孫 霞，胡士林

（山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院，山東濰坊261061）

自從國(guó)內(nèi)首次從患肺炎的犢牛肺臟中分離到牛支原體以來［1］，我國(guó)已有湖北、湖南、貴州、安徽、新疆、吉林、江西等10多個(gè)省報(bào)道了牛場(chǎng)有牛支原體感染，目前，國(guó)內(nèi)外還沒有很好的防控方法，又因?yàn)榭咕幬锏膹V泛使用，逐漸出現(xiàn)了耐藥菌株［2－4］，牛支原體（Mycoplasma bovis）作為感染牛的重要病原微生物之一，如果與其他多種病原混合感染則引起病情加劇，病死率會(huì)急劇上升，給肉牛和奶牛養(yǎng)殖業(yè)均會(huì)造成較大的經(jīng)濟(jì)損失［5］。

2014年5月，對(duì)濰坊地區(qū)發(fā)生肺炎的肉牛場(chǎng)進(jìn)行了牛支原體的分離，成功得到菌株，并進(jìn)行了鑒定，證實(shí)為牛支原體。為了解濰坊及周邊地區(qū)健康牛場(chǎng)牛支原體的自然感染情況和臨床發(fā)生呼吸道癥狀特別是有肺炎癥狀牛的牛支原體感染率，采集了14個(gè)牛場(chǎng)的188份健康牛血清和10個(gè)發(fā)病牛場(chǎng)39份發(fā)生呼吸道癥狀牛的肺及鼻腔深部分泌物，通過間接ELISA 和套式PCR 方法對(duì)采集到的樣品進(jìn)行了檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 牛支原體間接ELISA 試劑盒購(gòu)自比利時(shí)Bio－X 公司；牛支原體陽性對(duì)照菌株來自中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心；用于提取病料中牛支原體DNA 的試劑盒與PCR 檢測(cè)的試劑耗材等均購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；PCR 引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。

1.1.2 檢測(cè)樣品來源 所用血清樣品188份均來自健康奶牛和肉牛，是2014年4月～2015年4月從濰坊地區(qū)及周邊地區(qū)的肉牛場(chǎng)和奶牛場(chǎng)采集獲得，其中奶牛場(chǎng)血清樣品100 份，肉牛場(chǎng)血清樣品88份；PCR 檢測(cè)所用發(fā)病牛病料39份，其中5份為發(fā)生肺炎或發(fā)生肺炎后死亡牛的肺臟，34份為有呼吸道臨床癥狀牛的鼻腔深部分泌物。上述牛場(chǎng)的牛均未接種牛支原體疫苗。

1.1.3 試驗(yàn)用牛支原體陽性對(duì)照菌株 來自中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心。

1.2 方法

1.2.1 間接ELISA 檢測(cè) 按照比利時(shí)Bio－X 公司生產(chǎn)的牛間接ELISA 試劑盒說明書進(jìn)行嚴(yán)格操作。

1.2.2 病料的處理與牛支原體的培養(yǎng) 無菌采取少量病變明顯部位的肺組織或取少量的鼻腔深部分泌物，加適量PPLO 液體培養(yǎng)基進(jìn)行勻漿，500 r／min離心10min，取上清液，通過0.45μm 孔徑的濾器過濾，后置于37℃、體積分?jǐn)?shù)為10%的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)72h，后進(jìn)行一次傳代，繼續(xù)培養(yǎng)，每天觀察培養(yǎng)基顏色的改變，將顏色變黃但液體清亮不渾濁的培養(yǎng)物離心，將沉淀用于牛支原體核酸的提取。

1.2.3 引物 選擇牛支原體oppD／F 基因設(shè)計(jì)2對(duì)套式PCR 特異性引物。M.bovis P1、M.bovis P2為外圍引物對(duì)，外圍目的片段長(zhǎng)度為1 912bp；M.bovis P3、M.bovis P4為內(nèi)部引物對(duì)，內(nèi)部目的片段長(zhǎng)度為549bp。引物序列為M.bovis P1：TTTTAGCTCTTTTTGAACAAAT；M.bovis P2：GGCTCTCATTAAGAATGTC；M.bovis P3：TTTCGCATAACATTAGTGTTGTCGC。

1.2.4 模板的制備 利用SDS蛋白酶K 法提取培養(yǎng)物中的牛支原體基因組DNA 作為套式PCR 檢測(cè)用的模板。

1.2.5 套式PCR 檢測(cè) 以提取到的牛支原體培養(yǎng)物基因組DNA 作為模板，利用天根生化科技（北京）有限公司的2×Taq PCR Master Mix 和引物M.bovis P1及M.bovis P2進(jìn)行第一輪PCR 擴(kuò)增，循環(huán)參數(shù)為：94℃5min；94℃30s，48℃30s，72℃120s，30個(gè)循環(huán)；72℃7min。以第一輪PCR 產(chǎn)物為模板，利用2×Taq PCR Master Mix和引物M.bovis P3及M.bovis P4進(jìn)行第二輪PCR 擴(kuò)增，循環(huán)參數(shù)為：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，32個(gè)循環(huán)；72℃7min。瓊脂糖凝膠電泳后，通過凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行結(jié)果觀察。

1.2.6 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物序列測(cè)定及比對(duì) 利用天根生化科技（北京）有限公司的DNA 回收試劑盒進(jìn)行目的片段的回收，將其與T 載體連接并轉(zhuǎn)化后，通過菌液PCR 挑選陽性克隆，然后將篩選出的陽性克隆擴(kuò)大培養(yǎng)后送去測(cè)序，測(cè)序完成后利用GenBank進(jìn)行比對(duì)。

