金偉華 范開華 肖雯婧 馬婕 王慶松

(成都軍區(qū)總醫(yī)院藥劑科， 四川 成都 610083)

米非司酮對創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙預(yù)防作用的實(shí)驗(yàn)研究*

金偉華 范開華 肖雯婧 馬婕 王慶松

(成都軍區(qū)總醫(yī)院藥劑科， 四川 成都 610083)

目的 建立較理想的創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙(PTSD)動物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ筒⒃u價米非司酮對PTSD的預(yù)防效果。方法 建立大鼠捕食應(yīng)激模型，隨機(jī)分為對照組、模型組和干預(yù)組(高、中、低劑量亞組)每組8只。隨后采用行為學(xué)實(shí)驗(yàn)，空間學(xué)習(xí)記憶能力實(shí)驗(yàn)評價米非司酮對PTSD發(fā)生的預(yù)防效果，同時觀察米非司酮干預(yù)后大鼠皮質(zhì)酮水平變化與腦組織細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果 米非司酮可改善大鼠應(yīng)激后的活動習(xí)性改變、警覺水平過高、驚恐行為、環(huán)境適應(yīng)能力下降、躲藏逃避反應(yīng)等多種行為異常以及空間學(xué)習(xí)和記憶能力障礙，同時，米非司酮可升高大鼠應(yīng)激后血清皮質(zhì)酮水平，抑制大鼠腦組織細(xì)胞bcl-2表達(dá)。結(jié)論 米非司酮可預(yù)防捕食應(yīng)激大鼠PTSD癥狀發(fā)生。

米非司酮； 創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙； 預(yù)防

創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙( Posttraumatic stress disorder , PTSD) 是由嚴(yán)重心理或生理刺激所引發(fā)的一系列精神與行為障礙[1]。PTSD的發(fā)生不僅會顯著影響患者的個人生活并會為個人及社會帶來極大的經(jīng)濟(jì)損失。因此, 研究如何預(yù)防和治療PTSD具有十分重要的意義[2,3]。

捕食應(yīng)激誘發(fā)實(shí)驗(yàn)動物模型具有活動習(xí)性改變、警覺水平過高、驚恐行為、環(huán)境適應(yīng)能力下降、躲藏逃避反應(yīng)，以及空間學(xué)習(xí)和記憶能力受損的特點(diǎn)并且與PTSD具有相似的致病因素和過程，可基本滿足其主要臨床表現(xiàn)，是研究PTSD預(yù)防和治療的理想動物模型[6]。米非司酮 (RU38486)，一種糖皮質(zhì)激素受體拮抗劑，Julia A Golier 等報道米非司酮可改善退伍女兵PTSD癥狀并且與皮質(zhì)酮水平有關(guān)，因此提出需要更多的實(shí)驗(yàn)用于研究米非司酮在PTSD中的應(yīng)用[7]。而米非司酮是否可用于預(yù)防PTSD的發(fā)生尚無文獻(xiàn)報道。在本實(shí)驗(yàn)中我們選擇捕食應(yīng)激模型, 并在應(yīng)激后早期使用米非司酮進(jìn)行干預(yù)，隨之觀察其是否可預(yù)防模型大鼠的行為及空間學(xué)習(xí)記憶改變及血清皮質(zhì)酮水平相應(yīng)變化。

1 實(shí)驗(yàn)與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及材料 健康雄性Wistar大鼠, 6～7周齡, 體質(zhì)量200～220g, 由四川大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。 12小時光亮/黑暗條件，22～25℃環(huán)境溫度，分隔喂養(yǎng)，喂養(yǎng)一周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。Morris水迷宮及曠場行為觀察箱(成都軍區(qū)總醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室)；高速臺式離心機(jī)(TGL-180G-C)；血清皮質(zhì)醇ELISA試劑盒及bcl-2試劑盒(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)；米非司酮(北京紫竹天工科技有限公司，批號: 20100701)。

1.2 研究方法

1.2.1 動物分組及模型制備 按照文獻(xiàn)[6]制備捕食應(yīng)激動物模型：先將大鼠放入捕食應(yīng)激實(shí)驗(yàn)箱的小籠中，再將一饑餓的貓放入實(shí)驗(yàn)箱中，使貓與大鼠無生理傷害性接觸10 min后將貓取走。對照組大鼠(8只)除不接觸貓外，其它處理程序相同。應(yīng)激大鼠隨機(jī)分為模型組和干預(yù)組中的不同劑量亞組(RU-L 組、RU-M與 RU-H組)每組各8只，給藥劑量:RU-L 組 25mg/kg、RU-M組50mg/kg、 RU-H組75mg/kg，于刺激后立即腹腔注射給藥。

