沈?qū)W懷，張丹俊，潘孝成，戴 銀，趙瑞宏，胡曉苗，侯紅艷，周學(xué)利，朱傳民

（安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，安徽合肥230031）

番鴨又稱瘤頭鴨或麝香鴨，具有生長速度快、飼料報酬高、耐粗飼、肉質(zhì)鮮嫩等特點，近年來在我國的南方地區(qū)的養(yǎng)殖量逐漸增加［1］。由于飼養(yǎng)量的增加，其疫病的發(fā)生也呈現(xiàn)逐年上升趨勢，目前，關(guān)于番鴨疫病的研究仍落后于其他家禽［2］。細(xì)胞培養(yǎng)模擬細(xì)胞在體內(nèi)的生長環(huán)境，使其在體外繼續(xù)生長增殖從而用于試驗研究，其在細(xì)胞學(xué)、病毒學(xué)、免疫學(xué)和基因功能組學(xué)等多領(lǐng)域中發(fā)揮重要作用［3］。由于一些番鴨疫病如番鴨細(xì)小病毒病等在自然環(huán)境下感染僅有番鴨發(fā)?。?］，因此，與鴨胚成纖維細(xì)胞（DEF）相比，MDEF 更適合作為相關(guān)疫病的體外研究模型［5］，但目前鮮有系統(tǒng)的MDEF 原代分離和培養(yǎng)的研究報道，鑒于此，本研究對MDEF的體外培養(yǎng)、傳代和凍存技術(shù)進(jìn)行較為系統(tǒng)的研究，旨在為建立適用于番鴨疫病相關(guān)研究的體外細(xì)胞培養(yǎng)體系奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗用番鴨胚 番鴨胚購買于安徽安慶某種番鴨場，于本研究室孵化箱中孵化至11胚齡。

1.1.2 主要試劑 DMEM 高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、D－Hanks平衡液均是Hyclone（美國）產(chǎn)品；二甲基亞砜（DMSO）為Sigma公司產(chǎn)品；2.5g／L 胰蛋白酶、青鏈霉素混合液均購自碧云天生物技術(shù)公司。

1.2 方法

1.2.1 不同消化方式對MDEF活率的影響 取11日齡番鴨胚，用碘酒和酒精消毒蛋殼，從氣室端用鑷子小心取出鴨胚，置于滅菌玻璃皿中；用剪刀小心去除頭、四肢和內(nèi)臟部分，剩余胚體用D－Hanks平衡液清洗3次，將洗凈的胚體移入小燒杯中，用消毒剪刀反復(fù)剪碎，剪碎后的胚體分為兩等份。

1.2.1.1 熱消化法 取1份剪碎胚體加入5倍體積2.5g／L胰酶于三角燒瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化，消化過程中每間隔10 min輕混消化瓶，注意觀察消化程度，以胚體碎塊邊緣呈現(xiàn)毛絮狀，消化液開始渾濁為宜，取出消化瓶，用剪頭吸管反復(fù)吹吸，待組織快基本消失后，加入等體積完全培養(yǎng)基（含100mL／L血清的DMEM）混勻，用四層滅菌紗布過濾，細(xì)胞濾液于1 000r／min離心3 min，棄去上清液，加入完全培養(yǎng)基，吹打分散細(xì)胞，取少許細(xì)胞臺盼藍(lán)染色，計數(shù)并計算細(xì)胞活率，調(diào)整細(xì)胞密度（2×106／mL）個／mL，分裝于培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板中，于37℃體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.1.2 冷消化法 取相同體積的胚體和胰酶，混勻后置于4℃冰箱消化過夜（12h～18h），其余操作與熱消化法相同，臺盼藍(lán)染色，計數(shù)并計算細(xì)胞活率，調(diào)整細(xì)胞密度后接種于細(xì)胞板，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 不同血清濃度對MDEF生長的影響 細(xì)胞過夜培養(yǎng)（12h～18h）貼壁后，棄去培養(yǎng)液，預(yù)熱的D－Hanks洗去除未貼壁細(xì)胞，分別更換含血清濃度為20、50、80、100mL／L 的DMEM 培養(yǎng)液，分別在12、24、48、72、96h，觀察細(xì)胞生長情 況并記錄，MTT 法檢測細(xì)胞增殖活性。

