方月琴,朱少暉,湯俊梅,陸豪杰
(江蘇蘇州健雄職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物與化學(xué)工程系,江蘇蘇州215411)
誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells,iPS細(xì)胞)技術(shù)是通過(guò)外源性導(dǎo)入特定的轉(zhuǎn)錄因子,將已分化的細(xì)胞重編程回歸到胚胎細(xì)胞狀態(tài)。Takahashi K 等[1]通過(guò)大量試驗(yàn),在多種轉(zhuǎn)錄因子中 篩 選 得 出Sox2、Klf4、Oct4 和c-Myc(簡(jiǎn) 稱SKOM)這4種轉(zhuǎn)錄因子,成功將小鼠皮膚成纖維細(xì)胞重編程回到類似胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cell,ES細(xì)胞)的一種細(xì)胞類型,稱為iPS細(xì)胞。iPS細(xì)胞具有自我更新能力和分化潛能,其功能與ES細(xì)胞類似,因此無(wú)需制造胚胎,理論上從任何組織的成體細(xì)胞都可制造出具有干細(xì)胞功能的細(xì)胞,在科研工作中避免了胚胎研究所面臨的倫理學(xué)問(wèn)題,成為生命科學(xué)領(lǐng)域的一次巨大革命[2]。經(jīng)過(guò)多年的快速發(fā)展,iPS細(xì)胞技術(shù)在各個(gè)相關(guān)領(lǐng)域都取得了重大進(jìn)展,本文將從iPS細(xì)胞技術(shù)制備動(dòng)物細(xì)胞系和動(dòng)物個(gè)體兩方面,關(guān)注該技術(shù)的研究進(jìn)展。
1.1.1 小鼠 Takahashi K 等[1]利用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pMXs攜帶SKOM 4種轉(zhuǎn)錄因子,通過(guò)PLATE細(xì)胞制備高滴度病毒顆粒,感染小鼠皮膚成纖維細(xì)胞,經(jīng)過(guò)3 周左右的培養(yǎng)出現(xiàn)擁有正常核型、與ES細(xì)胞有同樣細(xì)胞表面標(biāo)記,且具有能夠向3個(gè)胚層發(fā)育潛能的iPS細(xì)胞。這項(xiàng)技術(shù)引起了科學(xué)界的轟動(dòng),引發(fā)熱議[2]。然而利用病毒載體為媒介進(jìn)行感染雖然具有高效穩(wěn)定表達(dá)、較高的轉(zhuǎn)化效率等優(yōu)點(diǎn),但是逆轉(zhuǎn)錄病毒會(huì)插入靶細(xì)胞基因組中,增加了外源性基因的導(dǎo)入機(jī)會(huì),甚至激活原宿主染色體上的癌基因,可能會(huì)在后續(xù)的長(zhǎng)期試驗(yàn)中出現(xiàn)不可預(yù)知的現(xiàn)象[3]。鑒于此,很多科研團(tuán)隊(duì)開(kāi)始尋求無(wú)病毒的基因?qū)敕椒āW钤缰苽錈o(wú)病毒小鼠iPS細(xì)胞的是Okita K 團(tuán) 隊(duì)[4],在 小 鼠 胚 胎 成 纖 維 細(xì) 胞(mouse embryonic fibroblast cells,MEF)中轉(zhuǎn)染2種質(zhì)粒,其中一種攜帶Oct3/4、Sox2 和Klf4 的cDNA 序列,另一種攜帶c-Myc的cDNA 序列。所獲得的iPS細(xì)胞移植到免疫缺陷小鼠體內(nèi)長(zhǎng)出三胚層畸胎瘤,表明了iPS細(xì)胞的多能性。但是與病毒感染方法相比,該方法iPS細(xì)胞生成效率降低約100倍(經(jīng)典病毒感染獲得iPS 效率為0.1%左右[1])。為提高試驗(yàn)成功率與工作效率,Keisuke K 等[5]采用一個(gè)載體同時(shí)表達(dá)SKOM 基因,并與piggyBac轉(zhuǎn)座子基因介導(dǎo)相結(jié)合,高效制備了無(wú)病毒小鼠iPS細(xì)胞;獲得iPS細(xì)胞后,又成功將先前導(dǎo)入的轉(zhuǎn)錄因子基因從iPS細(xì)胞中移除。這一過(guò)程就保證了所獲得的iPS細(xì)胞基因組與初始細(xì)胞是完全一致的。同時(shí),平均轉(zhuǎn)化效率達(dá)2.5%,相比經(jīng)典方法提高了25倍。此外,小分子化合物的發(fā)現(xiàn)與引入大大提高了iPS細(xì)胞的制備效率,還能在制備過(guò)程中避免引入遺傳物質(zhì),提高iPS細(xì)胞的安全性[6]。
