzu.edu.cn獲得

(編輯：封毅)

2014-03-26

研究生創(chuàng)新基金(31606036010187)

陳峰(1987年- )，男，安徽亳州人，碩士研究生，研究方向：DNA與蛋白質(zhì)相互作用的紅外光譜研究．? 通訊作者，yanggc@wzu.edu.cn