1.2.3 不同血清濃度對MDEF凍存活性的影響細(xì)胞鋪壁90%左右且生長狀態(tài)良好時，可進(jìn)行細(xì)胞凍存，凍存時細(xì)胞消化與傳代操作步驟相同，將分散的細(xì)胞懸液吸入離心管中，1 000r／min離心3min，棄去上清，分別吸取血清終濃度分別為100、150、200、250、300 mL／L 的 細(xì) 胞 凍 存 液（均 含 有100 mL／L的DMSO），輕輕吹打懸浮細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1.0×107個／mL，分裝入細(xì)胞凍存管中，每管分裝1mL，置于專用的細(xì)胞凍存盒中，放入－80℃冰箱過夜，次日取出放入液氮中保存。細(xì)胞復(fù)蘇時從液氮罐中取出凍存管，37℃水浴溶解，調(diào)整細(xì)胞密度后，接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)，每組設(shè)置6個重復(fù)，培養(yǎng)18h后使用MTT 法檢測細(xì)胞增殖活性。

1.2.4 離心對MDEF傳代和復(fù)蘇細(xì)胞活率的影響

1.2.4.1 離心對MDEF傳代細(xì)胞活率的影響 待細(xì)胞長滿瓶底部時進(jìn)行傳代，棄去瓶中培養(yǎng)液，DHanks液洗滌細(xì)胞表面2 次，加入適量預(yù)熱的2.5 g／L胰酶進(jìn)行消化，并置于顯微鏡下觀察，待細(xì)胞間出現(xiàn)裂隙，細(xì)胞逐漸變圓，個別細(xì)胞開始漂起時，傾去消化液，加入適量培養(yǎng)液，用移液槍反復(fù)輕輕吹打，使細(xì)胞分散成單個細(xì)胞。將細(xì)胞懸液分為2等份，1份以1 000r／min離心3min，棄去上清液，適量加入完全培養(yǎng)液，臺盼藍(lán)檢測細(xì)胞活率；另1 份不離心直接加入完全培養(yǎng)液后，檢測細(xì)胞活率。調(diào)整細(xì)胞密度為5×105個／mL，分裝于細(xì)胞瓶或細(xì)胞板中培養(yǎng)，觀察細(xì)胞貼壁和生長情況。

1.2.4.1 離心對MDEF復(fù)蘇細(xì)胞活率的影響 將凍存的細(xì)胞取出，37℃水浴溶解后分為2等份，1份緩緩加入3倍～4倍體完全培養(yǎng)基，以1 000r／min離心3min，棄去上清液，適量加入完全培養(yǎng)液，臺盼藍(lán)檢測細(xì)胞活率；另1份緩緩加入9倍～10倍體積的生長液，混勻后取少量細(xì)胞，檢測細(xì)胞活率，調(diào)整細(xì)胞密度，37℃培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，次日更換培養(yǎng)液，并觀察細(xì)胞貼壁和生長情況。

1.2.5 細(xì)胞計數(shù)與活率測定 取細(xì)胞懸液與4mL／L臺盼藍(lán)工作液以9∶1 的比例輕輕混合混勻，采用血球計數(shù)板在3min內(nèi)統(tǒng)計細(xì)胞密度和細(xì)胞活率，其中死細(xì)胞被染成藍(lán)色，而活細(xì)胞不著色。

細(xì)胞密度（細(xì)胞數(shù)／mL）＝（4大格的細(xì)胞數(shù)／4）×10 000×稀釋倍數(shù)；

細(xì)胞存活率（%）＝［（細(xì)胞總數(shù)－死細(xì)胞數(shù)）／細(xì)胞總數(shù)］×100%。

1.2.6 細(xì)胞活性測定 細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞板，待生長到一定階段，加入配置好的MTT 工作液（5mg／mL）20μL，孵育4h后，吸出細(xì)胞上清液，每孔加入200μL DMSO，取出培養(yǎng)板，振蕩10min，待紫色結(jié)晶物完全溶解，酶標(biāo)儀檢測，490nm 處測各孔的吸光值（OD490）。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

所有試驗均重復(fù)3次，試驗數(shù)據(jù)采用Excel軟件進(jìn)行初步整理，SPSS17.0 軟件進(jìn)行組間差異性比較。部分統(tǒng)計數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果

2.1 原代MDEF的生長與形態(tài)特征

采用2.5 g／L 胰 酶 消 化，獲 得 較 為 純 凈 的MDEF，原代細(xì)胞于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)4h后即可貼壁，在100mL／L血清培養(yǎng)液中細(xì)胞生長迅速，細(xì)胞貼壁緊密，呈長梭形，多數(shù)細(xì)胞向兩側(cè)伸出觸角，顯微鏡下觀察，細(xì)胞透亮，立體感較強(qiáng)，雜細(xì)胞少（圖1）。

