劉耀川，張澤輝，王 莊，董家琪，王怡瑩，鄧旭明，劉明春＊

（1.沈陽農(nóng)業(yè)大學畜牧獸醫(yī)學院，遼寧沈陽110866；2.吉林大學動物醫(yī)學學院，吉林長春130062；3.遼寧省重大動物疫病應急中心，遼寧沈陽110161）

奶牛乳房炎（Mastitis）又稱奶牛乳腺炎，是乳房受到物理、化學及微生物等因素刺激所引起的炎癥，對奶業(yè)及養(yǎng)殖業(yè)危害巨大。其中，隱性乳房炎（Subclinical mastitis）因其隱蔽性高、臨床癥狀不明顯、病因繁雜、難以及時治療等特點而成為研究焦點。據(jù)統(tǒng)計，全球每年因奶牛乳房炎造成的經(jīng)濟損失約為350億美元，其中70%是由隱性乳房炎造成的奶量下降而引起的［1］。奶牛隱性乳房炎不僅能夠延長奶牛產(chǎn)后發(fā)情期和妊娠時間，而且影響乳產(chǎn)量及品質(zhì)，甚至造成食品安全問題，威脅人類健康。但由于該病無明顯臨床癥狀，給疾病的診斷及防治帶來困難。正常牛乳中含有一定數(shù)量的體細胞，其中包括淋巴細胞、巨噬細胞、中性粒細胞、乳腺上皮細胞及酸性細胞［2］。當發(fā)生乳房炎癥時，浸潤的白細胞及損傷脫落的上皮細胞會使體細胞數(shù)量明顯增多，因此乳中體細胞計數(shù)（somatic cell count，SCC）是判定乳房健康狀況最直接的方法。國外學者多以2×105cells／mL 為臨界值判定隱性乳房炎［3］，國內(nèi)多以5×105cells／mL 為標準［4］。

目前已知能夠引起奶牛隱性乳房炎的病原菌已超過150種，包括桿菌、球菌、酵母菌、支原體等，其中以葡萄球菌、大腸埃希菌、鏈球菌為主。本試驗選取遼寧阜新地區(qū)具代表性的奶牛養(yǎng)殖場，對190頭泌乳期奶牛進行體細胞檢測，分離并檢測隱性乳房炎大腸埃希菌的藥物敏感性，為該地區(qū)奶牛隱性乳房炎的防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗樣品 2014年8月選取遼寧阜新地區(qū)某規(guī)模化奶牛養(yǎng)殖場臨床表現(xiàn)正常的泌乳期奶牛190頭。

1.1.2 主要試劑 營養(yǎng)肉湯（NB）、MH（B）培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂購于北京奧博星生物技術(shù)有限公司；腸桿菌科生化常規(guī)鑒定管購于杭州天和微生物試劑有限公司。氧氟沙星（99.0%）、頭孢唑啉（99.3%）、頭孢噻呋（87.3%）、恩諾沙星（99.9%）、阿奇霉素（92.2%）、氟苯尼考（99.2%）、甲砜霉素（99.7%）、土 霉 素（88.2%）、環(huán) 丙 沙 星（100%）、慶 大 霉 素（59.0%）、頭孢氨芐（94.2%）、阿莫西林（86.6%）、多西環(huán)素（83.6%）、四環(huán)素（97.0%）藥物標準品、大腸埃希菌ATCC25922購于中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.1.3 主要儀器 Somatos Mini KD－400型奶牛體細胞計數(shù)儀，PYX－600 隔水電熱恒溫培養(yǎng)箱，LDZX－50KBS高壓滅菌鍋，96孔U 型細胞培養(yǎng)板，Themo FIN－1621電動移液器，Eppendorf微量可調(diào)加樣器等。

1.2 方法

1.2.1 乳樣采集 采集樣品前用新潔爾滅對4個乳區(qū)進行消毒，750 mL／L 酒精對乳頭消毒。棄去前3把奶，每個乳區(qū)取樣50mL，存放于滅菌離心管中，封口、標記，于4℃保溫箱保存，并盡快送至實驗室。

1.2.2 SCC測定 將采集的乳樣置于室溫20℃±5℃，經(jīng)4層紗布過濾，攪拌均勻。取10mL 乳樣沿混勻瓶壁加入Somatos Mini KD－400型牛奶體細胞計數(shù)儀。再沿混勻瓶壁加入5 mL 檢測工作液，按“啟動”鍵開始檢測。每個樣品重復3次，取算數(shù)平均數(shù)為該樣品的體細胞測定結(jié)果。

1.2.3 奶牛隱性乳房炎大腸埃希菌的分離鑒定根據(jù)SCC結(jié)果，將隱性乳房炎陽性乳樣涂于經(jīng)無菌檢驗合格的麥康凱培養(yǎng)基中。根據(jù)培養(yǎng)基大小，將1mL～2mL乳樣用三角玻璃棒均勻涂于麥康凱培養(yǎng)基上。正置待其完全吸收后，于37 ℃倒置培養(yǎng)24h。挑取典型紅色金屬光澤圓形單菌落于營養(yǎng)肉湯中擴增，置－20 ℃于300 mL／L 甘油中保存待用。按照腸桿菌科生化常規(guī)鑒定管說明書要求，對初篩的大腸埃希菌進行葡萄糖、賴氨酸、鳥氨酸、硫化氫、蛋白胨、乳糖、衛(wèi)矛醇、苯丙氨酸、尿素、枸櫞酸鈉及氨基酸對照等11項生化反應。根據(jù)過夜培養(yǎng)結(jié)果對其進行編碼，并根據(jù)編碼手冊判定細菌類型。