作為最常用的模式動(dòng)物,小鼠被選作iPS 細(xì)胞系建立的第一種動(dòng)物,并在之后iPS細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展里程碑中功不可沒(méi)。經(jīng)過(guò)將近10年的發(fā)展,iPS細(xì)胞技術(shù)取得了長(zhǎng)足的發(fā)展,為應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)、動(dòng)物學(xué)等領(lǐng)域的研究奠定了堅(jiān)實(shí)的科研基礎(chǔ)。
1.1.2 大鼠 小鼠和人iPS細(xì)胞早在2006年就已獲得,Li W 等[7]在重編程過(guò)程中引入化學(xué)因子,大鼠iPS細(xì)胞系才真正建立。該小組通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體將4種因子轉(zhuǎn)染入大鼠肝上皮細(xì)胞,在MEF飼養(yǎng)層細(xì)胞上,利用傳統(tǒng)的小鼠ES 細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)10d后,能夠獲得堿性磷酸酶陽(yáng)性、類似小鼠ES細(xì)胞的克隆,傳代后細(xì)胞迅速分化,失去ES 細(xì)胞形態(tài),說(shuō)明傳統(tǒng)的小鼠ES 細(xì)胞培養(yǎng)條件可能不足以維持大鼠iPS細(xì)胞的多能狀態(tài)。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在ES細(xì)胞培養(yǎng)基中添加一些試驗(yàn)證明可抑制分化、支持ES細(xì)胞自我更新的小分子物質(zhì),包括PD0325901,CHIR99021和A-83-01,可獲得大鼠iPS細(xì)胞;并經(jīng)試驗(yàn)證明具有向3個(gè)胚層分化的潛能。
隨后其他研究團(tuán)隊(duì)也成功獲得了大鼠iPS 細(xì)胞[8]。相對(duì)于小鼠,大鼠更適合于生理學(xué)和行為學(xué)的研究,因此大鼠iPS細(xì)胞系的建立為這些方向的研究擴(kuò)大了科研基礎(chǔ),并為其他嚙齒類動(dòng)物提供了試驗(yàn)對(duì)照與參考。
繼小鼠iPS細(xì)胞系的成功建立,鄧宏魁教授實(shí)驗(yàn)室于2008 年率先報(bào)道建立了恒河猴iPS 細(xì)胞系[9]。首先利用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pMX 攜帶4種轉(zhuǎn)錄因子,制備病毒懸液;將病毒懸液濃縮30倍,感染成年雄性恒河猴的耳部皮膚來(lái)源成纖維細(xì)胞,6d后成纖維細(xì)胞出現(xiàn)初步的形態(tài)改變,再將其轉(zhuǎn)移至MEF細(xì)胞上,并將培養(yǎng)液改為ES 細(xì)胞培養(yǎng)基,經(jīng)26d~29d后出現(xiàn)ES細(xì)胞樣克隆。經(jīng)分子與蛋白水平檢測(cè),該iPS細(xì)胞與猴ES細(xì)胞具有同樣的基因表達(dá),并在體內(nèi)、體外試驗(yàn)中表現(xiàn)出向3個(gè)胚層分化的潛能。狨猴[10]、黑猩猩[11]等靈長(zhǎng)類動(dòng)物都建立了相應(yīng)的iPS 細(xì)胞系。作為與人類最接近的模式動(dòng)物,大部分人類疾病可建立恒河猴疾病模型;而靈長(zhǎng)類動(dòng)物iPS細(xì)胞的成功制備,對(duì)于人類疾病的發(fā)生機(jī)理與治療研究具有深遠(yuǎn)的意義,并可作為人類進(jìn)化研究的工具[12];同時(shí)對(duì)于其他珍稀物種,如金絲猴的保護(hù)也提供了新思路。