圖1 原代番鴨胚成纖維細(xì)胞生長狀態(tài)（100×）Fig.1 Growth state of primary MDEF（100×）

2.2 不同消化方式對MDEF密度和活率的影響

相同體積的組織塊和消化液，分別采用熱、冷兩種方式進(jìn)行消化，經(jīng)細(xì)胞計數(shù)和臺盼藍(lán)染色對比細(xì)胞密度和活率，結(jié)果如圖所示（表1），冷消化法的細(xì)胞密度較熱消化法高1.85×106／mL，但差異不顯著（P＞0.05），細(xì)胞的活率較熱消化高5.55%，差異顯著（P＜0.05），由此可見，在MDEF 的原代培養(yǎng)中冷消化法優(yōu)于熱消化法。

表1 不同消化方式對原代番鴨胚細(xì)胞密度和活率的影響Table 1 Effect of different digestion methods on primary MDEF density and viability

2.3 不同的血清濃度對MDEF生長的影響

細(xì)胞在不同血清濃度的培養(yǎng)液中生長的速度存在 差 異，采 用 含 血 清20、50、80、100 mL／L 的DMEM 培養(yǎng)MDEF（圖2），血清的濃度越高，細(xì)胞生長速度越快，進(jìn)入平臺期的時間越短；在80mL／L 和100mL／L血清濃度培養(yǎng)48h后即可達(dá)到平臺期，隨后細(xì)胞快速衰老；50 mL／L 血清濃度培養(yǎng)細(xì)胞的平臺期推遲到72h，且衰老的速度較慢；20 mL／L血清濃度細(xì)胞生長緩慢，96h時仍具有較高的增值活性，但由于長時間沒有鋪滿底壁，出現(xiàn)形態(tài)不規(guī)則，并存在一些雜細(xì)胞。

圖2 不同血清濃度對番鴨胚成纖維細(xì)胞生長的影響Fig.2 Effect of different serum concentration on MDEF growth

2.4 不同的血清濃度對MDEF凍存活性的影響

使用DMSO 終濃度為100 mL／L，血清濃度分別為100、150、200、250、300mL／L的細(xì)胞凍存液凍存MDEF，比較細(xì)胞復(fù)蘇后的增值活性，結(jié)果顯示（圖3），在10%～20%范圍內(nèi)隨著凍存液中血清比例的升高細(xì)胞復(fù)蘇后的增殖活性顯著升高（P＜0.05），20%～30%范圍內(nèi)血清濃度的增加對MDEF的活性并無明顯的影響（P＞0.05），提示MDEF凍存液中DMSO∶血清∶培養(yǎng)液的比例為1∶2∶7可滿足MDEF的凍存需要。

圖3 不同血清濃度對番鴨成纖維細(xì)胞凍存活性的影響Fig.3 Effect of different serum concentration on MDEF cryopreservation viability

2.5 離心對MDEF傳代和復(fù)蘇活率的影響

細(xì)胞傳代或復(fù)蘇操作中，離心可去除培養(yǎng)液中殘留的消化液（如胰酶、膠原酶等）和DMSO 等，本研究探討在傳代和復(fù)蘇番鴨胚細(xì)胞操作中離心和不離心對細(xì)胞活率的影響（圖4～圖5），傳代時不離心細(xì)胞的活率較離心高1.65%（P＜0.05），復(fù)蘇時不離心細(xì)胞的活率較離心高0.96%，這可能由于離心操作會損傷部分細(xì)胞的細(xì)胞壁，而少量的消化液和低濃度的DMSO 不會影響細(xì)胞的貼壁和生長有關(guān)。

圖4 離心對原代番鴨胚成纖維細(xì)胞傳代和復(fù)蘇活率的影響Fig.4 Effect of centrifugation on MDEF viability after cell subculture and resuscitation

圖5 離心對復(fù)蘇番鴨胚成纖維細(xì)胞活率的影響（16h，200×）Fig.5 Effect of centrifugation on MDEF viability in resuscitation（16h，200×）