1.2.2 行為學(xué)研究[8]于捕食應(yīng)激后3、14、30天觀察行為改變，并于3、10天觀察空間學(xué)習(xí)和記憶能力的改變。①驚嚇反應(yīng)：觀察動物接受反復(fù)、短暫(1～2 s) 高頻金屬音刺激后行為習(xí)性、自主活動及適應(yīng)能力的變化。②曠場活動性：將大鼠輕輕放入曠場行為觀察箱中央小方格內(nèi)，觀測30 s內(nèi)動物的活動情況。計分標(biāo)準(zhǔn)：鼠二分之一以上的身體從所在方格進(jìn)入相鄰方格計1分，鼠后肢性站立計1分，二者相加為其所得總分?jǐn)?shù)。③拒俘反應(yīng)性：以動物從未接觸過的手套輕抓大鼠,觀察其反應(yīng)。記分標(biāo)準(zhǔn)0:很容易抓取動物;1:尖叫或回避;2:尖叫并回避;3:逃脫;4:逃脫并尖叫;5:咬或試圖撕咬手套;6:主動躍起攻擊。

1.2.3 空間學(xué)習(xí)記憶能力觀察 采用Morris水迷宮法[9]。第1、2天為空間定向條件反射訓(xùn)練(spatial bias )。第l天訓(xùn)練9次，每次2min，記錄動物從不同象限入水至發(fā)現(xiàn)并爬上平臺的時間為訓(xùn)練潛伏期，每3次的均值作為1個觀察單位。第2天重復(fù)進(jìn)行6次訓(xùn)練。比較所得的5個觀察單位訓(xùn)練潛伏期變化以分析動物獲取空間信息的能力，第3天進(jìn)行空間覓向能力測試(probe tria1)：先將平臺移去，再將動物放入水中2 min，記錄它在4個象限中停留時間的百分比，以判斷動物記憶儲存及提取再現(xiàn)能力。

1.2.4 激素水平測定 分別于大鼠應(yīng)激后0、12、24小時眼眶取血，3000g離心10 min 后,收集血清。采用酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)測定大鼠皮質(zhì)酮(CORT)變化。

1.2.5 免疫組化實(shí)驗(yàn) 應(yīng)激后一個月，完成行為學(xué)實(shí)驗(yàn)后，處死大鼠。對大鼠腦組織使用4 %多聚甲醛灌流固定,常規(guī)石蠟包埋,做冠狀切片,厚5μm。按照試劑盒說明書進(jìn)行PV法bcl-2免疫組織化學(xué)顯色。應(yīng)用形態(tài)學(xué)圖像分析系統(tǒng)軟件,記錄陽性細(xì)胞光密度,對上述免疫組織化學(xué)顯色切片進(jìn)行了半定量分析。

2 結(jié)果

2.1 驚嚇反應(yīng) 在短暫高頻金屬音刺激時，對照組鼠出現(xiàn)1～3s的輕微驚嚇反射，在重復(fù)3次以上同樣刺激后很快適應(yīng)。模型組鼠在1月內(nèi)，在受到同樣高頻金屬音刺激時均出現(xiàn)明顯的驚嚇反應(yīng)，表現(xiàn)為全身性驚嚇反射、反應(yīng)幅度增大、持續(xù)時間長(5～10 s)，并出現(xiàn)打洞、埋頭、趨暗性等多種躲藏和逃避性焦慮樣行為(anxiety-like behavior)，且對刺激的適應(yīng)時間明顯延長，在反復(fù)刺激6～10次后仍有較明顯驚嚇反應(yīng)。干預(yù)組中的RU-L與RU-M組大鼠與模型大鼠反應(yīng)相似，而RU-H組大鼠兩周后適應(yīng)驚嚇。

2.2 曠場活動性 模型組曠場活動明顯減少，而干預(yù)組的RU-M與RU-H組曠場活動顯著增強(qiáng)，14天內(nèi)仍然低于對照組，但30天與對照組無顯著性差異(P>0.05)，RU-L組與模型組無顯著差異(P>0.05)，見表1。

表1 大鼠曠場活動性計分改變比較分)

注：采用雙因素方差分析，與對照組相比①P<0.05與模型組比較,②P<0.05

2.3 拒俘反應(yīng)性 模型組拒俘反應(yīng)性顯著增強(qiáng)且30天后仍然顯著高于對照組，而干預(yù)組的RU-H組14天后反應(yīng)減弱與對照組無顯著性差異，而RU-L與RU-M組略低于模型組但無顯著性差異,見表2。