迄今為止,已獲得小鼠、大鼠、猴和人類4種ES細(xì)胞系;而所有有蹄類家畜的ES細(xì)胞系尚未建立。但是家畜,如豬的體型和器官與人類相似,可作為研究人類疾病的良好模型及器官移植的來(lái)源,因此建立家畜ES細(xì)胞或iPS細(xì)胞系有重要的應(yīng)用價(jià)值。
Wu Z等[13]完成了豬iPS細(xì)胞系的建立。該小組首先采用攜帶4種轉(zhuǎn)錄因子的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體制備相應(yīng)的病毒感染豬成體細(xì)胞,但是以失敗告終。之后采用慢病毒方法,選擇一含多西環(huán)素藥物誘導(dǎo)基因的慢病毒載體,并在載體中克隆入6種轉(zhuǎn)錄因子(SKOM,Nanog 和Lin28),在多西環(huán)素存在時(shí),這6種基因得以表達(dá)。收集表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子的慢病毒載體感染丹麥長(zhǎng)白豬耳朵成纖維細(xì)胞或骨髓細(xì)胞,2 d后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至MEF,3d 時(shí)換成ES 細(xì)胞培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染7d后開(kāi)始出現(xiàn)類似人ES細(xì)胞;13d克隆變大,并有明顯邊界。試驗(yàn)表明,豬iPS 細(xì)胞與人ES細(xì)胞有相似的形態(tài)與表達(dá)標(biāo)記。與此同時(shí),Esteban M A 等[14]建立了西藏小型豬的iPS細(xì)胞系,試驗(yàn)采用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體攜帶4種人或小鼠的轉(zhuǎn)錄因子,感染豬胚胎成纖維細(xì)胞8d~10d后,均出現(xiàn)類似人ES細(xì)胞克隆。與其他報(bào)道不同的是,培養(yǎng)細(xì)胞溫度設(shè)置為39 ℃,即豬的生理體溫,這可能影響iPS細(xì)胞生成效率。相比于其他動(dòng)物來(lái)源iPS細(xì)胞,豬iPS細(xì)胞具有正常核型,表達(dá)高水平的ES細(xì)胞標(biāo)記,可分化成含3個(gè)胚層的畸胎瘤,可以說(shuō)更接近于人ES細(xì)胞的特點(diǎn)。迄今為止,已有多個(gè)團(tuán)隊(duì)成功獲得豬iPS細(xì)胞[15]。此后,研究者相繼制備了馬[16]、牛[17]等的iPS細(xì)胞。而北非白犀牛iPS細(xì)胞系的建立[18],也為瀕臨滅絕珍稀動(dòng)物的保存和生物多樣性的保護(hù)提供了新方法。除以上動(dòng)物,雞[19]、蝙蝠[20]等的iPS細(xì)胞也已建立,說(shuō)明該技術(shù)可廣泛適用于多種物種,為其他動(dòng)物iPS細(xì)胞建系提供了借鑒,并為珍稀動(dòng)物物種保護(hù),以及當(dāng)前非常困難的轉(zhuǎn)基因大動(dòng)物模型的建立,提供了寶貴的實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)與科研新思路。然而,雖然早在2007 年已證實(shí)iPS細(xì)胞能夠嵌合到生殖嵴[21],說(shuō)明其具有一定的多能性,但是iPS細(xì)胞一直未能通過(guò)四倍體補(bǔ)償試驗(yàn),即鑒定多能性細(xì)胞發(fā)育能力的黃金標(biāo)準(zhǔn)[22]。因此,如何將成功建立的動(dòng)物iPS細(xì)胞系轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的動(dòng)物個(gè)體,是一項(xiàng)更為復(fù)雜的挑戰(zhàn)。迄今iPS細(xì)胞來(lái)源的小鼠、大鼠和豬已制備成功。
