唐 英，吳曉牧，胡 凡，柴 文，胡國(guó)柱，吳梨華，張昆南

糖尿病（DM）患者大血管病變是其死亡的主要原因，其心、腦血管疾病的發(fā)病率均顯著高于非糖尿病人群［1，2］。但單純高血糖與動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)系及其可能機(jī)制仍不十分清楚。本研究以單純高血糖為特征的2型糖尿病模型大鼠為研究對(duì)象，觀察高血糖是否能引起頸動(dòng)脈脂紋、脂質(zhì)斑塊形成，以及其與血糖、血脂、同型半胱氨酸及果糖胺之關(guān)系，探討糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化的形成和發(fā)展機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 12周齡SPF級(jí)SD雄性大鼠（260g～280g）50只（購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心），40%脂肪的胰島素抵抗誘導(dǎo)模型食料（上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司），大鼠胰島素（INS）酶聯(lián)免疫試劑盒（美國(guó) Millipore公司），全自動(dòng)生化儀（日本HITACHI 7600－120）。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型制備及分組 SD雄性大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后按體重隨機(jī)分為正常對(duì)照組（對(duì)照組12只）和糖尿病模型組（38只），均高脂飼料喂養(yǎng)，每只大鼠每天定量25g，自由飲水，自然晝夜照明，相對(duì)濕度為50% ～70%，室溫（22～24）℃。4周后，隔夜空腹12 h，造模組大鼠腹腔注射鏈脲佐菌素（Streptozocin，STZ）溶液35mg／kg；對(duì)照組腹腔注射0.1mol／L檸檬酸鈉緩沖液。72h后禁食8h～12h大鼠尾靜脈采血測(cè)定空腹血糖（FBG），以血糖濃度＞16.7mmol／L以上為2型糖尿病大鼠模型造模成功，達(dá)到模型標(biāo)準(zhǔn)且未死亡的共30只。30只糖尿病模型大鼠隨機(jī)分為糖尿病1月組（DM1組），3月組（DM3組）和5月組（DM5組），每組10只大鼠。但實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)由于糖尿病模型大鼠出現(xiàn)死亡，因此DM1組最后為9只，DM3組為10只，DM5組為8只。

1.2.2 大鼠體重 采用電子盤稱每1周稱體重1次。

1.2.3 大鼠血液樣本采集 0月，1月，3月，5月空腹大鼠乙醚麻醉后內(nèi)眥靜脈取血，室溫放置30min后3 000r／min離心15min分離血清，－80℃保存。

1.2.4 空腹血糖測(cè)定 采用已糖激酶法通過(guò)全自動(dòng)生化儀測(cè)定外周血空腹血糖（fasting blood glucose，F(xiàn)BG）。

1.2.5 胰島素測(cè)定 采用ELISA方法測(cè)定大鼠空腹血清胰島素，實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書實(shí)驗(yàn)程序進(jìn)行，胰島素含量根據(jù)試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)得。

1.2.6 血清生化指標(biāo)測(cè)定 三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL－C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL－C）、同型半胱氨酸 （HCY）和果糖胺（FMN）含量采用全自動(dòng)生化儀測(cè)定。

1.2.7 形態(tài)學(xué)觀察 分別于采血后經(jīng)水合氯醛腹腔麻醉大鼠，開(kāi)胸、開(kāi)腹，夾閉腹主動(dòng)脈，將連有輸液器的針頭插入左心室并剪開(kāi)右心耳，先灌注150mL生理鹽水，隨后用4.0%多聚甲醛進(jìn)行灌注。待灌注完成后取出左側(cè)頸總動(dòng)脈，將所得血管放入裝有4.0%多聚甲醛的容器中固定4h～6h，包埋，石蠟切片厚4 μm，切片脫蠟水化，常規(guī)HE染色，光鏡觀察動(dòng)脈粥樣硬化病變。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 20.0軟件處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，方差齊時(shí)采用LSD比較，方差不齊時(shí)用秩和檢驗(yàn)。相關(guān)性分析統(tǒng)計(jì)采用Person法。

2 結(jié) 果

2.1 各組動(dòng)脈壁的病理改變 糖尿病組動(dòng)脈內(nèi)膜內(nèi)皮細(xì)胞層下基質(zhì)層變厚，有核細(xì)胞增多，核變大，3月時(shí)可見(jiàn)血管壁局限增厚，可觀察到少許泡沫細(xì)胞，5月時(shí)泡沫細(xì)胞數(shù)量未見(jiàn)明顯增多，但較3月時(shí)多，尚未形成典型粥樣斑塊，符合動(dòng)脈粥樣硬化的早期病理改變。糖尿病組中膜層結(jié)構(gòu)變疏松，彈性纖維減少，間距變大，許多平滑肌細(xì)胞核變大，變圓，細(xì)胞變短，由收縮型變?yōu)楹铣尚?，并出現(xiàn)了平滑肌細(xì)胞的遷移。而對(duì)照組動(dòng)脈壁結(jié)構(gòu)平整，內(nèi)皮細(xì)胞光整，排列規(guī)則，動(dòng)脈中膜平滑肌仍為收縮型，為正常大鼠血管。

2.2 各組血糖、血脂、同型半胱氨酸和果糖胺水平比較 糖尿病各組與對(duì)照組比較，F(xiàn)BG，TC，TG，LDLC，HCY，F(xiàn)MN等差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；DM1組 HDL－C 高于對(duì)照組（P＜0.01）；各模型組之間FBG，TC，HCY，F(xiàn)MN差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。詳見(jiàn)表1。