1.2.4 大腸埃希菌分離株藥物敏感性檢測

1.2.4.1 菌液制備 將保存的菌種以劃線方式接種于麥康凱瓊脂平板培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24h，挑取麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上典型單菌落接種于MH 肉湯中，37 ℃培養(yǎng)至菌液濃度約為1×108CFU／mL。使用時，再用MH 肉湯將其稀釋成1×105CFU／mL的應用菌液。

1.2.4.2 抗菌藥液的制備 精確稱量各藥品并按說明溶解，配制成終濃度為1 280μg／mL 的原藥液，4℃保存?zhèn)溆?。使用時進行二次稀釋，工作液的稀釋范圍大約在0.125μg／mL～128μg／mL。

1.2.4.3 MIC的測定 采用肉湯微量稀釋法測定15種抗菌藥物對大腸埃希菌分離株的MIC，測定方法及判斷標準參照2013年美國臨床和實驗室標準化研究所的標準。每種藥物做2個平行。同時以大腸埃希菌ATCC25922作為質(zhì)控菌。

2 結(jié)果

2.1 奶牛隱性乳房炎檢測結(jié)果

對190頭泌乳期奶牛，760個乳區(qū)的乳樣進行體細胞檢測，以2×105cells／mL 標準進行判定，結(jié)果表明，共有65份乳樣檢測結(jié)果為陽性。隱性乳房炎患病率為34.2%，乳區(qū)陽性率為8.5%。

2.2 大腸埃希菌分離、鑒定結(jié)果

SCC檢測為陽性的乳樣，經(jīng)腸桿菌科生化常規(guī)鑒定管鑒定，共分離得到26株大腸埃希菌。大腸埃希菌的分離率為40%。

2.3 隱性乳房炎大腸埃希菌藥物敏感性試驗結(jié)果

隱性乳房炎大腸埃希菌分離株對甲砜霉素和頭孢氨芐高度耐藥，耐藥率為100%；對其余藥物的耐藥率分別為：氟苯尼考73.1%、土霉素65.4%、頭孢唑啉57.7%、阿莫西林30.8%、四環(huán)素30.8%、恩諾沙星26.9%、阿奇霉素19.2%、氧氟沙星15.4%、多西環(huán)素11.5%、環(huán)丙沙星11.5%；分離菌株對頭孢噻呋和慶大霉素均敏感。14種抗菌藥物對26株隱性乳房炎大腸埃希菌的MIC測定結(jié)果見表1。

表1 14種抗菌藥物對26株奶牛隱性乳房炎大腸埃希菌的MICTable 1 MIC results of 14antibacterial agents against 26 E.coli strains isolated from dairy cows with subclinical mastits

2.4 奶牛隱性乳房炎大腸埃希菌耐藥譜分析

本試驗所用14種抗菌藥物分屬于7類，3種為頭孢菌素類、3種氟喹諾酮類、1種大環(huán)內(nèi)酯類、2種氯霉素類、3種四環(huán)素類、1種氨基糖苷類、1種β－內(nèi)酰胺類。26株隱性乳房炎大腸埃希菌分離株中2株（7.7%）耐2 類 藥，13 株（50%）耐3 類 藥，8 株（30.8%）耐4類藥，3株（11.5%）耐5類藥（表2）。

表2 26株奶牛隱性乳房炎大腸埃希菌耐藥譜Table 2 Drug resistance spectrum of 26 E.coli strains isolated from dairy cows with subclinical mastits

3 討論

奶牛隱性乳房炎無明顯臨床癥狀，發(fā)病率較高，給養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失。報道稱，陜西地區(qū)奶牛隱性乳房炎發(fā)病率為43.3%、內(nèi)蒙古地區(qū)為61.84%、貴陽地區(qū)約為40%、河北地區(qū)為56%、大連地區(qū)為65.63%、山東地區(qū)為69%［4－13］。本試驗對遼寧阜新地區(qū)某規(guī)模化養(yǎng)殖場190頭泌乳期奶牛進行隱性乳房炎檢測，結(jié)果表明，該地區(qū)奶牛隱性乳房炎患病率與國內(nèi)其他地區(qū)相比處于較低水平，乳區(qū)陽性率也低于國內(nèi)其他地區(qū)27.3%～69%［9］的陽性率。

對大腸埃希菌分離株進行藥物敏感性試驗結(jié)果顯示，26株分離株對14種7類抗菌藥物表現(xiàn)出不同程度的耐藥性，對甲砜霉素和頭孢氨芐的耐藥率為100%、氟苯尼考73.1%、土霉素65.4%、頭孢唑啉57.7%、阿莫西林30.8%、四環(huán)素30.8%、恩諾沙星26.9%、阿奇霉素19.2%、氧氟沙星15.4%、多西環(huán)素11.5%、環(huán)丙沙星11.5%，對頭孢噻呋和慶大霉素敏感。多藥耐藥以3重為主（50%），其余依次為4重耐藥、5重耐藥及2重耐藥，比率分別為30.8%，11.5%及7.7%。報道顯示，河北地區(qū)奶牛隱性乳房炎大腸埃希菌對紅霉素、四環(huán)素、慶大霉素、環(huán)丙沙星耐藥［9］；內(nèi)蒙古地區(qū)分離株對環(huán)丙沙星、慶大霉素耐藥［11］。與本試驗結(jié)果比較可發(fā)現(xiàn)，耐藥譜與耐藥率存在地區(qū)性差異，可能與地區(qū)間藥物使用習慣有關。因此，建議遼寧阜新地區(qū)選取慶大霉素、頭孢噻呋治療奶牛隱性乳房炎。

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