2 結(jié)果

2.1 不同牛場(chǎng)血清樣品的抗體檢測(cè)結(jié)果

14個(gè)牛場(chǎng)中有9 個(gè)出現(xiàn)了牛支原體抗體陽性的牛，牛場(chǎng)群感染率為64.29%（9／14）；平均個(gè)體感染率為5.85%（11／188），其中奶牛的個(gè)體感染率為6%（6／100），肉牛的個(gè)體感染率為5.68%（5／88）。

2.2 發(fā)病牛病料PCR 檢測(cè)結(jié)果

套式PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)10g／L 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，陽性樣品均出現(xiàn)了預(yù)期分子質(zhì)量大小的目的條帶，即第1輪目的片段的分子質(zhì)量為1 912bp，第2輪的為549bp（圖1）。采集病料的10個(gè)發(fā)病牛場(chǎng)有8個(gè)出現(xiàn)了支原體PCR 檢測(cè)結(jié)果陽性的牛，牛場(chǎng)群感染率為80%（8／10）；39份病料樣品中有19份的PCR 結(jié)果為陽性，個(gè)體感染率為46.15%（19／38）。

2.3 測(cè)序后經(jīng)GenBank比對(duì)結(jié)果

將測(cè)序結(jié)果與GenBank 中的牛支原體序列進(jìn)行比對(duì)后，證實(shí)PCR 擴(kuò)增的目的片段與Hubei－1株的堿基完全相同，同源率為100%；與PG45 株有8個(gè)堿基不同，同源性為99%。

圖1 病料中牛支原體套式PCR 擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Identification of Mycoplasma bovis from samples by nested PCR

3 討論

間接ELISA 結(jié)果顯示，濰坊及周邊地區(qū)健康牛群牛支原體場(chǎng)群感染率較高，達(dá)到了64.29%，這與其他省報(bào)道的結(jié)果吻合，說明在濰坊及周邊的牛場(chǎng)中普遍存在牛支原體的感染，應(yīng)該引起畜牧獸醫(yī)部門和養(yǎng)殖戶的高度重視。但健康牛群的平均個(gè)體感染率為5.85%，在較低的水平，而且奶牛和肉牛的個(gè)體感染率相差不大，此結(jié)果與文獻(xiàn)中報(bào)道的差別較大［6－8］，經(jīng)調(diào)查后發(fā)現(xiàn)，采集血清樣品的健康牛群都是自繁自養(yǎng)，基本不從外地經(jīng)長(zhǎng)途運(yùn)輸?shù)姆绞揭M(jìn)新的牛只，即使需要從其他牛場(chǎng)引進(jìn)時(shí)，也都經(jīng)過嚴(yán)格的檢疫和適當(dāng)時(shí)間的隔離后才進(jìn)行混群飼養(yǎng)，這樣就很大程度上避免了外來牛對(duì)健康牛群造成感染。

從此次采集到的病料PCR 結(jié)果可以看出，發(fā)病牛場(chǎng)牛支原體的場(chǎng)群感染率和個(gè)體感染率均較高，分別達(dá)到了80%和46.15%，說明在出現(xiàn)呼吸道癥狀特別是肺炎表現(xiàn)的牛場(chǎng)中，支原體是造成牛呼吸道類疾病的重要病原之一，但發(fā)生此狀況的主要原因是牛場(chǎng)的飼養(yǎng)管理水平低下，在受到應(yīng)激的情況下，牛機(jī)體的抵抗力下降，引起牛支原體、細(xì)菌、病毒等多種病原混合或繼發(fā)感染，導(dǎo)致牛的生產(chǎn)性能下降，病死率明顯上升，造成了很大的經(jīng)濟(jì)損失。

牛支原體在環(huán)境中的抵抗力雖然不強(qiáng)，但主要的傳播途徑是水平傳播和垂直傳播，特別是垂直傳播時(shí)，有些牛在母體的子宮內(nèi)就已經(jīng)被感染［9］，鑒于牛支原體的上述特點(diǎn)和目前用于預(yù)防的疫苗在研發(fā)階段［10－12］及致病機(jī)理［13］仍需深入研究的情況，在養(yǎng)殖的過程中要注意綜合防控措施的應(yīng)用，在平時(shí)的飼養(yǎng)管理中，給牛提供舒適的生活環(huán)境，可口且營(yíng)養(yǎng)全面的飼料，提高牛自身的抵抗力，如采取下面的措施：保持牛舍的溫度和濕度適宜，通風(fēng)好，不同年齡的牛分舍飼養(yǎng)，防止過度擁擠，定期對(duì)牛舍進(jìn)行消毒，及時(shí)清理牛的排泄物，堅(jiān)持自繁自養(yǎng)，確實(shí)需要從外邊引進(jìn)牛時(shí)，在引進(jìn)前對(duì)牛進(jìn)行支原體抗體的檢測(cè)，杜絕抗體陽性牛的引入，引入后的牛進(jìn)行至少20d的隔離，安全度過牛支原體的潛伏期，確保牛健康后再與其他的健康牛合群飼養(yǎng)。育肥牛采用全進(jìn)全出制度，在每批牛出欄后進(jìn)行徹底的衛(wèi)生清理和嚴(yán)格全面的消毒。一旦出現(xiàn)可疑病例，要早發(fā)現(xiàn)早處理，防止牛支原體病在牛群中大范圍的傳播和造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

［1］ 辛九慶，李 媛，郭 丹，等.國(guó)內(nèi)首次從患肺炎的犢牛肺臟中分離到牛支原體［J］.中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2008，30（9）：661－664.

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