3 討論

原代組織細(xì)胞培養(yǎng)一般是通過組織消化法，胰蛋白酶是一種常用的組織消化酶，其可水解細(xì)胞間質(zhì)中精氨酸與賴氨酸羧基所形成的肽鍵，從而使組織塊分散成單個細(xì)胞［6－7］。本研究采用2.5g／L 的胰酶消化11 胚齡番鴨胚體，獲得較為純凈的MDEF，細(xì)胞呈長梭形，貼壁緊密，在含100 mL／L血清的DMEM 培養(yǎng)液中生長良好。原代細(xì)胞制備過程中常采用熱消化法，即將組織快與消化液混均后放入37℃培養(yǎng)箱中消化，此方法可較為快速的得到原代細(xì)胞，由于熱消化時消化酶的活力較強(qiáng)，原代細(xì)胞可能由于過度消化而造成損傷［8］。本研究比較了熱消化與冷消化在MDEF 制備過程中獲得的細(xì)胞密度和細(xì)胞活率，與熱消化法相比，冷消化獲得的細(xì)胞密度和細(xì)胞活率均明顯增加，這可能是由于低溫長時間消化，使組織塊消化的更徹底，且低活力的胰酶對細(xì)胞的損傷也較小。

血清中的營養(yǎng)物質(zhì)可促進(jìn)細(xì)胞的貼壁和生長［9－10］，不同種類的細(xì)胞生長所需血清的種類和濃度也不相同。對特定種類的細(xì)胞而言，不同濃度的血清也會使細(xì)胞表現(xiàn)出不同的生長曲線［11］，本研究分別采用20、50、80、100 mL／L FBS 的DMEM 培養(yǎng)液原代番鴨胚成纖維細(xì)胞，隨著血清濃度的升高M(jìn)DEF達(dá)到平臺期的時間越短，血清濃度高細(xì)胞生長迅速，可能不利于試驗的操作和觀察，而血清濃度太低會使原代細(xì)胞生長緩慢，并出現(xiàn)較多的雜細(xì)胞，因此在原代番鴨胚成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)中，應(yīng)根據(jù)研究需要進(jìn)行靈活的調(diào)整。

細(xì)胞凍存可保證細(xì)胞的擴(kuò)大培養(yǎng)和研究的連續(xù)使用，細(xì)胞凍存時必須使用細(xì)胞凍存液。血清中由于含有多種蛋白質(zhì)、多肽和激素等物質(zhì)，其在凍存液中不僅具有促細(xì)胞貼附和增殖作用，還可有效減少和緩沖不利因素對細(xì)胞的毒性和損傷［12］。研究表明，凍存液中血清的濃度會影響細(xì)胞復(fù)蘇時的活率［13］。本研究使用DMSO 為保護(hù)劑，終濃度100 mL／L，血 清 濃 度 分 別 為100、150、200、250、300 mL／L的細(xì)胞凍存液凍存MDEF，結(jié)果表明，血清濃度在20%時細(xì)胞活率顯著高于10%和15%，但血清濃度高于20%時對MDEF 的復(fù)蘇活率無顯著的影響，因此DMSO∶血清∶DMEM 濃度比為1∶2∶7時可滿足鴨胚成纖維細(xì)胞的凍存需求。

細(xì)胞傳代和復(fù)蘇過程中的離心操作可去除殘留的胰酶和凍存液，但離心操作會使細(xì)胞堆積，細(xì)胞壁相互粘連，在吹打細(xì)胞的過程中也會有部分細(xì)胞損傷［14］，除此之外，離心過程增加器材的使用，也相對增加了細(xì)胞被污染的機(jī)率。本研究比較離心與不離心在MDEF傳代和復(fù)蘇過程中對細(xì)胞活率的影響，結(jié)果顯示，在細(xì)胞傳代和復(fù)蘇過程中去除離心步驟，細(xì)胞活率分別提高1.65%和0.96%，細(xì)胞的貼壁和生長良好，并且使操作更加簡單。有研究發(fā)現(xiàn)，血清中的A2巨球蛋白有抑制胰蛋白酶的作用，可使殘留的胰酶被滅活［11］，DMSO 作為細(xì)胞凍存時的保護(hù)劑，可使細(xì)胞失去部分水分，從而在凍存和復(fù)蘇過程中防止細(xì)胞破裂，高濃度的DMSO 對細(xì)胞有一定毒性，本研究采用培養(yǎng)液對復(fù)蘇MDEF進(jìn)行9倍～10倍稀釋，DMSO 經(jīng)稀釋后終濃度約為10 mL／L，MDEF復(fù)蘇時的活率不僅沒有下降，反而增加了0.96%。有研究發(fā)現(xiàn)，DMSO、甘油等細(xì)胞凍存保護(hù)劑的濃度為1mol／L左右時對細(xì)胞相對無毒［15］，并且終濃度在20mL／L以內(nèi)的DMSO 不會對細(xì)胞的生長和活性產(chǎn)生明顯的影響［16－17］，本研究中由于去除離心操作，減少了細(xì)胞的損傷，細(xì)胞的活率反而有一定的增加。

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