表1 各組血糖、血脂、同型半胱氨酸和果糖胺水平比較（x±s）

3 討 論

根據(jù)2型糖尿病發(fā)病機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)選用SD大鼠先喂以高脂飼料1月誘導(dǎo)胰島素抵抗，然后一次性腹腔注射低劑量STZ 35mg／kg誘導(dǎo)胰島素抵抗大鼠產(chǎn)生高血糖。STZ注射后72h時(shí)，與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠FBG急劇增加至16.7mmol／L以上，同時(shí)出現(xiàn)多飲、多食、多尿等癥狀，雖然隨著實(shí)驗(yàn)進(jìn)行，模型組血糖水平有逐漸下降的趨勢(shì)，但是至成模5月后仍高于正常水平，糖尿病模型建立成功且穩(wěn)定。糖尿病動(dòng)物模型造模前后均給高脂飼料喂養(yǎng)。

本研究中，用HE染色觀察糖尿病大鼠動(dòng)脈壁結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)該糖尿病動(dòng)物模型動(dòng)脈壁特點(diǎn)為：內(nèi)皮細(xì)胞層下基質(zhì)層變厚，有核細(xì)胞增多，核變大，變圓，細(xì)胞變短，向內(nèi)皮遷移，內(nèi)皮細(xì)胞聚集變形，形成纖維帽；血管壁局限增厚，可觀察到泡沫細(xì)胞，至5月時(shí)已形成脂紋，此變化符合動(dòng)脈粥樣硬化病理變化的早期改變［3］，中膜層結(jié)構(gòu)變疏松，彈性纖維增生，呈玻璃樣變，許多平滑肌細(xì)胞由收縮型變?yōu)楹铣尚停⒊霈F(xiàn)了平滑肌細(xì)胞的遷移。而對(duì)照組大鼠動(dòng)脈內(nèi)膜層光滑，無(wú)脂質(zhì)沉積，無(wú)泡沫細(xì)胞，中膜層平滑肌細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞核清晰。上述病理結(jié)果提示，糖尿病大鼠已發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化，其顯著特點(diǎn)是泡沫細(xì)胞和脂紋的形成，以及早期出現(xiàn)的平滑肌細(xì)胞的變形、遷移和增殖。

動(dòng)脈粥樣硬化是一種脂質(zhì)相關(guān)的慢性炎癥免疫疾病，動(dòng)脈粥樣硬化的形成是一個(gè)緩慢而復(fù)雜的過(guò)程，血脂沉積于損傷的動(dòng)脈內(nèi)膜，脂肪沉積刺激動(dòng)脈內(nèi)壁平滑肌細(xì)胞和纖維細(xì)胞增生，增生不斷發(fā)展連成纖維斑塊，大量炎癥免疫細(xì)胞聚集在動(dòng)脈粥樣斑塊中［4］，從而造成血管病變、微循環(huán)障礙及血液流變學(xué)改變，最終導(dǎo)致心腦血管病變發(fā)生，嚴(yán)重影響人類健康和生活質(zhì)量。LDL－C、高濃度的TG和TC已被證實(shí)是動(dòng)脈粥樣硬化疾病的主要危險(xiǎn)因素［5］。在本研究中，模型組各組的TC、TG、LDL－C與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；說(shuō)明模型組在血糖升高的同時(shí)也伴隨著血脂濃度的升高，它們共同促進(jìn)血管的動(dòng)脈粥樣硬化。

高同型半胱氨酸可能通過(guò)以下機(jī)制導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化、血栓形成及腦梗死的發(fā)生：①通過(guò)氧化應(yīng)激損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞；②LDL形成復(fù)合物后被巨噬細(xì)胞吞噬，形成泡沫細(xì)胞；③刺激血管平滑肌細(xì)胞的增殖；④增加血小板凝血烷的合成，破壞機(jī)體凝血與纖溶系統(tǒng)之間的平衡；⑤促進(jìn)細(xì)胞凋亡；⑥其他如炎癥反應(yīng)等。通過(guò)上述機(jī)制過(guò)多、過(guò)高的同型半胱氨酸可以腐蝕損害血管造成血栓的形成。在本研究中，模型組各組的HCY與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；說(shuō)明模型組在血糖升高的同時(shí)也伴隨著HCY濃度的升高，它們共同促進(jìn)血管的動(dòng)脈粥樣硬化。輕度升高的同型半胱氨酸血癥與心腦血管疾病之間無(wú)內(nèi)在的必然聯(lián)系或聯(lián)系很?。?］。同型半胱氨酸的致動(dòng)脈粥樣硬化機(jī)制仍需要進(jìn)一步深入研究和探討。

高血糖動(dòng)物模型出現(xiàn)了明確的動(dòng)脈粥樣硬化的部分特征性表現(xiàn)，說(shuō)明高血糖是動(dòng)脈粥樣硬化的一個(gè)重要原因；糖尿病動(dòng)物模型存在高三酰甘油、高膽固醇、高低密度脂蛋白、高同型半胱氨酸及血果糖胺的升高；上述指標(biāo)的增高可能是糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化的危險(xiǎn)因素，其作用可能與內(nèi)皮細(xì)胞受損，動(dòng)脈壁局部炎癥介質(zhì)表達(dá)有關(guān)，但它們導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的分子機(jī)制仍有待進(jìn)一步的研究。

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