iPS細(xì)胞與ES細(xì)胞一樣具有自我更新和分化能力,并規(guī)避了轉(zhuǎn)基因所面臨的倫理學(xué)問(wèn)題;此外,在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究中,將iPS細(xì)胞技術(shù)與動(dòng)物轉(zhuǎn)基因技術(shù)相結(jié)合,可大大簡(jiǎn)化轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的制備過(guò)程。比如,作為轉(zhuǎn)基因的靶細(xì)胞,通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)將外源基因?qū)雐PS細(xì)胞;或是利用iPS 細(xì)胞作為核供體細(xì)胞,同適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞融合后直接獲得轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。也可以針對(duì)iPS細(xì)胞進(jìn)行基因打靶或基因敲除等遺傳修飾,從而根據(jù)人的意愿實(shí)現(xiàn)iPS細(xì)胞內(nèi)基因改造,然后將其注入囊胚腔獲得嵌合體后代,以高效、定向地制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。目前利用iPS細(xì)胞獲得成體小鼠、大鼠和豬即是通過(guò)這些方法。
Zhao X Y 等[23-24]報(bào) 道 獲 得 了iPS 細(xì) 胞 來(lái) 源 的成體小鼠,這是世界上首例完全由iPS細(xì)胞制備的活體小鼠,證實(shí)了完全重編程的iPS細(xì)胞具有與ES細(xì)胞同樣的發(fā)育全能性。iPS細(xì)胞來(lái)源成體小鼠制備過(guò)程分為兩個(gè)階段。第一階段是制備小鼠iPS細(xì)胞。Zhao X Y 等[23]在制備iPS細(xì)胞過(guò)程中,首先通過(guò)2次感染提高感染效率,并在之后的培養(yǎng)液中利用Knockout血清替代物(Knockout serum replacement,KOSR)取代FBS以提高小鼠胚胎的建系效率及加速iPS細(xì)胞形成進(jìn)程,并分別在第14天、第20天和第36天提取克隆。經(jīng)分析,所獲得的iPS細(xì)胞能夠表達(dá)多能性標(biāo)記,如Oct4、Nanog及SSEA1,具有正常的染色體核型;將iPS細(xì)胞注射入裸鼠后對(duì)產(chǎn)生的畸胎瘤進(jìn)行組織學(xué)檢測(cè),發(fā)現(xiàn)能夠產(chǎn)生完整的3個(gè)胚層。之后是第二階段,利用四倍體補(bǔ)償試驗(yàn)培育小鼠。先將選中的iPS細(xì)胞注射到小鼠四倍體囊胚,觀察胚胎發(fā)育到期情況,最終第14天挑取的iPS細(xì)胞獲得了37只到期小鼠;而第20天和第36天挑取的iPS細(xì)胞很難獲得小鼠。該試驗(yàn)所獲得的iPS細(xì)胞四倍體補(bǔ)償小鼠已經(jīng)通過(guò)繁殖獲得了上百只子代及第3代,并存活超過(guò)57周。以上試驗(yàn)證明iPS細(xì)胞可被完全重編程,能夠分化為軀體的各種組織細(xì)胞,具有與ES細(xì)胞同樣的全能性,為iPS細(xì)胞技術(shù)的應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。
