張丹俊，戴 銀，沈學懷，趙瑞宏，胡曉苗，侯宏艷，潘孝成，周學利

（安徽省農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，安徽合肥230031）

番鴨細小病毒病是由番鴨細小病毒（Muscovy duck parvovius，MDPV）引起的急性傳染病，主要侵害1周齡～3周齡的雛番鴨［1－2］。該病具有高度的傳染性，其發(fā)病率較高，病死率可達50%～80%；病雛番鴨常表現為喘氣、消瘦、拒食、軟腳和腹瀉等主要臨床癥狀，剖檢可見消化道（尤其是小腸）病變［3－6］。MDPV 屬于細小病毒科、細小病毒屬成員，核酸為單鏈、線性DNA，大小約為5kb?；蚪M有2個主要開放閱讀框架，分別編碼非結構蛋白（NS）和結構蛋 白（VPl、VP2、VP3），其 中 VP3 基 因 全 長1 605nt，編碼534個氨基酸，是病毒的重要保護性抗原蛋白［7］。

目前，我國多地雛番鴨因番鴨細小病毒病大量死亡，該病已是嚴重危害番鴨養(yǎng)殖業(yè)的主要疫病，造成了嚴重的經濟損失［8－11］。近期安徽省部分番鴨群也發(fā)現了類似病癥，且呈現暴發(fā)的趨勢，前期課題組對病毒進行了分離鑒定，確定為番鴨細小病毒病。本研究進一步克隆了番鴨細小病毒的VP3基因，并進行了序列分析，為研究該病的流行發(fā)病趨勢和基因遺傳進化特征，以及制備更有效的細小病毒疫苗奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒 番鴨細小病毒毒株由本實驗室分離鑒定并保存。

1.1.2 菌株和質粒 大腸埃希菌BL21 和載體pMDl8－T 為寶生物工程（大連）有限公司產品。

1.1.3 工 具 酶 和 試 劑 DNA 提 取 試 劑、DNA Marker DL 2 000、T4連接酶等購自寶生物工程（大連）有限公司；dNTP、Taq 酶、瓊脂糖（電泳純）為上海生工生物工程技術服務有限公司產品；DNA 清潔／PCR 產物清潔試劑盒、DNA 凝膠回收試劑盒為杭州維特潔生化技術有限公司產品。

1.2 方法

1.2.1 引物設計 經Oligo 6.0 軟件分析，參照GenBank數據庫中登錄的番鴨細小病毒基因序列（登錄號：KC171936），設計一對特異性擴增引物。P－1：5′－CCGAACCTGTGGCAGCATCTAAAATGGCAGAG－3′，P－2：5′－TGATTGGCTGGTTCGAACGAACGAA－3′。預期目的擴增片段大小為1 733bp，命名為AH－MDPV－VP3。引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。

1.2.2 基因組DNA 的提取 將MDPV 分離株接種13日齡番鴨胚，收集72h后死亡胚胎的尿囊液，將尿囊液經5 000r／min離心10min，取上清，分別加入100g／L的SDS至終濃度為20g／L，再加蛋白酶K 至50μg／mL，充分混勻，37℃水浴2h后，用等量飽和酚抽提1 次，再用等量飽和酚－氯仿抽提2次，用等體積氯仿抽提1次，加入1／10體積3mol／L NaAc（pH 5.2）和2倍體積預冷的無水乙醇，16 000 r／min離心10 min，沉淀病毒核酸，TE（pH 8.0）溶解，置－20℃保存?zhèn)溆茫?2］。

1.2.3 基因的擴增 以提取的基因組DNA 為模板，采用P1 和P2 為上、下游引物，擴增基因AHMDPV－VP3。PCR 反應體系：10×PCR buffer 5.0 μL，dNTP Mixture 3.0μL，上、下游引物各1.0 μL，DNA 2.5μL，Taq DNA 聚合酶0.5μL，加雙蒸水補足60μL。按以下程序進行擴增：94℃5 min；94℃30s，56℃30s，72℃3min，30個循環(huán)；72℃延伸10 min。擴增產物經8g／L 瓊脂糖凝膠電泳檢測，陽性產物送上海生工生物工程技術服務有限公司測序。

1.2.4 基因序列分析 測序后的基因序列在NCBI（http：／／blast.ncbi.nlm.nih.gov／blast.cgi）數據庫中進行相似性比對搜索，選擇番鴨、鴨和鵝細小病毒株共9條參比序列作為分析樣本，登錄號分別為番 鴨 KC171936 和 KM093740，鵝 KC478066、KC996730、KC184133、FJ240170 和KP053633，鴨AY382891和AY382892。使用Clustal X 1.83 軟件比對序列，采用DNAStar、MegAlign等軟件分析各序列特征。

2 結果

2.1 基因組DNA 的提取

所提取的兩個樣品基因組DNA 在2 000bp上方均有明顯的DNA 條帶（圖1），雖然部分條帶有輕微降解拖尾現象，但由于PCR 的高敏感性，該模板能夠滿足后續(xù)實驗的要求。