表2 大鼠拒俘反應(yīng)性計分改變比較分)

注：采用雙因素方差分析,與對照組相比①P<0.05與模型組比較，②P<0.05，

2.4 空間學(xué)習(xí)記憶能力改變 應(yīng)激后第3天，進(jìn)行訓(xùn)練潛伏結(jié)果顯示，模型組訓(xùn)練期顯著增長，而經(jīng)米非司酮干預(yù)后大鼠訓(xùn)練期均有所下降，且有劑量依賴性，見表3。

表3 各組Morris水迷宮訓(xùn)練潛伏期比較分)

注：采用雙因素方差分析：與對照組相比①P<0.05，與模型組比較②P<0.05

2.5 激素水平變化 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，米非司酮可提高大鼠應(yīng)激后皮質(zhì)酮水平，且有劑量依賴性，見表4。

表4 各組大鼠應(yīng)激后皮質(zhì)酮水平變化

注：采用雙因素方差分析：與對照組相比①P<0.05，與模型組比較②P<0.05

2.6 免疫組織學(xué)化顯色結(jié)果 免疫組織化學(xué)顯色陽性結(jié)果為棕黃色顆粒,定位于細(xì)胞質(zhì)。在對照組大鼠腦組織中有少量陽性信號,而在應(yīng)激后bcl-2表達(dá)明顯增多，且米非司酮可抑制bcl-2半定量計數(shù)結(jié)果顯示該抑制作用具有劑量依耐性，見圖1。

3 討論

創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙( Posttraumatic stress disorder , PTSD) 是由嚴(yán)重心理或生理刺激所引發(fā)的一系列精神與行為障礙。PTSD伴隨當(dāng)今社會暴力事件、自然災(zāi)害、戰(zhàn)爭以及重大交通事故等災(zāi)難性事件的急劇增加而倍受關(guān)注，其癥狀主要表現(xiàn)為：① 再體驗(yàn)/闖入。② 回避/麻木。③ 過度覺醒[4,5]。PTSD具有患病率高、 療效差等特點(diǎn)，流行病學(xué)研究表明, 每個人一生中有50% 的機(jī)率經(jīng)歷災(zāi)難性事件,普通人群中男性和女性PTSD 的終生患病率分別為6% 和12% , 而戰(zhàn)爭和癌癥患者的發(fā)病率最高。目前,PTSD及其神經(jīng)生物學(xué)致病機(jī)制的探討己成為涉及創(chuàng)傷學(xué)、神經(jīng)精神病學(xué)、心理學(xué)等跨學(xué)科研究的重點(diǎn)。神經(jīng)生物學(xué)致病機(jī)制的研究顯示,PTSD具有不同于普通應(yīng)激反應(yīng)及其他精神疾患的變化規(guī)律和特點(diǎn)。下丘腦-垂體-腎上腺(hypothalamic-pituitary-adrenal,HPA)軸功能紊亂在PTSD調(diào)控中有重要作用[10]。而糖皮質(zhì)激素系統(tǒng)對HPA軸的調(diào)控受到日益重視，其中皮質(zhì)醇可能有明顯的抗應(yīng)激效應(yīng)。研究顯示PTSD患者者24h尿平均皮質(zhì)醇含量明顯減少,血漿基礎(chǔ)皮質(zhì)醇水平降低,淋巴細(xì)胞內(nèi)糖皮質(zhì)激素受體數(shù)目增加,地塞米松抑制試驗(yàn)顯示患者HPA軸負(fù)反饋抑制作用增強(qiáng),推測急性創(chuàng)傷應(yīng)激后或慢性應(yīng)激狀態(tài)時,持續(xù)性低皮質(zhì)醇反應(yīng)和HPA軸負(fù)反饋抑制作用增強(qiáng)[11]。

圖1 應(yīng)激后大鼠bcl-2表達(dá)

Figure 1 Expression of bcl-2 after stress

米非司酮是一種特異性的糖皮質(zhì)激素受體(GRs)拮抗劑，它可以阻斷血清皮質(zhì)酮對HPA軸的負(fù)反饋抑制[12]。同時，米非司酮可以上調(diào)中樞鹽皮質(zhì)激素受體表達(dá)(MRs)，從而改變中樞GRs與MRs的比例，GRs與MRs的比例在HPA調(diào)節(jié)中扮演著重要角色[13]，因此，米非司酮有可能通過以上機(jī)制預(yù)防PTSD或改善其癥狀。