另一方面,重編程過(guò)程中原癌基因c 大腸桿Myc因子的存在會(huì)很大程度上增加iPS細(xì)胞嵌合小鼠腫瘤發(fā)生幾率。研究發(fā)現(xiàn),可只引進(jìn)Oct4、Sox2和Klf4 制備iPS 細(xì)胞,只是其生成效率會(huì)有所降低[25]。為驗(yàn)證三因子iPS 細(xì)胞是否同樣具有全能性,Kang L 等[26]制備了小鼠三因子iPS細(xì)胞,之后利用四倍體補(bǔ)償方式也獲得了活體小鼠,從而證實(shí)不存在c-Myc因子的情況下所獲得的iPS細(xì)胞仍具有同樣的分化潛能,為iPS細(xì)胞技術(shù)的安全應(yīng)用進(jìn)一步奠定了基礎(chǔ)。
Li W 等[7]報(bào)道建立大鼠iPS細(xì)胞系時(shí),就已獲得大鼠iPS細(xì)胞來(lái)源的嵌合體大鼠,但尚未檢測(cè)出其生殖能力。之后,Hamanaka S 等[27]通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo),在Wistar(WI)大鼠和DA 大鼠胚胎成纖維胞內(nèi)導(dǎo)入3種小鼠轉(zhuǎn)錄因子(Oct3/4,Klf4和Sox2),轉(zhuǎn)染1d后在培養(yǎng)基中加入大鼠白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF),第7天在培養(yǎng)基中加入小分子物質(zhì)(PD0325901,CHIR99021或SU5402),第10天時(shí)可出現(xiàn)類似ES細(xì)胞的大鼠iPS細(xì)胞克隆,并已傳代超過(guò)25代。之后將其注入WI/WI大鼠囊胚中,最終WI來(lái)源iPS細(xì)胞獲得了具有遺傳性能的嵌合體大鼠(圖1),圖1中riPS為大鼠iPS細(xì)胞;Microinjection 為顯微注射;WI×WI rat blastocytes為WI大鼠和WI大鼠囊胚;Transfer為移植;Foster mother為代孕媽媽;Chimeric rat為嵌合體大鼠;male為雄性;wt-female WI rat為野生型的 雌 性WI 大 鼠;Transgenic rats from germline transmission為通過(guò)生殖系遺傳獲得的轉(zhuǎn)基因大鼠。Jiang M G 等[28]在iPS細(xì)胞制備過(guò)程中除LIF和小分子物質(zhì)之外,還加入Vc和KOSR 以提高iPS細(xì)胞生成效率,并將大鼠品系擴(kuò)展到DA,SD 和F344大鼠,也獲得了大鼠iPS細(xì)胞及具有遺傳能力的iPS細(xì)胞來(lái)源轉(zhuǎn)基因大鼠。
除了iPS細(xì)胞來(lái)源大鼠和小鼠之外,大鼠-小鼠種間嵌合體也成功獲得,比如將大鼠iPS細(xì)胞注入小鼠囊胚內(nèi),在小鼠體內(nèi)長(zhǎng)出大鼠胰腺組織[29]。這可應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué),如在豬等動(dòng)物體內(nèi)生長(zhǎng)目的器官,之后再移植給患者,為器官移植提供了選擇;還標(biāo)志著將iPS細(xì)胞技術(shù)與轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)相結(jié)合,打破物種界限,克服種間繁殖障礙,從而獲得用傳統(tǒng)方法無(wú)法得到的新性狀,為新品種培育等轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究提供了試驗(yàn)基礎(chǔ)。
繼iPS細(xì)胞來(lái)源小鼠、大鼠的成功獲得,科學(xué)家將目光轉(zhuǎn)移至iPS克隆豬,因?yàn)樨i的解剖、生理與遺傳等方面與人具有高度的相似性。Fan N N 等[30]獲得了iPS細(xì)胞來(lái)源小豬,分別用慢病毒轉(zhuǎn)染和逆轉(zhuǎn)錄病毒方法轉(zhuǎn)染10周大小丹麥長(zhǎng)白豬的耳皮膚成纖維細(xì)胞和骨髓細(xì)胞,以及豬胚胎成纖維細(xì)胞,制備了6株iPS細(xì)胞株。直接將這些iPS細(xì)胞株作為核移植的供體細(xì)胞,利用傳統(tǒng)的克隆方法或者手工克隆方法,克隆至代孕母豬體內(nèi),雖有部分母豬得以懷孕,但是最終都未能成功分娩得到活小豬。