2.2 番鴨AH－MDPV－VP3基因的擴增

以提取的基因組DNA 為模板，P1和P2為引物PCR 擴增獲得了一條約1 700bp 大小的特異性DNA 片段（圖2），將擴增的基因產物純化、測序。結果與GenBank中登錄的相應基因序列進行比對。

2.3 同源性分析

測 序 結 果 表 明，AH－MDPV－VP3 基 因 全 長1 733bp，包含完整MDPV VP3蛋白閱讀框，1 605 bp編碼534個氨基酸。將AH－MDPV－VP3與其他在GenBank數據庫獲得的番鴨、鵝和鴨的相應VP3基因氨基酸序列進行同源性比較（圖3）。結果表明，10條基因序列的同源性介于89.3%～100%之間；AH－MDPV－VP3與兩個番鴨基因KC171936和KM093740序列同源性分別為100%和98.3%；與鵝細小病毒同源性均相對較低，介于96.1%～96.4%之間；而與臺灣分離的鴨細小病毒基因AY382891和AY382892 同源性分別為91.6%和90.8%。同時可見，鵝細小病毒毒株間同源性均大于98.9%，兩個鴨細小病毒毒株同源性為99.1%，說明各物種VP3基因較為保守。

圖1 基因組DNA 電泳圖Fig.1 Electrophoresis of genome DNA

圖2 AH－MDPV－VP3基因的PCR 擴增Fig.2 PCR amplification of AH－MDPV－VP3gene

2.4 序列進化分析

采用MEGA 分析軟件，將獲得的10條番鴨、鵝和鴨的細小病毒VP3氨基酸序列構建系統發(fā)育樹（圖4）。結果可見，所比對序列分為番鴨、鵝和鴨細小病毒3 個類群。AH－MDPV－VP3與國內兩個番鴨細小病毒基因KC171936和KM093740聚集為一組，進一步證實三者親緣關系較近，來源于共同祖先；而與5個鵝細小病毒和2個臺灣分離的鴨細小病毒分離株VP3基因遺傳距離則相對較遠。

圖3 VP3氨基酸序列同源性比對（%）Fig.3 The homology alignment of VP3amino acid sequences（%）

圖4 VP3氨基酸序列系統發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of VP3amino acid sequences

3 討論

近年來，隨著番鴨養(yǎng)殖業(yè)的規(guī)?；l(fā)展，出現了許多新的疫病和重新流行的疫病，番鴨細小病毒已經成為危害世界番鴨養(yǎng)殖業(yè)較為嚴重的病毒之一［13］。本研究克隆了番鴨細小病毒結構蛋白的VP3基因，該基因包含全長1 605bp的完整蛋白閱讀框，編碼534個氨基酸。氨基酸序列同源性和進化分析表明，AH－MDPV－VP3與國內兩個番鴨細小病毒基因同源性較高，來源于共同祖先；而與鵝細小病毒，尤其與臺灣分離的鴨細小病毒同源性相對較低，遺傳距離也相對較遠；同時可見番鴨、鵝和鴨細小病毒的VP3基因各自均較為保守，僅有少數氨基酸發(fā)生變異。此外，多個研究也表明不同來源的鵝細小病毒株VP3基因核苷酸和氨基酸序列的同源性均較高，顯示鵝VP3基因較為保守［14－16］。

鵝細小病毒是小鵝瘟這一烈性傳染病的病原，鵝細小病毒既能感染鵝又可以感染番鴨，同樣是危害極為嚴重的疫病之一。鵝細小病毒與番鴨細小病毒的病毒形態(tài)結構、基因組、病理變化和臨床癥狀等方面較為相似，在實際生產中小鵝瘟雛鵝活疫苗和抗血清也能夠提高雛番鴨對番鴨細小病毒的抵抗能力［12，17－19］。本研究也發(fā)現番鴨細小病毒與鵝細小病毒VP3基因同源性相對較低，但也均大于94.9%，說明兩者的相似性較高。盡管鵝細小病毒與番鴨細小病毒有很多相似的特點，但感染的寄主卻有不同，兩者在抗原特征上存在較大差異，且不同分離株致病性也存在差異，因此研究其相關抗原基因的變異對于疫苗株的篩選有著極其重要意義。研究表明利用鵝細小病毒VP3基因制備的亞單位疫苗能夠誘導鵝產生鵝細小病毒抗體，使新生雛鵝獲得良好的免疫保護［20］。VP3是病毒的主要衣殼蛋白，約占總蛋白含量的80%，內含有主要抗原決定簇成分，且暴露于病毒粒子表面，是病毒刺激機體產生中和抗體的主要抗原蛋白［17，21］。所以該基因在細小病毒的免疫診斷及免疫防控中無疑具有不可替代的作用［21］。本研究克隆了番鴨細小病毒的VP3 基因，并分析其分子結構特征，可為深入研究番鴨細小病毒遺傳學特點，以及獲得更有效的預防控制方法奠定了基礎。

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