4 結(jié)論與啟示

本實(shí)驗(yàn)通過捕食應(yīng)激模型模擬PTSD的發(fā)生過程，考察米非司酮對PTSD的預(yù)防效果，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，米非司酮可有效預(yù)防應(yīng)激造成的驚嚇反應(yīng)與空間學(xué)習(xí)障礙等有關(guān)反應(yīng)，同時可保護(hù)腦組織由于應(yīng)激所造成的細(xì)胞凋亡，因此，可以認(rèn)為米非司酮可用于預(yù)防PTSD的發(fā)生，而且米非司酮改善模型動物應(yīng)激后反應(yīng)還具有劑量依賴性，提示大劑量米非司酮具有更好的預(yù)防效果。

[1]Yamamoto S, Morinobu S, Fuchikami,etal. Effects of Single Prolonged Stress and d-Cycloserine on Contextual Fear Extinction and Hippocampal NMDA Receptor Expression in a Rat Model of PTSD [J]. Neuropsychopharmacology, 2008, 33: 2108-2116.

[2]Blanchard EB, Hickling EJ, Taylor TC,etal. Psychophysiology of posttraumatic stress disorder related to motorveh icle accidents:rep licat ion and exten sion [J]. J Consul Clin Psychol, 1996, 64(4):742-748.

[3]Kessl RC, Sonnega A, Bromel E,etal. Posttraumatic stress disorder in the National Comorbidity Survey [J]. Arch Gen Psychiatry, 1995, 52(12):1048-1060.

[4]王慶松，黃大熔.創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙[J]. 解放軍醫(yī)學(xué)雜志, 1998，23(06)：480-481.

[5]Bryant RA , Harvey AG, Gut hrie RM,etal. A prospective study of psychophysiological arousal, acute stress disorder, and posttraumatic stress disorder [J]. J Abnorm Psychol, 2000, 109(2):341-344.

[6]王慶松，張建華．捕食應(yīng)激對大鼠行為及空間學(xué)習(xí)記憶的影響[J]．中華精神科雜志, 2001，34(3)：180-183.

[7]JA Golier, K Caramanica, R DeMaria,etal. A Pilot Study of Mifepristone in Combat-Related PTSD [J]. Depress Res Treat, 2012,(10)1155/2012/393251.

[8]Kalynchuk L E, Pinel JPJ, Treit Detal. Presistence of the interictal emotionality produced by long-term amygdala kindling in rats [J]. Neuroscience, 1998,85(4): 1311-1319.

[9]ER de Kloet. Stress in the brain [J]. Eur J Pharmacol, 2000, 405(1-3):187-198.

[10] Yehuda R, Bierer LM, Schlneidler J. Low cortical and risk for PTSD in adult off spring of holocaust survivors[J]. Am J psychiatry, 2000, 157(8):1252-1259.

[11] Sarkar NN. Mifepristone: bioavailability, pharmacokinetics and use-effectiveness [J]. Eur J OobstetT Gyn R B, 2002,101(2):113-120.

[12] Belanoff JK, Rothschild AJ, Cassidy Fetal. An open label trial of C-1073 (mifepristone) for psychotic major depression [J]. Biol Psychiat, 2002, 52(5):386-392.

[13] Buckley T, Duggal V, Schatzberg AF. The acute and post-discontinuation effects of a glucocorticoid receptor (GR) antagonist probe on sleep and the HPA axis in chronic insomnia: a pilot study [J]. J Clin Sleep Med, 2008, 4(3): 235-241.

The preventive effects of mifepristone for posttraumatic stress disorder

JIN Weihua, FAN Kaihua, XIAO Wenjing,etal

(DepartmentofPharmacy,ChengduMilitaryGeneralHospital,Chengdu610083,China)

Objective To explore mifepristone the preventive effect on PTSD (posttraumatic stress disorder) rats. Methods Rats of PTSD animal model were randomly divided into control group, model group and mifepristone (L/M/H) group which adminstered mifepristone. The behavior changes of rat were observed with open-field test, reject grip test and Morris water maze test and corticosterone level in rat blood serum was determined with ELISA. Immunohistochemistry was used to detect the expressions of bcl-2 in the neurons. Results Mifepristone prevented the behavior changes after the rats were explored to the predator, such as behavioral habits, anxiety, defense, spatial learning and memory. RU38468 also increased cortisol level and decreased the expression of bcl-2. Conclusion This study provides a new idea that mifepristone may have the preventive effects for posttraumatic stress disorder.

Mifepristone; Posttraumatic stress disorder; Prevention

四川省科技廳支撐項(xiàng)目(2011SZ0154)

R 982

A

10.3969/j.issn.1672-3511.2015.07.038

2014-05-04；

2014-09-10； 編輯： 陳舟貴)