分析原因可能是這些外來(lái)轉(zhuǎn)錄因子未能得以沉默,阻礙了胚胎的順利發(fā)育。研究人員采用了兩種方法,將iPS細(xì)胞分化4d~6d,使細(xì)胞退出快速的細(xì)胞周期,再作為核轉(zhuǎn)移的供體細(xì)胞;將核轉(zhuǎn)移細(xì)胞處以0.5mmol/L濃度Scriptaid,這是一種人工合成低毒性的組蛋白去乙?;敢种苿?,可提高克隆胚胎的發(fā)育能力。經(jīng)過(guò)以上兩種處理,發(fā)現(xiàn)核移植后體外發(fā)育囊胚率由原來(lái)的5%提高到20%左右。隨后經(jīng)分化處理的細(xì)胞利用傳統(tǒng)的克隆方法轉(zhuǎn)移至代孕母豬體內(nèi),經(jīng)114d懷孕獲得1頭小豬;而經(jīng)Scriptaid處理的細(xì)胞,利用手工克隆方法轉(zhuǎn)移,經(jīng)110d懷孕得到4頭小豬。但是這些小豬出生后生存時(shí)間均較短,前者出生后36d被發(fā)現(xiàn)患腦脊髓炎而死亡;經(jīng)Scriptaid處理得到的4頭小豬,其中1頭剛出生即死亡,另3頭分別僅存活了4、14、36d(圖2),圖2中piPS為豬誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞,TC 為傳統(tǒng)克隆法,HMC為手工克隆法,Surrogated mother為代孕母豬。大量研究表明核移植過(guò)程中可能存在一些因素會(huì)造成克隆動(dòng)物的死亡,由此揭示要獲得健康的iPS克隆豬要求更優(yōu)化的核移植操作,以及在代孕母體內(nèi)移植更多數(shù)量的胚胎。通過(guò)iPS細(xì)胞技術(shù)獲得健康克隆豬還有很長(zhǎng)的路要走。
圖1 iPS細(xì)胞技術(shù)制備轉(zhuǎn)基因大鼠Fig.1 Scheme depicting the generation of transgenic rats from iPS cell lines
圖2 iPS細(xì)胞技術(shù)制備活體豬Fig.2 Scheme depicting the generation of viable pigs from iPS cell lines
在過(guò)去的10年內(nèi),iPS細(xì)胞技術(shù)得到了前所未有的發(fā)展與深入研究,在生命科學(xué)相關(guān)領(lǐng)域取得了許多重大突破。目前,多種動(dòng)物來(lái)源iPS細(xì)胞已制備成功,包括嚙齒類、靈長(zhǎng)類、有蹄類等動(dòng)物,這對(duì)于人類疾病的發(fā)生機(jī)理與治療、人類進(jìn)化研究等具有深遠(yuǎn)的意義。并且iPS細(xì)胞來(lái)源的小鼠、大鼠和豬也成功獲得,可以說(shuō)在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物育種上,iPS細(xì)胞技術(shù)具有潛在的應(yīng)用前景,很可能替代傳統(tǒng)的體細(xì)胞核移植,克服大動(dòng)物難以獲得胚胎干細(xì)胞系的難題;同時(shí)又合理規(guī)避了當(dāng)前在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究過(guò)程中存在的倫理學(xué)問(wèn)題,為轉(zhuǎn)基因研究開(kāi)創(chuàng)了更為廣闊的天地。但是該技術(shù)總體來(lái)說(shuō)仍處于起步階段,尚有許多問(wèn)題亟待解決,如何同時(shí)提高iPS細(xì)胞的安全性和制備效率,如何提高iPS細(xì)胞來(lái)源動(dòng)物的成功率和成活率等。隨著研究的不斷深入,這些問(wèn)題都會(huì)得到解決,并將進(jìn)一步促進(jìn)動(dòng)物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展。
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